Summary
Wir beschreiben ein Verfahren zum Profilieren von Speichelproteinen mit gemultiplexten Basis von Mikroarrays Antikörper. Monoklonale Antikörper wurden kovalent an Fluoreszenzfarbstoff-codierten 4,5 &mgr; m-Mikrokugeln unter Verwendung von Carbodiimid-Chemie gebunden. Die modifizierten Mikrosphären wurden in faseroptischen Mikrovertiefungen abgeschieden, um Protein-Spiegel im Speichel mittels Fluoreszenz-Sandwich-Immunoassays zu messen.
Abstract
Hier beschreiben wir ein Protokoll zum gleichzeitigen Messen von sechs Proteine im Speichel unter Verwendung einer faseroptischen Mikrokügelchen basierende Antikörperarray. Die Immuno-Array-Technologie eingesetzt verbindet die Vorteile der Mikrokugel-Suspension auf Basis der Arrayherstellung unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Wie in der Video-Protokoll beschrieben, wurden im Handel erhältliche 4,5 um Polymermikrokugeln in sieben verschiedenen Typen, durch die Konzentration der beiden Fluoreszenzfarbstoffe physikalisch innerhalb der Mikrokügelchen eingeschlossen differenziert codiert. Die codierten Mikrosphären, die Oberfläche Carboxyl-Gruppen wurden mit monoklonalen Fänger-Antikörper über EDC / NHS-Kopplungschemie modifiziert. Um das Protein-Mikroarray zusammenzubauen, wurden die unterschiedlichen Typen von kodierten und funktionalisierten Mikrokugeln gemischt und zufällig in 4,5 um Vertiefungen, die an dem proximalen Ende eines faseroptischen Bündels chemisch geätzt wurden abgeschieden. Die Glasfaserbündel wurde sowohl als Träger und für die Abbildung der m verwendeticrospheres. Nach der Montage wurde die Microarray verwendet, um Proteine im Speichel Überstand aus der Klinik gesammelt zu erfassen. Der Nachweis erfolgte auf einem Sandwich-Immunoassay unter Verwendung einer Mischung von biotinylierten Detektionsantikörper für unterschiedliche Analyten mit einer Streptavidin-konjugierten Fluoreszenzsonde, R-Phycoerythrin basiert. Der Mikroarray wurde durch Fluoreszenzmikroskopie in drei Kanäle, zwei für Mikrokügelchen Registrierung und eine für das Assay-Signal abgebildet. Die Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen wurden dann dekodiert und mit einer hausgemachten Algorithmus in MATLAB analysiert.
Introduction
Seit der ersten Microarray von Mark Schena und Mitarbeiter in der Mitte der 1990er Jahre berichtet, hat dieses leistungsstarke Werkzeug in vielen Bereichen der biologischen Forschung 1 verwendet worden. Antikörper-Microarrays, die gleichzeitig mehrere Erfassungs Proteine in diagnostischen Flüssigkeiten, wie Blut, haben wichtige Anwendungen in der klinischen Diagnostik und Screening Biomarker 2-10. Speichel enthält viele der gleichen Analyten wie Blut, hat als eine bevorzugte Alternative zu Blut in Betracht gezogen worden, weil Speichel Sammlung ist sicher, nicht-invasive, und kann von minimal 11 bis 13 ausgebildetes medizinisches Personal durchgeführt werden. Derzeit ist Multiplexproteinanalyse mit Speichelproben von mehreren wichtigen Faktoren ab, einschließlich der niedrigen Konzentration der Ziel-Analyt 14 und dem weiten Konzentrationsbereich der verschiedenen Biomarker 15 begrenzt.
