Summary
Aerobik koşullarda bakteri yapışma ve işgali araştırmak için hücre kültürü deneyleri Sahne genellikle temsil edici olduğu
Abstract
Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenler etkileşimleri, in vitro hücre kültürü yöntemleri kullanılarak yoğun bir şekilde araştırılmıştır. Bu hücre kültürü deneyleri aerobik şartlar altında gerçekleştirilir Ancak, bu in vitro modellerde doğru konak-patojen yer aldığı in vivo ortamda temsil olmayabilir. Farklı orta ve gaz koşullarında bir bakteri ve konak hücrelerin kokültürü izin enfeksiyonun bir in vitro modeli geliştirdik. Dikey difüzyon hücresinde (VDC) modeli bakteriler çok düşük oksijen iken doku koşulları altında olacak insan bağırsak koşulların kan akışından oksijen ile tedarik edilecek taklit eder. Bir VDC içine Snapwell ekler yetiştirilen polarize bağırsak epitel hücre (IEC) mono tabakaları yerleştirilmesi ayrı apikal ve bazolateral bölmeleri oluşturur. Bazolateral bölmesi, hücre kültür ortamı ile doldurulmuş ve kapatılmış oksijen w ile perfüzeApikal bölmesi Hilst suyu ile doldurulur, açık tutulur ve mikroaerobik koşullar altında inkübe edildi. Caco-2 ve T84 Hem IECS hücre yaşamını ya da tek tabaka bütünlüğü üzerinde belirgin bir zararlı etki olmaksızın, bu koşullar altında VDC korunabilir. Coculturing deneyler değişik C ile gerçekleştirilir apikal bölmeye mikroaerobik koşullara jejuni, vahşi tip suş ile VDC model içinde farklı IEC hattı tekrarlanabilir aerobik kültür koşulları ile karşılaştırıldığında bir etkileşim sayısı (yaklaşık 10 kat) artış ve hücre içi (hemen hemen 100 kat) bakterilerin neden 1. VDC modeli oluşturulan ortamı daha yakından C. karşılaştığı çevre taklit eder ve insan bağırsak jejuni daha yakından in vivo gerçekte taklit eden şartlar altında in vitro enfeksiyon deneyleri gerçekleştirmek önemini vurgulamaktadır. Biz VDC modelinin kullanımının etkileşim yeni yorumlar bahis sağlayacak teklifbakteriyel patojenler ve konak hücreleri da muhtemelen bir.
Introduction
Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenler etkileşimleri, in vitro hücre kültürü yöntemleri kullanılarak yoğun bir şekilde araştırılmıştır. Bu hücre kültürü deneyleri, ev sahibi hücrelere bakteriyel yapışma, konak hücre reseptörleri, yollar ve ev sahibi hücrelerin bakteri istilası sinyal konak hücrenin kimlik kullanan tüm birçok önemli gözlemler sonucu, ayrıntılı olarak incelenmiştir. Ancak bu hücre kültürü deneyleri in vivo ortamda temsil olmayabilir aerobik koşullar altında yapılmaktadır. Gastrointestinal enfeksiyonlar incelemek için kullanılan in vitro modellerinde önemli bir sınırlama yüksek oksijen seviyesi de dahil olmak üzere kültür koşulları genellikle ökaryot hücre sağkalım lehine olmasıdır. Bununla birlikte, bağırsak lümeninden koşulların hemen hemen anaerobik olacaktır. Çok düşük bir oksijen ortamında enterik patojenlerin olan ekspresyon değişikliği aerobik şartlar altında 2 enfeksiyon genlerini ifade eder. Bu nedenle, veri standart hücre kültürü modelleri m kullanılarak eldeay konak hücreleri ile bakteriyel etkileşimlerin bir yanlış göstergesidir.
