Summary
Vi beskriver en procedure for profilering spytproteiner hjælp multiplexede mikrosfære-baserede antistof arrays. Monoklonale antistoffer blev kovalent bundet til fluorescerende farvestof-kodet 4,5 um polymermikrokugler hjælp carbodiimidkemi. De modificerede mikrosfærer blev deponeret i fiberoptiske microwells'ne måle protein niveauer i spyt ved hjælp af fluorescens sandwichimmunassays.
Abstract
Heri beskriver vi en protokol for samtidig måling seks proteiner i spyt ved hjælp af et fiberoptisk mikrosfære-baserede antistof array. Immuno-array-teknologi anvendes kombinerer fordelene ved mikrosfære-baseret suspension matrix fabrikation med anvendelse af fluorescensmikroskopi. Som beskrevet i videoen protokol blev kommercielt tilgængelige 4,5 um polymermikrokugler kodet i syv forskellige typer, differentieret ved koncentrationen af to fluorescerende farvestoffer fysisk fanget inde mikrosfærerne. De kodede mikrosfærer indeholdende overfladeaktive carboxylgrupper blev ændret med monoklonale fangantistoffer via EDC / NHS koblingskemi. For at samle protein microarray, de forskellige typer af kodede og funktionaliserede mikrosfærer blev blandet og tilfældigt deponeret i 4,5 um mikrobrønde, som blev kemisk ætset ved den proximale ende af et fiberoptisk bundt. Det fiberoptiske bundt blev anvendt som både bærer og til afbildning af microspheres. Når den er samlet, blev microarray bruges til at indfange proteiner i spyttet supernatanten opsamles fra klinikken. Påvisningen var baseret på en sandwich-immunassay under anvendelse af en blanding af biotinylerede antistoffer til diagnosticering af forskellige analytter med streptavidin-konjugeret fluorescerende probe, R-phycoerythrin. Microarray blev afbildet ved fluorescensmikroskopi i tre forskellige kanaler, to til mikrosfære registrering og én for assaysignalet. Fluorescens-mikrografer blev derefter afkodes og analyseret under anvendelse af et hjemmelavet algoritme i MATLAB.
Introduction
Siden den første microarray rapporteret af Mark Schena og kolleger i midten af 1990'erne, har denne kraftfulde værktøj er blevet brugt i mange områder af biologisk forskning 1. Antistof microarrays i stand til samtidigt at detektere multiple proteiner i diagnostiske fluider, såsom blod, har vigtige anvendelser i klinisk diagnostik og biomarkør screening 2-10. Spyt, som indeholder mange af de samme analytter såsom blod, er blevet betragtet som et foretrukket alternativ til blod, fordi spyt samling er sikker, ikke-invasiv og kan udføres ved minimalt uddannet medicinsk personale 11-13. I øjeblikket er multiplekset proteinanalyse ved hjælp af spytprøver begrænset af flere vigtige faktorer, herunder den lave koncentration af målanalyt 14 og bredt koncentrationsområde af forskellige biomarkører 15.
.Heri påviser vi, at analysen af seks proteiner: human vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), interferon gamma-inducerede protein 10 (IP-10), interleukin-8 (IL-8), epidermal vækstfaktor (EGF), matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) og interleukin-1 beta (IL-1β) . Udførelsen af metoden blev oprindeligt kontrolleres ved hjælp af standardløsninger, der udgør rekombinante analyt proteiner og blokerende buffer. Rigtige spytprøver indsamlet fra patienter med forskellige kroniske luftvejssygdomme samt raske kontrolpersoner blev også testet med tilfredsstillende præstation. Protokollen skal være gældende for andre protein analytter og andre mikrosfære-baserede analyser. Denne platform giver betydelige fordele for Analytisk Kemi banen, da det giver mulighed for hurtig, præcis og reproducerbar samtidig analyse af lave koncentrationer af flere proteiner med et bredt dynamikområde, minimale ikke-specifikke interaktioner, nedsat forbrug prøve, og lave omkostninger i forhold til en analog enzymmaerket Assay (ELISA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1. . Arbejdsgang for anvendelse fiberoptisk mikrosfære antistof array til spyt profilering (1) Mikrosfærer internt kodet med to fluorescerende farvestoffer, (2) de kodede mikrosfærer eksternt modificeret med protein-specifikke monoklonale antistoffer, (3) de multipleksede mikrosfærer blandes, og (4) tilfældigt deponeret i mikrobrønde ætset ved den proximale ende af et fiberoptisk bundt, (5) spytproteiner opfanges af mikrosfærer ved sandwich-immunoassay, og (6) kvantificeres ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
1.. Mikrosfærer Kodning
- Natrium europium (III) thenoyltrifluoroacetonate trihydrat (Eu-TTA, MW = 869,54 g / mol) i et ravfarvet hætteglas afvejes og forberede en 200 mM stamopløsning i tetrahydrofuran (THF). Bland forsigtigt ved pipettering; visuelt kontrollerefarvestoffet er helt opløst.
