Summary
Vi beskriver en fremgangsmåte for profilering av spyttproteiner ved bruk av multipleksede mikrosfære-baserte antistoff-matriser. Monoklonale antistoffer ble kovalent bundet til fluorescerende fargestoff-kodede 4,5 um og polymer-mikrosfærer ved bruk av karbodiimid-kjemi. De modifiserte mikrokuler ble avsatt i fiberoptiske mikrobrønner for å måle proteinnivåer i spytt ved hjelp av fluorescens sandwich-immunoanalyser.
Abstract
Heri beskrives en protokoll for samtidig måling av seks proteiner i spytt ved hjelp av en fiberoptisk mikrosfære-baserte antistoff-matrisen. Den immuno-array-teknologi anvendes kombinerer fordelene med mikrokulebaserte suspensjonen matrise fabrikasjon med bruk av fluorescens-mikroskopi. Som beskrevet i video-protokollen, ble kommersielt tilgjengelig 4,5 um og polymer-mikrokuler som er kodet inn i syv forskjellige typer, differensiert av konsentrasjonen av to fluorescerende fargestoffer som er fysisk innesperret i mikrokulene. De kodede mikrokuler inneholdende overflate karboksylgrupper ble modifisert med monoklonale antistoffer fangst gjennom EDC / NHS koblingskjemi. For å montere protein microarray, de forskjellige typer av kodede og funksjonmikrokuler ble blandet og tilfeldig avsatt på 4,5 mikrometer mikrobrønner, som ble kjemisk etset ved den proksimale enden av en fiberoptisk bunt. Den fiberoptiske bunt er benyttet både som bærer og for å avbilde microspheres. Når satt sammen, ble den mikroarray som brukes til å fange proteinene i spyttet supernatanten samlet fra klinikken. Påvisningen er basert på en sandwich-immunoanalyse ved bruk av en blanding av biotinylert deteksjon-antistoffer for forskjellige analytter med et streptavidin-konjugerte fluorescerende probe, R-phycoerythrin. Den mikroarray ble fotografert ved fluorescensmikroskopi i tre forskjellige kanaler, to for mikrosfære-registrering og en for analysesignal. Fluorescens mikrografer ble så dekodet og analysert ved hjelp av en hjemmelaget algoritmen i Matlab.
Introduction
Siden den første microarray rapportert av Mark Schena og kollegaer på midten av 1990-tallet, har dette kraftige verktøyet blitt benyttet i mange felt av biologisk forskning en. Antistoff mikromatriser som er i stand til samtidig å detektere flere proteiner i diagnostiske fluider, slik som blod, har viktige anvendelser innen klinisk diagnostikk og biomarkør screening 2-10. Spytt, som inneholder mange av de samme analytter som blod, har vært betraktet som en foretrukket alternativ til blod, fordi spytt samlingen er trygt, ikke-invasiv, og kan utføres ved å minimal-trenet medisinsk personell 11-13. For tiden er multiplekset proteinanalyse ved hjelp av spyttprøver begrenset av flere viktige faktorer, blant annet den lave konsentrasjon av målanalytt 14 og det brede konsentrasjonsområdet forskjellige biomarkører 15.
.Heri viser vi analyse av seks proteiner: human vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), interferon gamma-indusert protein 10 (IP-10), interleukin-8 (IL-8), epidermal vekstfaktor (EGF), matrisen metallopeptidase 9 (MMP-9) og interleukin-1 beta-(IL-1β) . Utførelsen av metoden ble først bekreftet ved hjelp av standardløsninger som utgjør rekombinante analyse proteiner og blokkering buffer. Ekte spyttprøver tatt fra pasienter med ulike kroniske luftveissykdommer, samt friske kontroller ble også testet med tilfredsstillende ytelse. Protokollen skal være gjeldende for andre protein analytter og andre mikrosfære-baserte analyser. Denne plattformen gir betydelige fordeler til Analytical Chemistry feltet som det muliggjør rask, nøyaktig og reproduserbar simultan analyse av lave konsentrasjoner av flere proteiner med et bredt dynamisk område, minimalt med uspesifikke interaksjoner, redusert prøven forbruk, og lav pris i forhold til en analogt Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1. . Arbeidsflyt for påføring av fiberoptisk mikrosfære-antistoff array til spytt profilering (1) Mikrosfærer er internt kodet med to fluorescerende fargestoffer, (2) de kodede mikrokuler er eksternt modifisert med proteinspesifikke monoklonale antistoffer, (3) de multipleksede mikrokuler er blandet, og (4) tilfeldig avsatt i mikrobrønner etset ved den proksimale enden av en fiberoptisk bunt, (5) spyttproteiner fanges opp av mikrokuler ved sandwich-immunoassay, og (6) kvantifisert ved hjelp av fluorescens-mikroskopi.