Campylobacter jejuni hafif ishal şiddetli enflamatuar enterit değişir bu belirtiler, dünya çapında bakteriyel akut gastroenterit önde gelen etken olduğunu. C çoğunluğu basit gastroenterit jejuni enfeksiyonları sonucu, ancak C. jejuni da Guillain-Barre sendromu (GBS) dahil olmak üzere çevresel nöropatiler, en yaygın olarak tespit bulaşıcı bir ajandır. İngiltere'de, bu C'nin neden enterit 500.000 'den fazla vaka olduğu tahmin edilmektedir 580.000.000 £ Birleşik Krallık'ın ekonomisine tahmin maliyeti jejuni enfeksiyonu her yıl. Gelişmekte olan ülkelerde, C. jejuni çocuklar arasında ölüm önde gelen nedenidir. Şüphesiz Campylobacter enfeksiyon önemi ve kapsamlı genomik-tabanlı analiz, C dahil olmak üzere araştırma yıllardır rağmen, jejuni patogenezi hala tam underst olduğunuood, Salmonella, Escherichia coli, Shigella, ve Vibrio cholerae gibi diğer enterik patojenler aksine. Uygun bir küçük hayvan modeli eksikliği bu 3 için önemli bir nedenidir. Ayrıca yaygın olarak in vitro enfeksiyon modellerinde kullanılan mikroaerofilik C çalışmak için daha uygun değildir fakültatif anaeroblar diğer enterik patojenler için daha jejuni. Iken C. jejuni istilacı patojen, C. mekanizmaları olarak kabul edilmektedir bağırsak epitel hücrelerinin jejuni işgali (IECS) hala 4,5 belirsiz. C. jejuni işgal ya mikrofilamanlar, mikrotübüller, her ikisi de bir arada ya da ikisinin de 5 bağımlı olduğu gösterilmiştir. Bu alanda karışıklık muhtemelen in vitro test koşullarında uygunsuz kullanım kaynaklanmaktadır.
Farklı hücre kültürü analizlerinden bir dizi C etkileşimi araştırmak için kullanılmıştır jejuniev sahibi hücrelerle. Caco-2 6, INT 407 7, 8 ve T84 hücre hatları tüm farklı C. adhezyon ve invazyon yetenekleri incelemek için kullanılmıştır jejuni suşları. Ancak, C. için bakteriyel yapışma ve invazyon seviyeleri IECS ile jejuni diğer enterik patojenler 9 daha önemli ölçüde düşüktür. C. coculturing IECS ile jejuni, normal IECS hayatta kalması için gerekli atmosferik oksijen seviyeleri yakın koşullar altında bir CO2 inkübatör içinde gerçekleştirilir. ° C. jejuni gen ekspresyon atmosferik oksijen koşullarına göre bağırsak lümen düşük oksijen ortamda çok farklı olacaktır.
Dikey bir difüzyon hücresinde (VDC) sistemi kullanımı, farklı orta ve gazı koşulları altında 1,10,11 bakteri ve konak hücrelerin kokültürü izin veren geliştirilmiştir. Bu sistem bakteri un olacak insan bağırsak koşullarını taklitçok düşük oksijen iken doku der koşulları kan akışından oksijen ile tedarik edilecektir. Özel bir 0.4 mikron filtre yetiştirilen Polarize IEC mono tabakaları bireysel bakteriyel suyu ve sırasıyla, hücre kültürü ortamı (Şekil 1) ile doldurulmuş bir apikal ve bazolateral bölmesi, oluşturma VDC içine yerleştirildi. VDC değişken bir atmosfer inkübatöründe 37% 85 N2,% 5 O2 ve% 10 CO2 içeren ° C, C için en uygun koşulların temsil yerleştirildi jejuni. Apikal bölmesi açık bıraktı ve değişken atmosfer inkübatör içinde mikroaerobik atmosfere maruz kalmış, kapalı bazolateral bölmesi iken% 5 CO 2 / basınç birikimi engelleyen bir çıkış borusu ile% 95 O 2 gaz karışımı sürekli yönetimi tarafından oksijen ile sağlanan . Bu koşullar altında, Caco-2 hücre hayatta kalması ve tek tabaka bütünlüğü transepitelyal ele izlenmesi ile doğrulanmıştır24 saat boyunca tek tabaka üzerinde ctrical direnci (TEER), apikal bölmeye düşük oksijen koşullarında apikal ve bazolateral bölmelerinin Caco-2 hücre tek ve fiziksel olarak ayrılması hayatta göstermek için. Değişken atmosfer inkübatör (Mikroaerobik koşulları) ve bir standart hücre kültürü CO 2 inkübatör (aerobik koşullarda) muhafaza VDCs içinde mono tabakaları TEER farklı atmosferik koşullar 1 altında hücre tek tabaka bütünlüğünü gösteren, anlamlı farklılık gösterdi. Mikroaerobik koşullar altında, sıkı bağlantıları mevcut ve eşit aerobik koşullarda 1 altında muhafaza hücreleri benzer bir occludin boyama deseni ile hücre sınırları arasında dağıtılır kaldı.
