Summary
ביצוע מבחני תרבית תאים לחקירת הידבקות ופלישה חיידקים בתנאים אירוביים הוא בדרך כלל בלתי מייצג של
Abstract
האינטראקציות של חיידקים פתוגנים עם תאי מארח נחקרו בהרחבה שימוש בשיטות תרבות תאים במבחנה. עם זאת כמבחני תרבית תאים מסוג זה מבוצעים בתנאים אירוביים, אלה במודלים חוץ גופית עשויים שלא לייצג במדויק בסביבת vivo שבאינטראקציות בין המאכסן לפתוגן תתקיים. פיתחנו מודל חוץ גופית בזיהום המאפשר coculture של חיידקים ותאים מארחים בתנאי גז בינוני ושונה. לשכת דיפוזיה אנכית (VDC) מודל מחקה את התנאים במעי האנושי שבו חיידקים יהיו בתנאים של רקמות תוך חמצן נמוכים מאוד יהיה מסופק עם חמצן מזרם הדם. הצבת מקוטבת סלולרי (IEC) monolayers אפיתל במעי גדלה במוסיף Snapwell לVDC יוצרת תאי apical וbasolateral נפרדים. תא basolateral מלא בתרבית תאים בינונית, אטום וperfused עם החמצן whilst תא הפסגה מלא במרק, כל הזמן פתוח וטופחו בתנאי microaerobic. יכול להישמר גם קאקו-2 וT84 IECs בVDC בתנאים אלה ללא כל השפעות מזיקות לכאורה על הישרדות תא או שלמות שכבה. ניסויי Coculturing הופיעו עם ג שונה זני הבר מסוג jejuni וקווים שונים של חברת חשמל במודל VDC עם תנאי microaerobic בתא הפסגה לגרום reproducibly בעלייה במספר של אינטראקציה (כמעט פי 10) והתאיים (חיידקים כמעט פי 100) בהשוואה לתנאי תרבות אירוביות 1. הסביבה שנוצרה במודל VDC מחקה את הסביבה נתקל על ידי C. באופן הדוק יותר jejuni במעי האנושי, ומדגיש את החשיבות של ביצוע מבחני בזיהום חוץ גופית בתנאים המחקים באופן הדוק יותר במציאות vivo. אנו מציעים כי השימוש במודל VDC יאפשר פרשנויות חדשות של יחסי הגומלין מתערבתWeen חיידקים פתוגנים ותאי מארח.
Introduction
האינטראקציות של חיידקים פתוגנים עם תאי מארח נחקרו בהרחבה שימוש בשיטות תרבות תאים במבחנה. באמצעות מבחני כאלה סלולריים תרבות, הידבקות חיידקים לתאי מארח, זיהוי של קולטני תא מארח, תא מארח מסלולי איתות ופלישת חיידקים של תאי מארח כל נחקרו בפירוט, וכתוצאה מתצפיות רבות וחשובות. עם זאת מבחני תרבית תאים מסוג זה מבוצע בתנאים אירוביים כי לא יכול להיות נציג בסביבת vivo. מגבלה עיקרית של שימוש במודלים חוץ גופית ללמוד זיהומים במערכת העיכול היא שתנאי תרבות רמות חמצן גבוהים, כולל בדרך כלל מעדיפים הישרדות תא אוקריוטים. עם זאת תנאים בחלל המעי יהיו כמעט אנאירובי. פתוגנים מעיים בסביבת חמצן נמוכה מאוד לבטא גנים ארסיות ביטוי שינויים 2 בתנאים אירוביים. ככזה, נתונים שהושגו באמצעות תקן תא תרבות מודלים מ 'איי לתת אינדיקציה מדויקת של יחסי גומלין עם חיידקי תאי מארח.