.Hier zeigen wir die Analyse von sechs Proteine: human vascular endothelial growth factor (VEGF), Interferon-gamma-induziertes Protein 10 (IP-10), Interleukin-8 (IL-8), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Matrix Metallpeptidase 9 (MMP-9), Interleukin-1 beta (IL-1β) . Die Leistungsfähigkeit des Verfahrens wurde zunächst unter Verwendung von Standardlösungen bilden Analyten rekombinanten Proteinen und Blocking-Puffer überprüft. Echtspeichelproben von Patienten mit verschiedenen chronischen Atemwegserkrankungen sowie gesunden Kontrollen gesammelt wurden auch mit zufriedenstellenden Leistung getestet. Das Protokoll ist anwendbar auf andere Protein Analyten und anderen Mikrokügelchensystem sein. Diese Plattform bietet erhebliche Vorteile für den Bereich Analytische Chemie, wie es ermöglicht eine schnelle, genaue und reproduzierbare gleichzeitige Analyse von geringen Konzentrationen von mehreren Proteinen mit einem breiten Dynamikbereich, minimale unspezifische Wechselwirkungen, reduzierte Probenverbrauch und niedrige Kosten im Vergleich zu einer analog Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
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Protocol
Fig. 1 ist. . Workflow zum Anlegen faseroptischen Mikrokügelchen Antikörperarray Speichel Profilierung (1) Mikrosphären werden intern mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen codiert, (2) die codierten Mikrosphären werden extern mit Protein-spezifischen monoklonalen Antikörpern modifiziert, (3) die Multiplex-Mikrosphären vermischt werden, und (4) nach dem Zufallsprinzip in Vertiefungen an dem proximalen Ende eines faseroptischen Bündels geätzt abgeschieden, (5) Speichelproteine sind durch Mikrokugeln durch Sandwich-Immunoassay erfasst, und (6) quantifiziert, unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie.
1. Mikrosphären Encoding
- Wiegen Natrium Europium (III)-Trihydrat thenoyltrifluoroacetonate (Eu-TTA, MW = 869,54 g / mol) in einer braunen Glasflasche und bereiten eine 200 mM Stammlösung in Tetrahydrofuran (THF). Vorsichtig mischen; visuell überprüfender Farbstoff vollständig gelöst ist.
- Wiegen Cumarin-30 (C30, MW = 347,41 g / mol) in einer braunen Glasflasche und bereiten eine 12 mM Stammlösung in THF. Vorsichtig mischen; visuell überprüfen, ob der Farbstoff vollständig gelöst ist.
- Bereiten Sie 700 ul der Arbeitslösung für jede Art Mikrokügelchen mit den Stammlösungen und THF bis zur endgültigen Konzentration in Tabelle 1 aufgeführt zu erreichen.
- Stellen Sie sicher, Mikrokugeln (10% w / v) sind gut durch Vortexen suspendiert und übertragen dann 60 ul Suspension bis zu einer 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- In 600 ul PBS auf Mikrokügelchen-Suspension und mischen durch Pipettieren von 20x. Zentrifugieren bei 10.000 rpm für 3 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang ein weiteres 2x um die Mikrosphären zu waschen.
- THF mit einem ähnlichen Verfahren wie in Schritt 1.5 wäscht den Mikrosphärenpellet 3x.
- Zentrifugieren Sie die Mikrosphären / THF-Suspension bei 10.000 rpm für 3 min, den Überstand und resuspendieren des Pellets in 600 ulArbeitslösung in Tabelle 1 aufgeführt. Das Gemisch wird in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Verschließen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen mit Parafilm und legen Sie es auf einem Schüttler. Schütteln bei 3000 Upm und Inkubation für 24 Stunden, vor Licht schützen indem die Setup mit eine Box mit Aluminiumfolie abgedeckt.
- Zentrifugieren der Mikrokügelchen-Suspension bei 10.000 rpm für 3 Minuten, um ein Pellet zu bilden.
- Entfernen Sie den Überstand Farbstofflösung, waschen die Mikrokugeln 6x mit 600 ul Methanol und dann mit 600 ul PBS mit 0,01% Tween-20 ein weiteres 6x, wie in Schritt 1.5 beschrieben.