C. etkileşimleri VDC Caco-2 ve T84 hücreleri ile jejuni bakteriyel etkileşim (yapışma ve işgali) ve işgali değerlendirerek incelenmiştir. Iki farklı ° C. jejuni yabani tip strains 1 kullanıldı. C. jejuni 11168H orijinal dizisi gerginlik NCTC11168 bir hypermotile türevidir. 11168H gerginlik bir civciv kolonizasyon modelinde çok daha yüksek kolonizasyon düzeyi gösterir ve bu nedenle konak-patojen etkileşim çalışmaları için kullanılacak uygun bir gerginlik olarak kabul edilir. 81-176 bir insan izole etmek ve en invaziv yaygın olarak incelenmiştir laboratuar suşları biridir. ° C. jejuni suşları mikroaerobik veya aerobik şartlar altında bir ya da VDC apikal bölmesine ilave edildi. Biz etkileşim ve işgali hem de yüksek oranda C için kaydedildi gözlenen mikroaerobik koşullar 1. altında jejuni. Artan ° C. jejuni etkileşimleri mikroaerobik koşullar 1 altında bakteri sayısındaki artış nedeniyle değildi. Bu veri VDC apikal bölmesinde düşük oksijen ortamında bakteri-konak ilişkileri geliştirir ve gösterir bizim hipotezi desteklediği C invaziv özellikleri jejuni incr olanBu koşullar altında hafifletti. Bu invaziv bakteriyel patojen incelemek için VDC modelinin kullanımının ilk rapor ve daha yakından in vivo durumda taklit koşullarda in vitro enfeksiyon tayinlerde performans önemini vurgulamaktadır. VDC modeli çok farklı bakteri türleri için konak-patojen etkileşimleri çalışmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Özel 0.4 mikron Filtreler IEC Tek katmanlar Büyüme
- Dulbecco'nun modifiye temel ortam, kültür, Caco-2 hücreleri (DMEM)% 10 (v / v) fetal dana serumu, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve% 1 (v / v) ile gerekli olmayan amino asitler ile desteklenmiş 37 standart bir doku kültürü kuluçka °% 5 CO2 ve% 95 hava C 'dir. Tohum 4 x 10 5 Caco-2 0.4 mikron başına IECS filtre ve 21 gün içinde kutuplaşma büyümeye, medya 2-3 günde değişiyor.
- Bir Volt-Ohm direnç metre kullanarak tek tabaka polarizasyon durumunu onaylamak için TEER ölçün. Çalışmalarda, 21 günün TEER Caco-2 bu 0.4 mikron filtre yetiştirilen hücreler 700-800 Ωcm 2'dir.
2. C. hazırlanması jejuni ve Coculturing tahlil için Bakteriyel Orta
- VDC coculturing testinin istenen başlangıç noktası önce 24 saat, C taze bir kan agar plaka hazırlamak. 37 jejuni ve inkübe ° C değişken atmosfer inkübatör mikroaerobik koşulları (% 85 N 2, 5% O 2, ve% 10 CO 2) altında.
- Aynı zamanda, değişken ortam inkübatör mikroaerobik koşullar altında 37 ° C 'de Brucella et suyu 30 ml Preincubate.
3. Hazırlık ve Test öncesinde VDC Yarım Odaları Sterilizasyon
- Batırmayın VDC yarısı odaları yanı sıra O-ring ve sterilizasyon çözüm fişleri.
- , Steril bir 20 ml'lik şırınga kullanarak, yarı odaları hem de gaz girişleri aracılığıyla sterilizasyon çözeltisi yıkayın. Aksi takdirde, coculturing sırasında numunelerin kirlenmesine neden olabilir.
- > 1 saat için sterilizasyon solüsyonuna daldırılır tüm bileşenleri bırakın.
- Gaz girişleri temizlemek için başka bir steril 20 ml şırınga kullanarak, temiz steril su ile durulayın.