En. Sfærer Encoding
- Vei natrium europium (III) thenoyltrifluoroacetonate trihydrat (Eu-TTA, MW = 869,54 g / mol) i et gult hetteglass og forbered en 200 mM stamløsning i tetrahydrofuran (THF). Bland forsiktig ved pipettering; visuelt verifiserefargestoffet er helt oppløst.
- Vei kumarin 30 (C30, MW = 347,41 g / mol) i et gult hetteglass og forberede en 12 mM stamløsning i THF. Bland forsiktig ved pipettering; visuelt verifisere fargestoff er helt oppløst.
- Forbered 700 mL av arbeidsløsning for hver mikrotype med lager løsninger og THF å nå endelig konsentrasjon oppført i tabell 1.
- Sikre mikrokuler (10% w / v) blir godt suspendert ved omrøring, og deretter overføre 60 ul suspensjon til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Legg 600 mL PBS til microsphere suspensjon og bland ved å pipettere 20x. Sentrifuger røret ved 10.000 rpm i 3 min og fjern supernatanten. Gjenta denne fremgangs annen 2x for å vaske mikrosfærene.
- Vask mikrosfære pellet 3x med THF ved hjelp av en lignende fremgangsmåte som i trinn 1.5.
- Sentrifuger mikro / THF-suspensjon ved 10 000 rpm i 3 minutter, fjern supernatanten, og re-suspendere pelleten i 600 mLarbeidsoppløsning som er oppført i tabell 1. Overfør blandingen til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Forsegle mikrosentrifuge tube med Parafilm og plassere den på en shaker. Rist på 3000 rpm og inkuberes i 24 timer, beskytte mot lys ved å dekke oppsett ved hjelp av en boks dekket med aluminiumsfolie.
- Sentrifuger på mikrosfære suspensjonen ved 10 000 rpm i 3 minutter til å danne en pellet.
- Fjern supernatanten fargestoff oppløsningen, vaske mikrosfærene 6x med 600 mL metanol og deretter med 600 pl PBS inneholdende 0,01% Tween-20 en annen 6x, som beskrevet i trinn 1.5.
- Oppbevar de kodede sfærer i 600 mL PBS som inneholder 0,01% Tween-20 ved 4 ° C inntil bruk, beskytte mot lys.
| Microsphere typenavn: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Eu-TTA (mm) | 100 | 100 | 10 | 100 | 10 | ||
| C30 (MM) | 1 | 1 | 6 | 6 | 1 | 6 |
Tabell 1. Konsentrasjoner av Eu-TTA og C30 arbeidsløsninger.
2. Utarbeidelse av Protein-fangst microspheres
- Forbered MES buffer [2 - (N-morfolino) etansulfonsyre (MES) 0,1 M, NaCl 0,9%, 0,01% SDS, pH 5,7] og PBS / SDS-buffer (0,01 M natriumfosfat, 0,154 M NaCl, 0,01% SDS, pH 7.4) på forhånd ved romtemperatur.
- Legg 200 mL kodet microsphere suspensjon (inneholder ~ 2 mg sfærer) inn i en Safe-Lock 1,5 ml mikrosentrifuge tube. Det er viktig å bruke denne type mikrosentrifugerør å unngå lekkasje under inkuberingen i trinn 2.6. <li> vaske mikrosfærene med 600 pl MES-buffer 3x som beskrevet i trinn 1.5. Legg 700 mL MES til mikro pellet og bland godt med pipettering.