קמפילובקטר jejuni הוא סוכן הסיבה המוביל של קיבה ומעיים חריפות חיידקים ברחבי העולם, עם תסמינים שנעו בין שלשול קל עד מעיים דלקתיים קשים. רוב ג תוצאת זיהומים במערכת העיכול jejuni לא מסובכת, עם זאת ג jejuni הוא גם הגורם המדבק המזוהה לרוב בנוירופתיה היקפית כולל תסמונת גייךבאךה (GBS). בבריטניה, הערכה הוא כי ישנם מעל 500,000 מקרים של דלקת מעיים הנגרמים על ידי C. jejuni זיהום בכל שנה עם עלות צפויה לכלכלת בריטניה של 580,000,000 £. בעולם המתפתח, ג jejuni הוא גורם מוביל לתמותה בקרב ילדים. למרות החשיבות המוטלת בספק של זיהום קמפילובקטר ועשרות שנים של מחקר, כולל ניתוח המבוסס על גנומיקה יסודי, ג פתוגנזה jejuni עדיין גרוע understOOD, בניגוד לפתוגנים אחרים מעיים כגון סלמונלה, Escherichia coli, Shigella, וVibrio cholerae. חוסר מודל חיה קטן נוח הוא אחת סיבות עיקרית לזה 3. גם בשימוש נרחב במודלים של זיהום מבחנה אינם מתאימים יותר ללימוד ג microaerophilic jejuni מאשר לפתוגנים מעיים אחרים, כי הם אנאירוביים הפקולטטיביים. בעוד ג jejuni מוכר כמחולל מחלה פולשנית, את המנגנונים של ג פלישת jejuni של תאי אפיתל במעי (IECs) עדיין אינה ברורה 4,5. ג פלישת jejuni הוכח להיות תלויה משני סיבים מיקרוסקופים, Microtubules, שילוב של שניהם או אף אחד 5. הבלבול בתחום זה הוא ככל הנראה בשל השימוש בלתי הולם בתנאים של assay חוץ גופית.
מספר מבחני תרבית תאים השונים היה בשימוש כדי לחקור את האינטראקציות של ג jejuniעם תאי מארח. קאקו-2 6, כולם היו בשימוש 407 7, וT84 8 שורות תאי INT ללמוד את ההידבקות ופלישה היכולות של ג שונה זני jejuni. עם זאת, ברמות של הידבקות ופלישה חיידקים לג jejuni עם IECs נמוך יותר באופן משמעותי מאשר לפתוגנים מעיים 9 אחרים. Coculturing של ג jejuni עם IECs בדרך כלל מתבצע בCO 2 באינקובטור בתנאים קרובים לרמות חמצן באטמוספרה, הנדרש להישרדותו של IECs. ג ביטוי גני jejuni יהיה שונה מאוד בסביבת החמצן הנמוכה של חלל המעי בהשוואה לתנאי חמצן אטמוספרי.
השימוש במערכת קאמרית דיפוזיה אנכית (VDC) פותח המאפשרת coculture של חיידקים ותאים מארחים בתנאי גז 1,10,11 בינוניות ושונה. מערכת זו מחקה את התנאים במעי האנושי שבו חיידקים יהיו בלתיתנאי דר ושל רקמות תוך חמצן נמוכים מאוד יסופקו עם חמצן מזרם הדם. monolayers חברת החשמל מקוטבות שגודלו במסנני מיקרומטר 0.4 מיוחדים הושמו לVDC יצירת תא הפסגה וbasolateral, שהיו מלא באופן אישי עם מרק חיידקים ותרבית תאים בינוני בהתאמה (איור 1). VDC הוצב לאטמוספרה משתנה חממה המכילה 85% N 2, 5% O 2, ו-CO 2 10% על 37 מעלות צלזיוס, המייצגת את התנאים אופטימליים לג jejuni. תא הפסגה נותר פתוח וחשוף לאווירת microaerobic בתוך אווירת החממה משתנה, בעוד שהתא האטום basolateral סופק עם חמצן על ידי ממשל קבוע של 5% CO 2/95% O 2 תערובת גז עם צינור מוצא מניעת הצטברות של לחץ . קאקו-2 הישרדות תא והיושרה monolayer בתנאים אלה אושרו על ידי ניטור ele transepithelialהתנגדות ctrical (TEER) על פני monolayer מעל 24 שעות כדי להוכיח קיומו של קאקו-2 monolayer התא וההפרדה הפיסית של תאי apical וbasolateral בתנאי חמצן נמוכים בתא הפסגה. TEER של monolayers בVDCs נשמר באווירת החממה משתנה (תנאי microaerobic) וברמת תא תרבות CO 2 באינקובטור (תנאים אירוביים) לא הראה הבדלים משמעותיים, המצביע על יושרה של monolayer התא בתנאים אטמוספריים שונים 1. בתנאי microaerobic, צמתים הדוקים נותרו בהווה ובמתחלק באופן שווה בין גבולות תאים עם דפוס מכתים occludin דומה לתאי קיומם תחת תנאים אירוביים 1.