- Coumarin 30 (C30, MW = 347,41 g / mol) i et ravfarvet hætteglas afvejes og forberede en 12 mM stamopløsning i THF. Bland forsigtigt ved pipettering, visuelt kontrollere farvestoffet er helt opløst.
- Forbered 700 ul coboltarbejdsopløsning for hver microsphere type, ved hjælp af stamopløsninger og THF at nå slutkoncentration anført i tabel 1.
- Sikre mikrosfærer (10% w / v) er godt suspenderet ved hvirvelbehandling, og derefter overføre 60 pi suspension til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilføj 600 pi PBS til Mikrokuglesuspensionen og bland ved pipettering 20x. Centrifuger røret ved 10.000 rpm i 3 minutter og fjern forsigtigt supernatanten. Gentag denne proces en anden 2x at vaske mikrosfærerne.
- Vask mikrosfærepelleten 3x med THF ved en lignende fremgangsmåde som i punkt 1.5.
- Centrifuger mikrosfærens / THF suspension ved 10.000 rpm i 3 min, supernatanten fjernes, og re-suspendere pellet i 600 pibrugsopløsning anført i tabel 1. Overfør blandingen til en ny 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Forsegl mikrocentrifugerør med Parafilm og placere den på en shaker. Ryst ved 3.000 rpm og inkuberes i 24 timer, beskytte mod lys ved at dække opsætningen ved hjælp af en kasse dækket med alufolie.
- Centrifugér Mikrokuglesuspensionen ved 10.000 rpm i 3 minutter til dannelse af en pellet.
- Fjern supernatanten farveopløsning vaskes mikrosfærerne 6x med 600 pi methanol og derefter med 600 gl PBS indeholdende 0,01% Tween-20 anden 6x, som beskrevet i trin 1.5.
- Opbevar de kodede mikrosfærer i 600 pi PBS indeholdende 0,01% Tween-20 ved 4 ° C indtil anvendelse, beskytte mod lys.
| Mikrokugle typen navn: | 1 | 2 | 3 | 4. | 5. | 6 | 7 |
| Eu-TTA (mM) | 100 | 100 | 10 | 100 | 10 | ||
| C30 (mM) | 1 | 1 | 6 | 6 | 1 | 6 |
Tabel 1. Koncentrationerne af Eu-TTA og C30 arbejder løsninger.
2. Tilberedning af protein-capture mikrosfærer
- Forbered MES-puffer [2 - (N-morpholino) ethansulfonsyre (MES) 0,1 M, NaCl 0,9%, SDS 0,01%, pH 5,7], og PBS / SDS-puffer (natriumphosphat 0,01 M, NaCl 0,154 M, SDS 0,01%, pH 7,4) i forvejen ved stuetemperatur.
- Tilsæt 200 ul kodet microsphere suspension (indeholdende ~ 2 mg mikrosfærer) i en Safe-Lock 1,5 ml mikrocentrifugerør. Det er vigtigt at bruge denne type mikrocentrifugerør at undgå spild under inkubationen i trin 2.6. <li> vaskes mikrosfærerne med 600 pi MES buffer 3x som beskrevet i trin 1.5. Tilføj 700 pi MES til mikrosfærepellet og bland godt ved pipettering.