- Forbered 0,105 g / ml 1-etyl-3-[3-dimetylamino-propyl]-karbodiimid-hydroklorid (EDC, MW = 191,7 g / mol) og 0,163 g / ml sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS, MW = 217,13 g / mol) løsninger i MES buffer i separate rør.
- Legg 150 mL nylagde EDC løsning dråpe for dråpe inn i mikrosfære suspensjon. EDC hydrolyzes svært raskt, og dermed er det viktig å bruke ferske løsning for å sikre immobilisering effektivitet. Umiddelbart etter tilsetningen av EDC, tilsett 150 pl sulfo-NHS-løsning til mikrokulene, bland godt ved pipettering, og verifisere at suspensjonen er homogen.
- Sett lokk på røret, forsegle den med Parafilm, og plassere den på en shaker. Rist på 1500 rpm for 4 timer, beskytte mot lys ved hjelp av en boks dekket med aluminiumsfolie.
- Sentrifuger mikrosfære armerion ved 10.000 rpm i 3 minutter til å danne en pellet, og fjern supernatanten. Vask de mikrosfærer med 500 pl PBS / SDS-buffer 3x som beskrevet i trinn 1.5.
- Tilsett 200 ul PBS / SDS-buffer til pelleten, blande mikrokulene godt og overføre oppløsningen til 300 ul PBS / SDS-buffer inneholdende 60 ug fangst-antistoffer. Det er viktig å suspendere mikrosfære pellet først og deretter legge til mikrosfære-suspensjonen i antistoffløsningen.
- Inkuber antistoff-mikrokuler blandingen ved rysting ved 1500 rpm i 4 timer på et riste, beskyttes mot lys ved hjelp av en boks som er dekket med aluminiumsfolie.
- Sentrifuger på mikrosfære suspensjonen ved 10 000 rpm i 3 minutter til å danne en pellet, og fjern supernatanten. Vask de mikrosfærer med 500 mL StartingBlock (TBS) blokkerende buffer 3x, som beskrevet i trinn 1.5.
- Bland-mikrosfærer med 1 ml TBS blokkerende buffer og inkuberes mikrosfærer ved 1500 opm i 1 time på en shaker, beskyttes mot lys ved hjelp av en boks buktrød med aluminiumsfolie.
- Sentrifuger på mikrosfære suspensjonen ved 7000 opm i 3 minutter for å danne en pellet, og fjern supernatanten. Vask pelleten 3x med 500 pl TBS blokkerende buffer, som beskrevet i trinn 1.5.
- Sentrifuger mikro oppløsningen ved 7000 opm i 3 minutter for å danne en pellet, og fjern supernatanten. Legg 500 mL TBS blokkering buffer og bland ved pipettering.
- Oppbevar den modifiserte mikrosfære suspensjon ved 4 ° C inntil bruk, beskytte mot lys.
- Gjenta denne fremgangsmåten for å lage andre typer av mikrosfærer ved bruk av tilsvarende antistoffer.
Tre. Fiberoptisk microarray Assembly
- Bland 50 ul av hver type av protein-fange mikrokuler inn i en ny autoklavert mikrosentrifugerør. Sentrifuger aksjesfærer basseng på 7000 rpm i 3 min, og fjern supernatanten, slik at de resterende volum er ca 100 mL.
- Hånd-cut fiberoptisk bunter til ca 5 cm i lengde ogsekvensielt polere begge ender på en poleringsmaskin ved hjelp av 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5, og 0,05 mikrometer-sized diamant lapping filmer. Sonicate den polerte bunten i avionisert vann i 2 min for å fjerne partikler.
- Sett en liten magnetisk rørestav inn i et 0,5 ml mikrosentrifugerør, tilsett 400 pl av protein-fri PBS-buffer og rør på en magnetisk røreplate i 30 minutter for å fjerne luftbobler.