- Bewahren Sie die codierten Mikrokügelchen in 600 ul PBS mit 0,01% Tween-20 bei 4 ° C bis zur Verwendung, vor Licht schützen.
| Microsphere Typname: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Eu-TTA (mM) | 100 | 100 | 10 | 100 | 10 | ||
| C30 (mM) | 1 | 1 | 6 | 6 | 1 | 6 |
Tabelle 1. Die Konzentrationen von Eu-TTA und C30 Arbeitslösungen.
2. Herstellung von Protein-Mikrokügelchen Erfassungs
- Vorbereitung MES-Puffer [2 - (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES), 0,1 M, NaCl 0,9%, 0,01% SDS, pH 5,7] und PBS / SDS-Puffer (0,01 M Natriumphosphat, 0,154 M NaCl, 0,01% SDS, pH-Wert 7,4) im voraus bei Raumtemperatur.
- In 200 ul codierten Mikrokügelchen-Suspension (mit ~ 2 mg Mikrosphären) in eine Safe-Lock 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Es ist wichtig, diese Art von Mikrozentrifugen-Röhrchen zu verwenden, um ein Verschütten während der Inkubation in Schritt 2.6 zu vermeiden. <li> Waschen Sie die Mikrokügelchen mit 600 ul MES-Puffer 3x wie in Schritt 1.5 beschrieben. In 700 ul MES an das Mikrosphärenpellet und gut mischen durch Pipettieren.
- Vorbereitung 0,105 g / ml 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimid-Hydrochlorid (EDC, MW = 191.7 g / mol) und 0,163 g / ml Sulfo-N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS, MW = 217,13 g / mol) Lösungen im MES-Puffer in getrennten Röhren.
- In 150 ul frisch für Tropfen in die Mikrosphären Suspension hergestellt EDC-Lösung Tropfen. Das EDC hydrolysiert sehr schnell, so ist es wichtig, frisch zubereitete Lösung verwenden, um die Immobilisierung Effizienz zu gewährleisten. Unmittelbar nach der Zugabe des EDC, fügen Sie 150 ul Sulfo-NHS-Lösung für die Mikrosphären, gut mischen durch Pipettieren und überprüfen Sie die Suspension homogen ist.
- Das Röhrchen, verschließen Sie diese mit Parafilm, und legen Sie es auf einem Schüttler. Schütteln bei 1500 rpm für 4 Stunden, vor Licht schützen mit einer Box mit Aluminiumfolie abgedeckt.
- Zentrifugieren Sie die Mikrokügelchen suspensIonen bei 10.000 rpm für 3 Minuten, um ein Pellet zu bilden, und Entfernen des Überstandes. Waschen der Mikrokügelchen mit 500 ul PBS / SDS Puffer 3x wie in Schritt 1.5 beschrieben.
- In 200 ul PBS / SDS-Puffer zum Pellet, mischen die Mikrosphären gut und die Lösung zu 300 ul PBS / SDS-Puffer mit 60 ug Fänger-Antikörper. Es ist wichtig, die Mikrosphärenpellet ersten auszusetzen und dann das Mikrosphärensuspension in der Antikörperlösung.
- Inkubation des Antikörper-Mikrosphären Mischung von bei 1.500 rpm für 4 Stunden auf einem Schüttler schütteln, vor Licht schützen mit einer Box mit Aluminiumfolie abgedeckt.
- Zentrifugieren der Mikrokügelchen-Suspension bei 10.000 rpm für 3 Minuten, um ein Pellet zu bilden, und Entfernen des Überstandes. Mit 500 ul StartingBlock (TBS) Blockierungspuffer 3x, wie in Schritt 1.5 beschrieben Waschen der Mikrokügelchen.
- Mix-Mikrokügelchen mit 1 ml TBS Blocking-Puffer und Inkubation Mikrosphären bei 1500 UpM für 1 h auf einem Schüttler, vor Licht schützen mit einem Kasten BuchtRot mit Aluminiumfolie.