- Forbered 0,105 g / ml 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimid-hydrochlorid (EDC, MW = 191,7 g / mol) og 0,163 g / ml sulfo-N-hydroxysulfosuccinimid (sulfo-NHS, MW = 217,13 g / mol) løsninger i MES-buffer i separate rør.
- Tilføj 150 pi frisklavede EDC løsning dråbe for dråbe i Mikrokuglesuspensionen. EDC hydrolyserer meget hurtigt, så det er vigtigt at bruge frisklavet opløsning for at sikre immobilisering effektivitet. Umiddelbart efter tilsætningen af EDC, tilsættes 150 pi sulfo-NHS løsning på mikrokuglerne, bland godt ved pipettering og kontrollere suspensionen er homogen.
- Cap røret, forsegle det med Parafilm, og læg den på en shaker. Ryst ved 1.500 rpm i 4 timer, beskytte mod lys ved hjælp af en kasse dækket med alufolie.
- Centrifugere mikrosfærepræparater suspension ved 10.000 rpm i 3 minutter til dannelse af en pellet, og supernatanten fjernes. Vask mikrosfærerne med 500 ul PBS / SDS buffer 3x som beskrevet i trin 1.5.
- Tilsæt 200 ul PBS / SDS buffer til pillen, bland mikrokugleme godt og opløsningen overføres til 300 pi PBS / SDS-buffer indeholdende 60 ug capture-antistoffer. Det er vigtigt at suspendere mikrosfærepelleten først og derefter tilsæt mikrosfære suspensionen i antistofopløsningen.
- Inkubér antistof-mikrosfærer blanding ved at ryste ved 1.500 rpm i 4 timer på en shaker, beskytte mod lys ved hjælp af en kasse dækket med alufolie.
- Centrifugér Mikrokuglesuspensionen ved 10.000 rpm i 3 minutter til dannelse af en pellet og supernatanten fjernes. Vask mikrosfærerne med 500 pi StartingBlock (TBS) blokerende buffer 3x, som beskrevet i trin 1.5.
- Bland mikrokugler med 1 ml TBS blokerende buffer, og der inkuberes mikrosfærer ved 1.500 rpm i 1 time på en shaker, beskytte mod lys ved hjælp af en kasse bugtrød med alufolie.
- Centrifugér Mikrokuglesuspensionen ved 7.000 rpm i 3 minutter til dannelse af en pellet, og supernatanten fjernes. Vask pelleten 3x med 500 pi TBS blokerende buffer, som beskrevet i trin 1.5.
- Centrifuger mikrosfære opløsning ved 7.000 rpm i 3 minutter til dannelse af en pellet og supernatanten fjernes. Tilsæt 500 pi TBS blokerende buffer, og blandes ved pipettering.
- Opbevar den modificerede suspension af mikrokugler ved 4 ° C indtil anvendelse, beskytte mod lys.
- Gentag denne procedure for at gøre andre typer mikrokugler anvender tilsvarende antistoffer.
3. Fiberoptisk Microarray Assembly
- Bland 50 pi af hver type af protein capture-mikrosfærer i et nyt autoklaveret mikrocentrifugerør. Centrifuge bestanden mikrosfærer pool ved 7.000 rpm i 3 minutter, og supernatanten fjernes, således at den resterende mængde er ca 100 ul.
- Hånd-cut fiberoptiske bundter til cirka 5 cm i længden ogsekventielt polere begge ender på en polermaskine hjælp 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5 og 0,05 um-størrelse diamant lapning film. Sonikeres poleret bundt i deioniseret vand i 2 minutter for at fjerne eventuelle partikler.
- Sætte en lille magnetomrører i et 0,5 ml mikrocentrifugerør, tilsættes 400 pi af protein-fri PBS-buffer, og omrøres på en magnetomrører plade i 30 minutter for at fjerne luftbobler.