- Etse en ende av den polerte fiberbunt i en 0,025 N HCl-løsning til 150 sek 10,16. Umiddelbart under vann og sonicate etset ende i avionisert vann i 1 min. Tørk de fiberbunter med trykkluft.
- Monter fiberbunten på en fiberholderen, og blokkere etset ende i boblefri, protein-fri PBS buffer i 1 time.
- Innskudd 1 pl aliquot av den lagrede mikrosfære suspensjonen på den etsede enden av den fiberoptiske bunt. Beskytt oppsettet mot lys med en boks med aluminiumsfolie, og vent i 15 min. Volumet av suspensjonen skalreduseres ved fordampning og tvinge mikrokulene inn i de etsede mikrobrønner. Gjenta dette lastingstrinnet en gang til.
- Bruk en vattpinne mettet med prøveoppløsning for å fjerne mikrokuler som ikke er fanget i mikrobrønner. Proteinet microarray er nå klar til bruk. Gå straks til trinn 4.1 for spytt analyse.
4. Spytt Sample Analysis Bruke microspheres microarray
- Tilsett 200 ul prøve-løsning (100 pl spytt supernatant fortynnet med likt volum StartingBlock T20 (PBS) blokkerende buffer. Samlingen protokoll for spytt supernatant er blitt publisert tidligere 10). inn i en 0,5 ml autoklaveres mikrosentrifuge tube. Dypp protein microarray lastet på fiberen inn i oppløsningen og inkuberes på rister ved 600 rpm i 2 timer, beskyttes mot lys ved hjelp av en boks som er dekket med aluminiumsfolie.
- Forbered 20 ml vaskebuffer ved å legge til 200 mL 10% BSA løsning og 200 mL 10% Tween-20 til 19,6 ml PBS, mix godt ved forsiktig risting.
- Dypp protein microarray i en ny autoklavert mikrosentrifugerør inneholdende 200 ul vaskebuffer og riste ved 600 opm i 2 min. Gjenta denne vaske 3x.
- Inkuber microarray i 100 pl oppløsning av et deteksjonsantistoff cocktail inneholdende 5 ug / ml av anti-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, IL-1β biotinylerte deteksjon-antistoffer i StartingBlock T20 (PBS) blokkerende buffer i 30 minutter ved romtemperatur på rystemaskin ved 600 opm, beskyttes mot lys ved hjelp av en boks som er dekket med aluminiumsfolie.
- Vask microarray 3x med vaskebuffer som beskrevet i trinn 4.3.
- Inkuber microarray i 200 pl av 20 pg / ml streptavidin R-phycoerythrin-konjugat (SAPE)-løsning i PBS ved 600 rpm på en ristemaskin i 10 min, beskyttes mot lys ved hjelp av en boks som er dekket med aluminiumsfolie.
- Vask microarray 5x med vaskebuffer som beskrevet i trinn 4.3.
- Rens den distale enden av fiberen (dvs. enden vekkfra sfærer) bunt med en bomullspinne mettet med absolutt etanol.
- Tørk begge ender av fiber med trykkluft. Monter fiber på en epifluorescent mikroskop og bilde gjennom den distale enden av fiberen.
- Acquire mikrosfære bilder tilsvarende Eu-TTA, C30, og SAPE fluorescens utslippsintensitet. Optiske filtre oppsett og eksponeringstider for fluorescens avbildning av Eu-TTA, C30, og SAPE er avbildet i tabell 2.
| Channel | Eu-TTA | C30 | SAPE |
| Exciter | 365/10x | 350/50x | 546/10x |
| Beamsplitter | 525DCLP | 400DCLP | 560LP |
| Emitter | 620/60m | 460/50m | 580/30m |
| Eksponeringstid | 1 sek | 0,3 sek | 1 sek |
Tabell 2. Parametere for de tre fluoriserende bilder av microarray.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescens-bilder fra tre kanaler som viser en liten del av den fiberoptiske bunt er vist i figurene 2A-C. Disse bildene ble analysert ved hjelp av en algoritme som er skrevet i MATLAB (som beskrevet i mer detalj i den diskusjon avsnitt). Analysen anvender begge informasjon fra Eu-TTA koding bilde (figur 2A), og C30-koding bilde (figur 2B) for å dekode mikrokulene, og de fluorescensintensiteter i forskjellige mikrosfærer i signalbilde (Fig. 2C) ble beregnet. Med kalibreringskurvene oppnådd fra korrelerte proteinstandarder, ble konsentrasjonen av proteiner i spyttprøver beregnes.