- Zentrifugieren Sie die Mikrosphärensuspension bei 7000 rpm für 3 min, um ein Pellet zu bilden, und entfernen Sie den Überstand. Mit 500 ul TBS Blockierungspuffer, wie in Schritt 1.5 beschrieben 3x Waschen des Pellets.
- Zentrifugieren Sie die Mikrokügelchen-Lösung bei 7000 rpm für 3 min, um ein Pellet zu bilden, und entfernen Sie den Überstand. In 500 ul TBS Blockierungspuffer und mischen durch Pipettieren.
- Speichern Sie die geänderten Mikrosphärensuspension bei 4 ° C bis zur Verwendung, vor Licht schützen.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang, um andere Arten von Mikrokügelchen mit entsprechenden Antikörpern zu machen.
3. LWL-Microarray-Versammlung
- Mischungs 50 ul jeder Art von Protein-Mikrokügelchen Erfassung in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen autoklaviert. Zentrifugieren Sie die Lager-Mikrokügelchen bündeln bei 7.000 rpm für 3 min, und entfernen Sie den Überstand, so dass das Restvolumen beträgt ca. 100 ul.
- Hand geschnitten Glasfaserbündel bis ca. 5 cm in der Länge undsequentiell polieren beide Enden auf einer Poliermaschine unter Verwendung von 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5 und 0,05 &mgr; m-Größe Diamant Läppfilmen. Beschallen des polierten Bündel in entionisiertem Wasser für 2 Minuten, um alle Teilchen zu entfernen.
- Setzen Sie einen kleinen magnetischen Rührstab in ein 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 400 ul von Protein-freien PBS-Puffer und rühren auf einer Magnetplatte Rühren für 30 min, um Luftblasen zu entfernen.
- Ätzen eines Endes des polierten Faserbündel in einer 0,025 N HCl-Lösung für 150 sec 10,16. Sofort tauchen und beschallen die geätzt Ende in VE-Wasser für 1 min. Trocknen Sie die Faserbündel mit Druckluft.
- Montieren Sie die Faserbündel auf einem Faserhalter und blockieren die geätzt Ende in der blasenfreien, Protein-freien PBS-Puffer für 1 Stunde.
- Hinterlegung 1 ul Aliquot der gespeicherten Mikrokügelchen-Suspension auf der geätzten Ende des faseroptischen Bündels. Schützen Sie das Setup von Licht mit einer Box mit Aluminiumfolie und warten Sie 15 min. Das Volumen der Suspension wirdverringern durch Verdampfung und zwingen die Mikrosphären in die geätzten Mikrovertiefungen. Wiederholen Sie diesen Ladeschritt noch einmal.
- Verwenden Sie ein Wattestäbchen mit Probenlösung gesättigt, um Mikrosphären, die nicht in die Kavitäten eingefangen werden, zu entfernen. Die Protein-Microarray ist jetzt einsatzbereit. Gehen Sie sofort zum Speichel-Analyse Schritt 4.1.
4. Speichelprobenanalyse mit Mikrosphären, Microarray
- In 200 ul Probenlösung (100 ul Speichelüberstand mit einem gleichen Volumen StartingBlock T20 (PBS) verdünnt Blockierungspuffer. Die Sammlung Protokoll für Speichelüberstand wurde zuvor veröffentlicht worden 10). in ein 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen autoklaviert. Tauchen Sie den Protein-Mikroarray auf der Faser in die Lösung eingelegt und Inkubation auf dem Schüttler bei 600 rpm für 2 Stunden, vor Licht schützen mit einer Box mit Aluminiumfolie abgedeckt.
- Es werden 20 ml Waschpuffer durch Zugabe von 200 &mgr; l 10% BSA-Lösung und 200 &mgr; l 10% Tween-20 in 19,6 ml PBS, mix gut durch leichtes Schütteln.