האינטראקציות של ג jejuni עם קאקו-2 וT84 תאים בVDC נחקרו על ידי בחינת אינטראקציה חיידקים (הידבקות ופלישה) ופלישה. שניים ג שונה jejuni פראי סוג straiNS שמשו 1. ג jejuni 11168H הוא נגזר של hypermotile רצף הזן המקורי NCTC11168. זן 11168H מראה רמות גבוהות הרבה יותר קולוניזציה במודל הקולוניזציה אפרוח, והוא נחשב למתח מתאים לשימוש במחקרי אינטראקציה בין מאכסן לפתוגן וכך. 81-176 הוא אדם בודד והוא אחד מזני המעבדה למדו נרחב ביותר פולשניים. ג זני jejuni נוספו לתא apical של VDC או תחת תנאי microaerobic או אירוביים. אנו נצפו שיעור גבוה יותר עבור שניהם אינטראקציה ופלישה נרשמו לג jejuni בתנאי microaerobic 1. ג המוגבר אינטראקציות jejuni לא היו כתוצאה מגידול במספרי חיידקים בתנאי microaerobic 1. הנתונים אלה תומך בהשערה שלנו שסביבת החמצן הנמוכה בתא apical של VDC משפרת אינטראקציות חיידקים מארחות ומצביעה על כך שהמאפיינים פולשני של ג jejuni הוא incrהקל בתנאים אלה. זה היה הדו"ח הראשון של השימוש במודל VDC ללמוד פתוגן חיידקים חודרני ומדגיש את החשיבות של ביצוע מבחני בזיהום חוץ גופית בתנאים המחקים במצב vivo באופן הדוק יותר. מודל VDC יכול לשמש כדי לחקור את יחסי הגומלין בין מאכסן לפתוגן למיני חיידקים רבים ושונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. צמיחה של חברת החשמל monolayers על 0.4 מיקרומטר מסננים מיוחדים
- -2 קאקו תרבות תאים בתקשורת של Dulbecco חיוני שונה (DMEM) בתוספת 10% (V / V) עוברי עגל בסרום, 100 U / ml פניצילין, סטרפטומיצין מיקרוגרם / מ"ל 100 ו 1% (V / V) חומצות אמינו חיוניות ב סטנדרטי תרבות רקמות חממה ב 37 ° C ב 5% CO 2 ו 95% אוויר. זרע 4 x 10 5 קאקו-2 IECs ל0.4 מיקרומטר לסנן ולגדול לקיטוב מעל 21 ימים, שינוי בתקשורת כל 2-3 ימים.
- מדוד את TEER כדי לאשר מצב קיטוב של monolayer באמצעות מד התנגדות וולט אוהם. במחקרים שלנו, של 21 יום TEER קאקו-2 תאים שגודלו 0.4 מיקרומטר מסננים אלה הוא 700-800 Ωcm 2.
2. הכנת ג jejuni והבינוני בקטריאלי עבור assay Coculturing
- 24 שעות לפני נקודת התחלה רצויה של assay coculturing VDC, להכין צלחת אגר דם טרי של ג. jejuni ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בתנאי microaerobic (85% N 2, 5% O 2, ו-CO 2 10%) בחממת האווירה משתנה.
- במקביל, preincubate 30 מ"ל של מרק Brucella על 37 מעלות צלזיוס בתנאי microaerobic באווירת חממה משתנה.
3. הכנה ועיקור של צ'יימברס חצי VDC לפני Assay
- מחצית תאים לחלוטין לטבול VDC, כמו גם את O-טבעות והתקעים בפתרון העיקור.