4. HazırlıkBakteriyel inokulum
- C. yarım tabak hasat kan agar plağından jejuni büyüme kuluçkaya yatırılmış brusella suyu 1 ml içine önceki gün hazırladı. Bu ~ 10 10 kob / ml boyun eğmek zorundadır.
- Bakteriyel koloni oluşturan birim (CFU) semiquantify ile 600 nm de bakteriyel süspansiyonun optik yoğunluğunun ölçülmesi.
- Kuluçkaya yatırılmış Brucella brot 4 ml inokulum istenen seviyeye bakteri süspansiyonu ayarlayın.
- Daha sonra, inokulum mevcut bakteriyel CFU sayısını ölçmek için, 48 saat boyunca, değişken bir atmosfer inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe üç tekrarlı olarak kan agar plakaları üzerine uygun dilüsyonları, kaplama, ardından, bu nihai bakteriyel süspansiyon bir seri seyreltme gerçekleştirin.
5. VDC ayarlama
- Tezgah üzerine VDC düz alt yarısında odasına yerleştirin. Alt yarısında odasının üzerine bir O-ring takın.
- T IECS taşıyan bir filtre ayırıno bir taşıyıcı ve steril PBS 400 ul ile üç kez yıkayın. O-ring yerinde kalır emin, alt yarısı odasının üzerine filtre yerleştirin.
- Yavaşça üst yarısında odasına yerine indirin. Iki yarı-odaları monte edildikten sonra, halka kelepçelerle birbirine kenetlenmiştir. Yukarı bakacak şekilde iki açıklık ile, tezgah üstüne yatay olarak VDC yerleştirin.
- Apikal yarısı odasına bakteriyel inokulum 4 ml ekleyin.
- Yarı bazolateral bölmeye hücre kültürü ortamı 4 ml ilave edilir.
- Yarım odaları hem deliklerine sonunda parçaları yerleştirin.
6. Değişken Atmosfer İnkübatör içinde Gaz Manifold için VDC takılması
- Gaz manifoldu yakın değişken atmosfer kuvöz içine VDC yerleştirin.
- Gaz manifoldu bağlı gaz regülatörü açın. VDC bazolateral yarısı odasına üzerindeki gaz girişine manifoldundan tüp takın. Ga takıns çıkış borusu bazolateral yarım odası üzerinde son-parça satış birine değişken atmosfer inkübatör dışında lider.
- Bazolateral yarım odası üzerinde son parçalı diğer çıkış kapalı kapatın. Bu bazolateral ortamın sınırdışı yol açabilir gibi, aşırı gaz basıncı önlemek için çok yavaş açmak için bakımı, gaz manifoldu üzerinde gaz akışını açın.
- Amaç 1 kabarcık her 2-5 saniye bir gaz akışı. Periyodik olarak, deney sırasında gaz akışını kontrol etmek ve gerektiğinde ayarlayın.
7. Kokültürü sonra VDC sökülmesi
- Uygun kokültürü süre sonra, gaz manifolduna bağlı gaz regülatörü kapatın. Manifoldunda VDC içine gaz akışını kapatın. Gaz girişi, gaz çıkışı ve VDC gelen stoper çıkarın.
- Bir değişken atmosfer inkübatör VDC çıkarın. Subsequen için -80 apikal ve bazolateral süpernatanlar ve mağaza ° C çıkarınT analizi.
- Halka kelepçeleri çıkarın ve yavaşça VDC parçalara ayırmak. Yarı odası ve steril bir 6-kuyulu hücre kültürü çanak transfer filtre çıkarın. Steril PBS ile 400 ul IECS üç kez yıkayın.
- Etkileşim bakteri sayısının sayılması için, Triton X-100 IECS için% 0.1 içeren steril PBS içinde 400 ul (v / v) ekleyin ve IEC eritmek için, oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. Daha sonra bakteriyel CFU etkileşim sayısını ölçmek için, 48 saat boyunca, değişken bir atmosfer inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe üç tekrarlı olarak kan agar plakaları üzerine uygun dilüsyonları, kaplama, ardından, bu hücre lizatından bir seri seyreltme gerçekleştirin.
- Istilacı bakteri sayısının sayılması için,% 5 CO2 ve% 95 37 ° C'de standart bir doku kültürü inkübatörü içinde, 2 saat boyunca inkübe IECS ve 150 ug / ml gentamisin ihtiva eden DMEM hücre kültür aracı maddesi ° C arasında 400 ul dışı bakterileri öldürmek için hava,daha sonra yukarıda adım 7.4 için olarak izleyin.