- Tauchen Sie den Protein-Microarray in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit autoklaviert 200 ul Waschpuffer und schütteln bei 600 rpm für 2 min. Wiederholen Sie diesen Wasch 3x.
- Inkubieren des Mikroarrays in 100 ul Lösung eines Detektions-Antikörper-Cocktail, enthaltend 5 ug / ml Anti-VEGF-, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, IL-1β biotinylierter Detektionsantikörper in StartingBlock T20 (PBS) Blockierungspuffer für 30 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler bei 600 rpm, vor Licht mit einer Box mit einer Aluminiumfolie abgedeckt.
- Wie in Schritt 4.3 beschrieben Waschen Sie den Microarray-3x mit Waschpuffer.
- Inkubieren Sie die Microarray in 200 ul 20 ug / ml Streptavidin-R-Phycoerythrin-Konjugat (SAPE)-Lösung in PBS bei 600 rpm auf dem Schüttler für 10 min, vor Licht schützen mit einer Box mit Aluminiumfolie abgedeckt.
- Wie in Schritt 4.3 beschrieben Waschen Sie den Microarray-5x mit Waschpuffer.
- Reinigen des distalen Endes der Faser (dh das Ende entferntvon den Mikrosphären) Bundle mit einem Tupfer mit absolutem Ethanol gesättigt.
- Trocknen beide Enden der Faser mit Druckluft. Montieren der Faser auf einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Bild durch das distale Ende der Faser.
- Erwerben Mikrokügelchen-Bilder entsprechend Eu-TTA, C30, und SAPE Fluoreszenzemissionsintensitäten. Optische Filter-Setup und Belichtungszeiten für Fluoreszenz-Bildgebung des Eu-TTA, C30 und SAPE sind in Tabelle 2 dargestellt.
| Kanal | Eu-TTA | C30 | SAPE |
| Exciter | 365/10x | 350/50x | 546/10x |
| Strahlteiler | 525DCLP | 400DCLP | 560LP |
| Emitter | 620/60m | 460/50m | 580/30m |
| Belichtungszeit | 1 Sek. | 0,3 s | 1 Sek. |
Tabelle 2. Parameter für die drei Fluoreszenzbilder des Mikroarrays.
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Representative Results
Fluoreszenzbilder von drei Kanälen, die einen kleinen Abschnitt des faseroptischen Bündels in den 2A-C gezeigt. Diese Bilder wurden unter Verwendung eines Algorithmus in Matlab analysiert (wie detaillierter in der Diskussion beschrieben). Die Analyse verwendet sowohl Daten aus der EU-TTA Bildcodierung (2A) und der C30-Codierung Bild (Fig. 2B), um die Mikrosphären zu decodieren, und die Fluoreszenzintensitäten verschiedener Mikrokugeln in dem Bildsignal (Fig. 2C) berechnet. Mit den Eichkurven von korrelierten Proteinstandards erhalten wurden, wurden die Konzentrationen von Proteinen in Speichelproben berechnet.
2. (A) Eu-TTA Bildcodierung (B) C30 Bildkodierung, (C) SAPE Bildsignal (D) Decodierergebniss überlappt auf dem Bildsignal, verschiedene Arten von Mikrokügelchen mit verschiedenen Farben und Formen gekennzeichnet.
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Discussion
Forscher sollten Sie besonders auf die folgenden Schritte beachten: für bessere Dekodierung Genauigkeit, ist es notwendig zu überprüfen, die Mikrokugeln wurden homogen in allen Inkubation suspendiert und Waschschritte während der Mikrosphären Verschlüsselungsverfahren. Darüber hinaus müssen die codierten Mikrosphären, von Licht während des gesamten Experiments zu schützen. Nach korrekter Kodierung und Lagerungsverfahren, fanden wir, dass die Gesamt Decodierung Genauigkeit von über 99% lag. Die codierten Mikrosphären bei 4 ° C gelagert Einfrieren und vor Licht geschützt werden. Unter geeigneten Lagerbedingungen sind die codierten Mikrokügelchen stabil für mehr als sechs Monate. Während der Codierung und Modifizierungsschritte ist äußerste Sorgfalt erforderlich, um den Verlust an Mikrokügelchen zu verringern. Beispielsweise stören die Mikrosphärenpellet beim Entfernen Stand. Darüber hinaus, darunter Tween-20 und SDS in den Puffern ist für eine bessere Mikrokügelchen-Pelletierung von wesentlicher Bedeutung.