Figur 2. (A) Eu-TTA koding bilde, (B) C30 koding bilde, (C) SAPE signalbilde, (D) dekodingsresultats overlappes på signalbilde, forskjellige typer av mikrokuler ble merket med forskjellige farger og former.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskere bør betale ekstra oppmerksomhet til følgende trinn: for bedre dekoding nøyaktighet, er det nødvendig å verifisere sfærer ble homogent suspendert i alt inkubasjon og vaske trinn under sfærer koding prosedyren. I tillegg er de kodede mikrokuler må beskyttes mot lys gjennom hele eksperimentet. Etter riktig koding og lagring prosedyrer, fant vi at den samlede dekoding nøyaktighet var over 99%. De kodede sfærer bør lagres ved 4 ° C. Unngå frost og beskytte mot lys. Under riktige lagringsforhold, de kodede sfærer er stabile i mer enn seks måneder. Ekstrem forsiktighet er nødvendig i løpet av de kodende og modifiseringsfremgangsmåten for å redusere tap av mikrokuler. For eksempel, ikke forstyrre mikrosfære pellet ved fjerning av supernatanten. I tillegg inkluderer Tween-20 og SDS i bufferne er viktig for bedre mikrosfære pelletering.
Noen of de vanlige feilsøking er: (1) bruke bare tilberedes EDC-oppløsning og EDC-oppløsning skal tilsatt dråpevis, (2) autoklaveres rør skal brukes, og den mikrosfære oppløsningen skal bli overført til et nytt rør før hver inkubasjonstrinnet, ( 3) under hvert vasketrinn, prøve å fjerne supernatanten så mye som mulig, (4) de modifiserte mikrokuler bør lagres ved 4 ° C, unngår frysing og beskyttes mot lys. under riktige lagringsbetingelser, kan de modifiserte mikrokuler lagres i mer enn 3 måneder uten noen påviselig signal tap.
Matlab algoritmen som brukes til å analysere fluorescens bildene er kort beskrevet nedenfor. Den relevante kode er å finne i supplerende materialer. Piksler innenfor en brukerdefinert intensiteten for EU-TTA image filtreres først. Ulike områder ble kontrollert med en størrelse-filter, områder som inneholder en "hul" center forårsaket av lys demping ble fjernet og områder hvorsfærer er til stede ble sortert i en observasjonsliste for fremtidig behandling. Alle sfærer fra klokken listen ble ytterligere filtrert med responser i den tilsvarende C30 bildet. Signalene for alle pikslene i et bestemt mikrosfære ble midlet. Styrken av denne mikrosfære av interesse signal ble beregnet ved å ta gjennomsnittet av intensitetene av alle mikrokulene i klokken listen. For at resultatet statistisk mer representative, ble et minimum av 25 mikrokuler av hver type nødvendig. For å minimere den ikke-spesifikke signal og redusere variasjon mellom forskjellige eksperimenter, ble signalene for alle typer mikrosfære normalisert ved å subtrahere signalet fra styremikrosfærer.