8. Kokültürü sonra VDC temizleme
Deneylerin bir sonraki tur için steril su ve mağaza ile VDC yıkayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Coculturing deneyler C ile gerçekleştirilen jejuni, yabani tip suşu ve apikal bölmeye mikroaerobik koşullara VDC modelinde IECS bir süre içinde aerobik kültür koşulları ile karşılaştırıldığında bir etkileşim sayısındaki artış (yaklaşık 10 kat) ve hücre içi (hemen hemen 100 kat) bakteri göstermiştir bağımlı bir şekilde 1. Bu gözlem, iki farklı C. kullanarak tekrarlanabilir olduğu jejuni yabani tip suşları (11168H ve 81-176) ve iki farklı IEC hatları (Caco-2 ve T84), VDC modeli 1 geçerliliğini vurgulayarak.
Burada sunulan temsilcisi sonuçları C sayısı arasında bir karşılaştırma vardır jejuni apikal com mikroaerobik koşullarına sahip bir CO2 inkübatör (Şekil 2A ve B) ya da V DC modelde standart hücre kültürü yöntemi koşulları altında ya da 3, 6 veya 24 saat sonra kokültürü arasında etkileşim veya Caco-2 hücreleri istilabölmesindeki (Şekil 2C ve D). İki farklı C için veriler jejuni yabani tip suşları (11168H ve 81-176) sunulmaktadır. Bilimsel literatürde çalışmaların büyük çoğunluğunda kullanılan standart hücre kültürü koşulları altında, <10 7 cfu ile karşılaştırıldığında, Caco-2 hücreleri (Şekil 2A) ile etkileşim gözlemlenmiştir ~ 10 8 CFU VDC, Caco-2 hücreleri ile etkileşim gözlemlenmiştir 24 saat sonra modeli (Şekil 2C). VDC modelinde kokültürü sonra, 10 ~ 7 hücre içi cfu yalnızca göre, Caco-2 hücreleri (Şekil 2B), ~ standart hücre kültürü koşullarında kokültürü sonra, Caco-2 hücreleri (Şekil 2B) izole 10 5 intraselüler CFU izole edilmiştir 24 s.
C. sayısı arasında doğrudan bir karşılaştırma jejuni mikroaerobik veya aerobik ya koşulları ile VDC modelinde kokültürü sonra IECS ile etkileşim ya da işgalapikal bölmeye lar daha önce 1 gerçekleştirilmiştir. C. etkileşim artışa VDC Model sonuçlarının kullanımı yaklaşık 10-kat jejuni ve hücre içi C artışa 24 saat kokültürü 1 sonra yaklaşık 100-kat jejuni.
Şekil 1. Dikey difüzyon hücresinde (VDC) modeli. Bağırsak epitelial hücreler üzerinde (IECS) şematik olarak geçirgen bir 0.4 mikron filtre destekleri üzerinde yetiştirilen ve bu nedenle bir apikal ve bazolateral bölme oluşturarak, VDC eklenir. Bu bölmeler, daha sonra tek tek C ile IECS arasında coculturing izin vermek için, orta ve gazı bileşimi ile ilgili olarak ayarlanabilir IECS en bazolateral yüzeyinde IECS ve aerobik koşulların apikal yüzeyinde mikroaerobik şartlara jejuni.