Einige of die gemeinsamen Verfahren zur Problemlösung sind: (1) Verwenden Sie nur frisch zubereitete EDC-Lösung und die EDC-Lösung sollte tropfenweise hinzugefügt werden, (2) autoklaviert Rohre verwendet werden und die Mikro Lösung sollte vor jeder Inkubation Schritt in ein neues Röhrchen überführt werden ( 3) bei jedem Waschschritt versuchen, den Überstand so weit wie möglich zu entfernen, (4) die modifizierten Mikrosphären bei 4 ° C gelagert werden, Einfrieren zu vermeiden und vor Licht schützen. Unter geeigneten Lagerbedingungen können die modifizierten Mikrokugeln gelagert werden mehr als 3 Monate ohne nachweisbare Signalverlust.
Die zur Herstellung der Fluoreszenzbilder analysieren MATLAB-Algorithmus wird im folgenden kurz beschrieben. Der entsprechende Code kann in ergänzenden Materialien gefunden werden. Pixel innerhalb einer benutzerdefinierten Intensitätsbereich für die Eu-TTA Bild zuerst gefiltert. Verschiedene Bereiche wurden mit einer Größe-Filter überprüft, Bereiche, die eine "hohle" Zentrum von Lichtdämpfung verursacht wurden entfernt, und Bereiche, in denenMikrokugeln vorhanden sind wurden in eine Merkliste für die zukünftige Verarbeitung sortiert. Alle Mikrosphären aus der Merkliste wurden weiter mit Antworten in der entsprechenden Bild C30 gefiltert. Die Signale für alle Pixel eines bestimmten Mikrokügelchen wurden gemittelt. Die Signalstärke des Mikrokugel Interesse wurde durch Mittelung der Intensitäten aller Mikrosphären in die Merkliste berechnet. Um die Ergebnisse statistisch repräsentativ zu machen, wurde ein Minimum von 25 Mikro jeder Art erforderlich. Um die nicht-spezifische Signal zu minimieren und eine Verringerung der Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Experimenten wurden Signale für alle Mikrokugel-Typen durch Subtrahieren des Signals von der Kontrollmikro normalisiert.
Die Signalantwort der Mikrokugeln kann durch die Menge von Antikörpern auf der Oberfläche der Mikrokügelchen immobilisiert, die ideal für Multiplex-Detektion von Proteinen mit breiter Bereiche von Konzentrationen eingestellt werden. Basierend auf unterschiedlichen Durchmessern der Mikrokügelchen, ter Antikörpermenge erforderlich, um eine Monoschicht auf den Mikrokügelchen durch die Gleichung beim Hersteller 17 geschätzt werden. Für Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 4,5 &mgr; m, 3 &mgr; g Antikörper pro 1 mg Mikrokugeln benötigt. Wir haben verschiedene Mengen Antikörper in der Kopplungslösung in Schritt 3 von 2,8 ug (0,5 x) auf 60 &mgr; g (10x) von Antikörper getestet. Erhöhte Signale wurden beobachtet, wenn mehr Antikörper in der Lösung verwendet. Optimale Antikörper Beträge für verschiedene Antikörper und Anwendungen müssen experimentell ermittelt werden. Die "Kontrollmikrosphären" wurden mit der Maus Isotyp IgG-Antikörper, die vom Hersteller als negative Kontrolle im direkten ELISA zugeführt wird und keine Kreuzreaktivität mit bis zu 40 rekombinanten humanen Proteinen 18 gezeigt gekoppelt. Um die Reproduzierbarkeit des Kopplungsverfahrens zu evaluieren, wurden zwei Chargen von MMP-9 Mikrokügelchen an verschiedenen Tagen gekoppelt. Die Leistung der Mikrokügelchen wurde unter Verwendung multiplexe getestetd. Nachweis von 10 ng / ml MMP-9. Die Ergebnisse zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Chargen von Mikrokügelchen (detaillierte Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt).