- Etch den ene ende af den polerede fiberbundt i en 0,025 N HCI-opløsning til 150 sek 10,16. Umiddelbart nedsænkes og sonikeres ætset ende i deioniseret vand i 1 min. Tør fiberbundter med trykluft.
- Monter fiberbundtet på en fiber holder og blokere ætset ende i bobler, Protein-fri PBS-buffer i 1 time.
- Deposit 1 pi alikvot af den lagrede suspension af mikrokugler på den ætsede ende af det fiberoptiske bundt. Beskyt opsætningen fra lys med en kasse med alufolie, og vent 15 minutter. Volumenet af suspensionen vilfalde ved inddampning og tvinge mikrosfærerne i de ætsede mikrobrønde. Gentag denne belastning trin endnu en gang.
- Brug en vatpind mættet med prøven for at fjerne mikrokugler, der ikke er fanget i mikrobrøndene. Proteinet microarray er nu klar til brug. Gå straks til trin 4.1 for spyt analyse.
4.. Spyt prøveanalyse Brug Mikrokugler Microarray
- Tilsæt 200 ul prøveopløsning (100 ul spyt supernatant fortyndet med samme rumfang StartingBlock T20 (PBS) blokerende buffer. Indsamlingen protokol for spyt supernatant er blevet offentliggjort tidligere 10). i en 0,5 ml autoklaveret mikrocentrifugerør. Dyp protein microarray indlæst på fiber i løsningen og inkuber på ryster ved 600 rpm i 2 timer, beskytte mod lys ved hjælp af en kasse dækket med alufolie.
- Forbered 20 ml vaskepuffer ved tilsætning af 200 pi 10% BSA-opløsning og 200 pi 10% Tween-20 i 19,6 ml PBS mix godt ved forsigtigt at ryste.
- Dyp protein microarray til et nyt autoklaveret mikrocentrifugerør indeholdende 200 pi vaskepuffer og rystes ved 600 rpm i 2 min. Gentag denne vask 3x.
- Inkuber microarray 100 pi opløsning af et detektionsantistof cocktail indeholdende 5 ug / ml anti-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, IL-1β biotinylerede detektionsantistoffer i StartingBlock T20 (PBS) blokeringspuffer i 30 minutter ved stuetemperatur på et rysteapparat ved 600 rpm, beskytte mod lys ved hjælp af en kasse dækket med aluminiumsfolie.
- Vask microarray 3x med vaskebuffer som beskrevet i trin 4.3.
- Inkubér microarray i 200 pi 20 mg / ml streptavidin R-phycoerythrin konjugat (SAPE) i PBS ved 600 rpm på shaker i 10 minutter, beskytte mod lys ved hjælp af en kasse dækket med alufolie.
- Vask microarray 5x med vaskebuffer som beskrevet i trin 4.3.
- Rens den distale ende af fiberen (dvs. enden vækfra mikrosfærerne) bundle med en vatpind mættet med absolut ethanol.
- Tør begge ender af fiberen med trykluft. Monter fiber på et epifluorescensmikroskop og billede gennem den distale ende af fiberen.
- Anskaf mikrosfærepræparater billeder svarende til Eu-TTA, C30, og SAPE fluorescensemission intensiteter. Optiske filtre setup og eksponeringstider til fluorescens billeddannelse af Eu-TTA, C30, og SAPE er afbildet i tabel 2..
| Channel | Eu-TTA | C30 | SAPE |
| Exciter | 365/10x | 350/50x | 546/10x |
| Beamsplitter | 525DCLP | 400DCLP | 560LP |
| Emitter | 620/60m | 460/50m | 580/30m |
| Eksponeringstid | 1 sek | 0,3 sek | 1 sek |
Tabel 2. Parametre for de tre fluorescerende billeder af microarray.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescens billeder fra tre kanaler, der viser en lille del af det fiberoptiske bundt er vist i figur 2A-C. Disse billeder blev analyseret under anvendelse af en algoritme, som er skrevet i Matlab (som beskrevet mere detaljeret i diskussionen afsnit). Analysen beskæftiger både information fra EU-TTA kodning billede (figur 2A) og C30 kodning billedet (Figur 2B) til at afkode mikrokugler, og fluorescensintensiteterne forskellige mikrokugler i signalet billedet (Figur 2C) blev beregnet. Med kalibreringskurver opnået fra korrelerede proteinstandarder blev koncentrationen af proteiner i spytprøver beregnet.