Şekil 2. Temsilcisi sonuçları C. sayıları karşılaştırma kokültürü tahlil, bir CO standart hücre kültürü koşulları altında ya da yapıldığında (A ve C) ile etkileşime girmek veya 3, 6 veya 24 saat sonra (B ve D), Caco-2 hücreleri istila jejuni, 11168H veya 81-176 vahşi tip suş 2 inkübatör (A ve B) veya apikal bölmesinin (C ve D) olarak mikroaerobik koşullara VDC modelinde. Tüm deneyler her deneyde yinelenen yapılan en az üç biyolojik çoğaltır temsil etmektedir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ev sahibi hücrelerle bakteriyel patojenlerin etkileşimleri incelemek için in vitro hücre kültürü yöntemleri içinde kullanımı yaygın olarak pek çok araştırma laboratuarlarında kullanılan bir tekniktir. Bu hücre kültürü deneyleri aerobik şartlar altında gerçekleştirilir Ancak, bu in vitro modellerde doğru konak-patojen yer aldığı in vivo ortamda temsil olmayabilir. Yaygın olarak in vitro enfeksiyon modellerinde kullanılan mikroaerofilik C. çalışmak için özellikle uygun değildir jejuni fakültatif anaeroblar diğer enterik patojenler göre. C. insan IECS işgali mekanizmaları ile ilgili literatürde oldukça karışıklık vardır jejuni 4,5. Biz bu çalışmalarda kullanılan in vitro modeller doğru in vivo durumda yansıtmıyor çünkü işgal mekanizmaların tam olarak anlaşılamamıştır nedeni olduğunu göstermektedir. Seviyesi, standart hücre kültürü deneyleri kullanarakC. IECS bir jejuni işgali her zaman 9 çok düşüktür. VDC modelinin geliştirilmesi bu sorunu gidermek için bizim yanıt oldu.
Biz iki farklı IEC hatları 24 saat süre 1 üzerinde herhangi bir gözlenen dezavantajlı etkisi olmadan apikal yüzeyinde mikroaerobik şartlara VDC muhafaza edilebilir kurduk. Etkileşen ve hücre içi hem de C numaralarının bir zamana bağımlı bir artış jejuni 11168H yabani tip suşu bakteri apikal bölmesi 1. mikroaerobik koşullara VDC Caco-2 IECS ile coculturing sonra gözlemlenmiştir. Bu gözlemler, bundan başka bir ikinci IEC hattı (T84) yanı sıra, ikinci bir C kullanılarak teyit edildi jejuni yabani tip suşu (81-176), herhangi bir hücre hattı veya bakteriyel gerginlik spesifik etkileri 1 göstermektedir. Bakteriyel etkileşim ve invazyon Bu daha yüksek düzeyde IECS 1 artmış, polarize doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ile sonuçlanmıştır. HIGIL-8 onu düzeyleri artan bakteriyel meydan artan konak cevabı ile eşleşen belirten, mikroaerobik coculturing sonra tespit edildi. IL-8, daha yüksek düzeyde IECS göre, IL-8 salgı bazolateral IEC yüzeyinden ağırlıklı olarak oluşur belirten, apikal süpernatantlar ile karşılaştırıldığında bazolateral süpernatanlar tespit edilmiştir. IL-8, bağırsak lümeninde kullanımının sınırlı olacaktır, nötrofil çekici olduğu gibi. Bu veriler, VDC, iki bölmeli bir kurulum da polarize konak yanıtının belirlenmesi için etkili bir olanak sağladığını gösterir.
VDC modelin teknik / kurulum tarafı ile ilgili çeşitli özellikler üzerinde önceden herhangi bir patojen organizma çalışma modeli uygulamak için düşünülmelidir. İlk olarak, IECS özel 0,4 mikron filtre üzerinde geçirimsiz tek tabaka oluşturmak için yetiştirilmesi gerekir. Bu, kullanılan hücre hattı bağlı olarak 14-21 gün arasında sürer ve oldukça uzun deneyler klasik cocultu göre yaparhalka deneyler hücre kültürü plakaları yapılan ve 1-7 gün arasında yetiştirilen IECS kullanarak. Öte yandan, yalnızca büyüme kadar uzun bir süre sonra tamamen polarize IECS bir tek tabaka oluşturacak şekilde gösterilmiştir. Bu gibi polarize mono tabakaları çok daha yakından bazı çalışmalarda kullanılan ve bu gibi VDC modelin bir başka avantaj sağlayan nonpolarized, nonconfluent IEC hattı daha insan bağırsak epitel hücreleri, in vivo durumu taklit edebilir. İkinci olarak, özel 0.4 mikron filtre standart bir 24-iyi hücre kültürü plaka önemli ölçüde daha pahalı. VDC temel sınırlama nispeten düşük akış olduğunu. Bu VDC odaları durumu ve gaz manifoldu gerektiren kurulum kaynaklanmaktadır. Paralel çoğaltır sadece nispeten az sayıda klasik hücre kültürü yöntemi aksine, bir kez de gerçekleştirilebilir. VDC modeli bu nedenle kopya sayısının yüksek gerektiren büyük