| Nicht | Datum | Test 1 | Test 2 | Test 3 | Durchschnitt | Std |
| 1 | 01/12/2011 | 773,8 | 690,1 | 756,8 | 740,2 | 44,2 |
| 2 | 01/26/2011 | 791,9 | 721,8 | 867,0 | 793,6 | 72,6 |
Tabelle 3. Reproduzierbarkeit der Kopplungsverfahren (in willkürlichen Einheiten gezeigten Ergebnisse).
Die hier vorgestellte Multiplex-Verfahren ermöglicht eine schnelle, genaue und reproduzierbareAnalyse verschiedener Proteine über einen weiten Konzentrationsbereich (in Tabelle 4 aufgeführten Ergebnisse). Das Potenzial für Kreuz-Reaktivität der sechs Antikörper-Paare wir in dieser Studie verwendet wurde ebenfalls getestet. Alle Signale von Kreuzreaktivität gefunden vernachlässigbar (weniger als 3%) zu sein. Weitere Vorteile dieser Methode im Vergleich zu einem herkömmlichen Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), umfassen einen breiten Dynamikbereich, minimale unspezifische Wechselwirkungen, reduzierte Probenverbrauch und niedrige Kosten 10. Das erforderliche Volumen der Speichelprobe ist so niedrig wie 100 &mgr; l, und der Test kann innerhalb von 3,5 Stunden abgeschlossen. Wenn mit anderen Suspensionssysteme verglichen werden, ist eine Einschränkung dieses Ansatzes, dass, sobald der Mikroarray wurde zusammengebaut, muss der Detektions in weniger als 15 min gestartet. Das hier beschriebene Verfahren wurde im Labor verwendet, um menschliche Speichel-Proben von Patienten mit entzündlichen Erkrankungen und gesunden Kontrollen (unveröffentlichte Daten) gesammelt analysieren. Das Verfahren soll erhoben werdenfür die Proteinanalyse von anderen komplexen Flüssigkeitsproben. Eine ähnliche Mikrokügelchen basierende Proteinarray auf anderen Plattformen wie Mikrofluidik-Vorrichtungen verwendet werden. Die Codierung und immobilisiert Methoden könnten auch Mikrokugeln mit anderen Materialien 9 aufgebracht werden.
| VEGF | IP-10 | IL-8 | EGF | MMP-9 | IL-1β | |
| Test 1 | 5365,9 | 2578,4 | 6508,7 | 2584,0 | 515,5 | 1147,4 |
| Test 2 | 5787,8 | 2577,9 | 7238,9 | 2919,2 | 375,7 | 1099,2 |
| Test 3 | 4944,6 | 2883,3 | 6726,3 | 3619,3 | 406,8 | 1084,1 |
| Durchschnitt | 5366,1 | 2679,9 | 6824,6 | 3040,8 | 432,7 | 1110,2 |
| Std. Dev | 421,6 | 176,2 | 374,9 | 528,3 | 73,4 | 33,1 |
Tabelle 4. Ergebnisse der drei unabhängigen Tests auf der gleichen Speichelprobe (Ergebnisse in willkürlichen Einheiten gezeigt).
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (Zuschuss 08UDE017788-05) unterstützt. EBP erkennt auch Unterstützung von der spanischen Stiftung für Wissenschaft und Technologie (FECYT). Die Autoren danken Shonda T. Gaylord und Pratyusha Mogalisetti für das kritische Lesen des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
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