Figur 2. (A) Eu-TTA kodning billede, (B) C30 kodning billede, (C) SAPE signal billede, (D) dekodning resultats overlappet på signalet billedet, forskellige typer af mikrokugler blev mærket med forskellige farver og former.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskerne bør være ekstra opmærksom på de følgende trin: for bedre afkodning nøjagtighed, er det nødvendigt at kontrollere de mikrosfærer blev homogent suspenderet i al inkubation og vask skridt i løbet af mikrosfærer kodning procedure. Desuden skal beskyttes mod lys i hele eksperimentet kodede mikrosfærer. Efter korrekt kodning og opbevaring procedurer, fandt vi, at den samlede dekodning nøjagtighed var over 99%. De kodede mikrosfærer skal opbevares ved 4 ° C. Undgå nedfrysning og beskytte mod lys. Under egnede opbevaringsforhold, de kodede mikrokugler er stabile i mere end seks måneder. Ekstrem omhu er nødvendig under kodning og ændring skridt til at reducere tabet af mikrosfærer. For eksempel ikke forstyrrer mikrosfærepellet når du fjerner supernatant. Desuden, herunder Tween-20 og SDS i bufferne er vigtigt for en bedre mikrosfære pelletering.
Nogle of de procedurer, fælles fejlfinding er: (1) Brug kun frisk tilberedt EDC løsning og EDC opløsning bør tilsættes dråbevis, (2) bør anvendes autoklaveres rør og microsphere opløsning skal overføres til et nyt rør før hver inkubation ( 3) i hvert vasketrin, forsøge at fjerne supernatanten så meget som muligt, (4) de modificerede mikrosfærer skal opbevares ved 4 ° C, undgå frysning og beskytte mod lys. Under passende opbevaringsbetingelser, kan de modificerede mikrosfærer opbevares i mere end 3 måneder uden tab af detekterbart signal.
MATLAB algoritmen bruges til at analysere fluorescens billeder er kort beskrevet nedenfor. Den relevante kode kan findes i supplerende materiale. Pixels inden for en brugerdefineret intensitet interval for Eu-TTA billede filtreres først. Forskellige områder blev kontrolleret med en størrelse-filter, områder, der indeholder et "hul" center forårsaget af lyssvækkelse blev fjernet, og områder, hvormikrosfærer er til stede blev sorteret i et ur liste for fremtidig behandling. Alle mikrosfærer fra observationslisten blev yderligere filtreres med reaktioner i den tilsvarende C30 billedet. Signalerne for alle pixels i en bestemt mikrosfære et gennemsnit. Signalstyrke denne mikrosfære af interesse blev beregnet som gennemsnittet af intensiteten af alle mikrosfærer på overvågningsliste. At gøre resultaterne statistisk mere repræsentativt, blev mindst 25 mikrokugler af hver type, der kræves. For at minimere den ikke-specifikke signal og formindske variation mellem forskellige forsøg blev signalerne for alle mikrokugle typer normaliseret ved at subtrahere signalet fra kontrolmikrosfærer.