ölçekli tarama deneyler veya deneyler için daha uygundurtes. Bir diğer faktör dikkate VDC modelinde kokültürü deneyleri gerçekleştirme yerçekimi etkisi zaman içinde bakteri IEC tek tabaka ile etkileşimleri için azaltılmış fırsat sonuçlanan apikal bölmesinin altındaki toplam başlar anlamına gelir olmasıdır. Ancak VDC modeli kullanılarak, biz 11168H rpoN mutant nonaggregating bir nonmotile etkileşimleri, dramatik 6 saat sonra 1 11168H yabani tip suşu toplayarak, hareketli kıyasla daha az olduğunu göstermiştir. Şu anda daha yakından bağırsak lümeninde peristaltizm taklit olur apikal bölümünde bazı karıştırma sağlayacak VDC modele değişiklikler üzerinde çalışıyoruz. Bu nedenle, VDC modeli, özellikle, C gibi bakteriler için, daha yakından in vivo durumu taklit nedeniyle, klasik aerobik hücre kültürü yöntemi daha iyi iken sıkı bir atmosferik gereksinimleri vardır jejuni, VDC modeli hala alınması gereken bazı sınırlamaları vardırDeney tasarlama dikkate.
Verilerimiz, hücreler barındırmak için artmış bakteri yapışma özellikleri göstermiştir insan mide patojen Helicobacter pylori, çalışma için kullanılan benzer bir VDC modeli için bildirilen bulguları desteklemektedir bakteriyel virülens faktörlerinin sentezi hem de artan bir konak doğuştan gelen bağışıklık yanıtı H. artmış pylori aerobik şartlar 11 ile karşılaştırıldığında mikroaerobik altında epitel hücreleri ile kültüre edildi. H. hem de pylori ve C. jejuni büyüme için mikroaerobik koşulları gerektiren, mikroaerobik koşulları konak hücreleri ile organizmaların etkileşimi teşvik bulgu şaşırtıcı değildir. Ancak, IECS ile fakültatif anaerob Enterohemorrhagic Escherichia coli etkileşimleri analiz etmek için bir VDC sistemi kullanarak başka bir çalışma VDC apikal bölmesi 10 anaerobik / mikroaerobik kokültürü koşullar altında bakteri etkileşim yüksek düzeyde göstermiştir. Tonun anaerobik / mikroaerobik koşullarda IECS ile kültürlenmiş da atmosferik oksijen şartları altında prolifere yeteneğine sahip bakterilerin davranışı da değiştirilebilir olduğunu belirtir. Bu VDC modeli daha güvenilir bir insan bağırsak lümeninde in vivo durumu benzer koşullar altında çok farklı patojenik bakterilerin-konak etkileşimlerinin analizi için geliştirilmiş ve daha değerli bir model olduğunu göstermektedir.
Modeli açısından bakıldığında, VDC modeli vitro C. jejuni-IEC coculturing modellerinde aerobik göre avantajları ortada sahip olduğunu kanıtlamıştır. VDC modeli oluşturulan ortamı daha yakından C. sırasında insan bağırsak çevre taklit eder jejuni enfeksiyonu, etkileşim ve IECS istilacı bakteri sayısında çok önemli bir artış neden. Bu akım biçimde VDC modeli ile enterik bakterilerin etkileşimleri çalışmak için idealdir mide veya bağırsakepitel hücreleri, ama sadece iki örnek olarak, dışkı örneklerinden veya sözlü mikrobiyolojik örnekler için katı anaerobların çalışma için VDC modeli uyum potansiyel var. Önemli ilke her zaman daha yakından in vivo durumda taklit koşulları altında bu kokültürü deneyler gerçekleştirmek için amacı olması gerekir. VDC modeli C. ileri çalışmalar için önemli bir araç olacaktır jejuni konak-patojen ilişkileri ve birçok farklı bakterilerin patojenik mekanizmaların çalışma için geçerli olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Dominic Mills Bloomsbury Kolejler Doktora Bursu (2007-2010) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar VDC modeli gelişmekte olan onların yardım için Ozan Gündoğdu ve Abdi Elmi de teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
- Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
- Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
- Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. Campylobacter. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).
- Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
- Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
- Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
- Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
- Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
- Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).