Signalet respons på mikrokulene kan justeres ved mengden av antistoff immobilisert på overflaten av mikrokulene, som er ideelt for multipleksede påvisning av proteinene med store områder av konsentrasjoner. Basert på forskjellige diametre av de mikrokuler, tHan mengden av antistoff nødvendig for å danne et monosjikt av mikrokulene kan anslås ved ligningen fra produsent 17.. For mikrokuler med en diameter på 4,5 mikrometer, 3 pg av antistoff som er nødvendig per 1 mg av mikrokulene. Vi har testet forskjellige antistoffmengder i koblingsløsningen i trinn 2.8 fra 3 ug (0,5 x) til 60 mikrogram (10 x) av antistoff. Økte signaler ble observert når mer antistoff ble brukt i oppløsningen. Optimale antistoff beløp for ulike antistoffer og søknader må eksperimentelt bestemt. De "kontrollsfærer" ble kombinert med musen isotype IgG antistoff, som er levert av produsenten som negativ kontroll i direkte ELISA og har vist ingen kryssreaksjon med opptil 40 rekombinante humane proteiner 18. For å vurdere reproduserbarheten av koblingsmetoden ble to grupper av MMP-9-mikrokuler kombinert på forskjellige dager. Utførelsen av mikrokulene ble testet ved hjelp av multiplexed deteksjon av 10 ng / ml MMP-9. Resultatene viste ingen signifikante forskjeller mellom forskjellige satser av mikrosfærer (detaljerte resultater er vist i tabell 3).
| Nei | Dato | Test 1 | Test 2 | Test 3 | Gjennomsnittlig | Std |
| 1 | 01.12.2011 | 773,8 | 690,1 | 756,8 | 740,2 | 44,2 |
| 2 | 01/26/2011 | 791.9 | 721,8 | 867,0 | 793,6 | 72.6 |
Tabell 3. Reproduserbarhet av koblingsmetoder (resultatene er vist i vilkårlige enheter).
Den multiplex Metoden som presenteres her gir rask, nøyaktig og reproduserbarAnalysen av forskjellige proteiner over et bredt konsentrasjonsområde (resultater er oppført i tabell 4). Den potensielle kryss-reaktivitet for de seks antistoff parene vi benyttet i denne studie ble også testet. Alle signaler fra kryss-reaktivitet ble funnet å være ubetydelig (mindre enn 3%). Andre fordeler ved denne fremgangsmåte, sammenlignet med en konvensjonell Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), inkluderer et bredt dynamisk område, minimale ikke-spesifikke interaksjoner, reduserte prøven forbruk og lave kostnader 10.. Det nødvendige volum av spyttprøve er så lav som 100 pl, og analysen kan gjennomføres i løpet av 3,5 timer. Sammenlignet med andre suspensjon matriser, er en begrensning av denne tilnærmingen at når microarray ble montert, trenger påvisning skal kunne startes i mindre enn 15 min. Metoden som beskrives her er blitt brukt i vårt laboratorium for å analysere human spyttprøver tatt fra pasienter med betennelsessykdommer og friske kontroller (upubliserte data). Metoden bør være aktueltfor proteinanalyse av andre komplekse fluidprøver. En lignende microsphere basert protein matrise kan brukes på andre plattformer som microfluidic enheter. Kodingen og immobiliserte metoder kan også anvendes på mikrosfærer laget med andre materialer ni.
| VEGF | IP-10 | IL-8 | EGF | MMP-9 | IL-1β | |
| Test 1 | 5365,9 | 2578,4 | 6508,7 | 2584,0 | 515,5 | 1147,4 |
| Test 2 | 5787,8 | 2577,9 | 7238,9 | 2919,2 | 375,7 | 1099,2 |
| Test 3 | 4944,6 | 2883,3 | 6726,3 | 3619,3 | 406.8 | 1084,1 |
| Gjennomsnittlig | 5366,1 | 2679,9 | 6824,6 | 3040,8 | 432,7 | 1110,2 |
| Std. Dev | 421,6 | 176.2 | 374.9 | 528,3 | 73.4 | 33.1 |
Tabell 4. Resultater for de tre uavhengige tester på samme spyttprøve (resultater vist i vilkårlige enheter).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (tilskudds 08UDE017788-05). EBP erkjenner også støtte fra den spanske Foundation for Science and Technology (FECYT). Forfatterne takker Shonda T. Gaylord og Pratyusha Mogalisetti for kritisk lesing av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. Protein Microarray. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, te, Prakken, H., Kuis, B. J., W,, Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R.
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R.
- Schena, M. Protein Microarrays. , Jones and Bartlett Publishers. (2005).
- Mouse IgG1 Isotype Control [Internet]. , Available from: http://www.rndsystems.com/Products/MAB002 (2013).