Signalet reaktion af mikrosfærerne kan justeres ved mængden af antistoffer immobiliseret på overfladen af mikrosfærer, som er ideel til multiplex påvisning af proteiner med et bredt sortiment af koncentrationer. Baseret på forskellige diametre af mikrosfærer, tHan mængde antistof kræves for at danne et monolag på mikrosfærer kan estimeres efter ligningen fra producenten 17.. For mikrosfærer med en diameter på 4,5 um, 3 ug antistof nødvendige pr 1 mg af mikrosfærer. Vi har testet forskellige antistof beløb i koblingen opløsning i trin 2.8 fra 3 ug (0,5 X) til 60 ug (10x) af antistof. Øgede signaler blev observeret, når mere antistof blev anvendt i opløsningen. Optimale antistof beløb for forskellige antistoffer og applikationer skal eksperimentelt bestemmes. "Control mikrosfærer" blev kombineret med musen isotype IgG-antistof, der er leveret af producenten som negativ kontrol i direkte ELISA og har vist ingen krydsreaktivitet med op til 40 rekombinante humane proteiner 18. For at vurdere reproducerbarheden af koblingen fremgangsmåde blev to portioner af MMP-9 mikrokugler koblet på forskellige dage. Udførelsen af mikrosfærerne blev testet ved hjælp af multiplexed påvisning af 10 ng / ml MMP-9. Resultaterne viste ingen signifikante forskelle mellem forskellige batches af mikrokugler (detaljerede resultater er vist i tabel 3).
| Nej | Dato | Test 1 | Test 2 | Test 3 | Gennemsnitlig | Std |
| 1 | 01-12-2011 | 773,8 | 690,1 | 756,8 | 740,2 | 44.2 |
| 2 | 01/26/2011 | 791,9 | 721,8 | 867,0 | 793,6 | 72,6 |
Tabel 3. Reproducerbarhed af koblingsmetoder (resultater er vist i arbitrære enheder).
Multiplex metode præsenteres her giver mulighed for hurtig, nøjagtig og reproducerbaranalyse af forskellige proteiner over et bredt koncentrationsområde (resultater er anført i tabel 4). Den potentielle krydsreaktivitet for de seks antistof par vi anvendt i denne undersøgelse blev også testet. Alle signaler fra krydsreaktivitet blev fundet at være ubetydelig (mindre end 3%). Andre fordele ved denne fremgangsmåde i forhold til en konventionel enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA), omfatter et bredt dynamikområde, minimale ikke-specifikke interaktioner, et reduceret prøve og lave omkostninger 10. Den nødvendige mængde spytprøve er så lav som 100 ul, og assayet kan afsluttes inden for 3,5 timer. Sammenlignet med andre suspension arrays, en begrænsning af denne fremgangsmåde er, at når microarray blev samlet, behov påvisning kan startes i mindre end 15 min. Den her beskrevne metode er blevet anvendt i vores laboratorium til at analysere human spyt prøver fra patienter med inflammatoriske sygdomme og raske kontroller (upublicerede data). Metoden bør gældefor protein analyse af andre komplekse væske prøver. En lignende microsphere-baserede protein array kan bruges på andre platforme såsom mikrofluidenheder. Kodningen og immobiliserede metoder kan også anvendes til mikrosfærer fremstillet med andre materialer 9.
| VEGF | IP-10 | IL-8 | EGF | MMP-9 | IL-1β | |
| Test 1 | 5365,9 | 2578,4 | 6508,7 | 2584,0 | 515,5 | 1147,4 |
| Test 2 | 5787,8 | 2577,9 | 7238,9 | 2919,2 | 375,7 | 1099,2 |
| Test 3 | 4944,6 | 2883,3 | 6726,3 | 3619,3 | 406,8 | 1084,1 |
| Gennemsnitlig | 5366,1 | 2679,9 | 6824,6 | 3040,8 | 432,7 | 1110,2 |
| Std. Dev | 421,6 | 176,2 | 374,9 | 528,3 | 73,4 | 33.1 |
Tabel 4. Resultaterne for de tre uafhængige tests på samme spytprøve (resultater vist i arbitrære enheder).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (Grant 08UDE017788-05). EBP anerkender også støtte fra den spanske Foundation for Videnskab og Teknologi (FECYT). Forfatterne takker Shonda T. Gaylord og Pratyusha Mogalisetti for kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. Protein Microarray. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, te, Prakken, H., Kuis, B. J., W,, Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R.
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R.
- Schena, M. Protein Microarrays. , Jones and Bartlett Publishers. (2005).
- Mouse IgG1 Isotype Control [Internet]. , Available from: http://www.rndsystems.com/Products/MAB002 (2013).