- באמצעות מזרק מ"ל 20 סטרילי, שטוף את פתרון העיקור דרך פתחי הכניסה הגז בשני חצאי תאים. הימנעות מלעשות זאת עלולה לגרום לזיהום של הדגימות במהלך coculturing.
- השאר את כל הרכיבים שקועים בפתרון העיקור ל> 1 שעה.
- יש לשטוף את כל המרכיבים עם מים סטריליים טריים, באמצעות מזרק מיליליטר סטרילי עוד 20 כדי לשטוף את פתחי הכניסה הגז.
4. הכנהשל הבידוד החיידקים
- קציר חצי צלחת של ג צמיחת jejuni מהצלחת אגר הדם שהוכנה היום קודם לכן לתוך 1 מ"ל של מרק Brucella preincubated. זה אמור להניב ~ 10 10 CFU / מ"ל.
- למדוד את הצפיפות האופטית של ההשעיה החיידקים ב 600 ננומטר כדי semiquantify יחידות מושבה להרכיב חיידקים (CFUs).
- התאם את ההשעיה החיידקים לרמת הבידוד הרצויה ב4 מ"ל של מרק Brucella preincubated.
- ביצוע דילול סדרתי מהשעית חיידקים זה סופי ואחריו ציפוי של דילולים המתאימים על צלחות אגר דם בשלושה עותקים, אז לדגור על 37 מעלות צלזיוס באווירת החממה משתנה עבור 48 שעות לכמת את מספר CFUs חיידקים הנמצאים בבידוד.
5. הגדרת VDC
- מניחים את החצי התחתון של התא שטוח VDC על הספסל. Fit O-טבעת על מחצית התא התחתונה.
- ניתוק מסנן אחד הנושאים את IECs מלאהוא המנשא ולשטוף שלוש פעמים עם 400 μl של PBS סטרילי. הנח את המסנן על מחצית התא התחתון, כדי לוודא שטבעת O נשארה במקום.
- בעדינות להוריד את מחצית חדר העליון למקומו. ברגע ששני חצאי התאים הם התאספו, מהדקים יחד באמצעות טבעת מלחציים. הנח את VDC אופקי על גבי הספסל, עם שני הפתחים פונים כלפי מעלה.
- הוסף 4 מ"ל של הבידוד חיידקים לתוך המחצית הקאמרית הפסגה.
- הוסף 4 מ"ל של מדיום תרבות תא למחצית הקאמרית basolateral.
- מניחים את החתיכות בסוף לתוך הפתחים משני חצאי תאים.
6. מצרף VDC לסעפת הגז בתוך אווירת החממה משתנה
- הנח את VDC החממה לאטמוספרה משתנה בסמיכות לסעפת הגז.
- פתח את רגולטור אספקת הגז המחובר לסעפת הגז. צרף את הצינור מהסעפת לכניסת הגז במחצית הקאמרית basolateral של VDC. צרף gaהשקע של הצינור מוביל אל מחוץ לאטמוספרה משתנה חממה לאחת מהחנויות בסוף הכתבה על המחצית הקאמרית basolateral.
- סגור את השקע האחר בסוף הכתבה על המחצית הקאמרית basolateral. פתח את זרימת הגז בסעפת הגז, מקפיד לפתוח אותו באיטיות רבה, כדי למנוע לחץ גז עודף, כמו זה יכול להוביל לגירושו של מדיום basolateral.
- המטרה היא זרימת גז של בועת 1 כל 2-5 שניות. מעת לעת לבדוק את זרימת הגז במהלך הניסוי ולהתאים במידת צורך.
7. פירוק VDC לאחר Coculture
- לאחר תקופת coculture המתאימה, לסגור את רגולטור אספקת הגז המחובר לסעפת הגז. לסגור את זרימת הגז לVDC בסעפת. נתק את כניסת הגז, גז ולשקע את הפקק מVDC.
- הסר VDC מאווירת חממה משתנה. הסר את supernatants apical וbasolateral ולאחסן ב -80 ° C לsubsequenניתוח לא.
- הסר את מהדק הטבעת ובעדינות לפרק VDC. הסר את המסנן מהמחצית הקאמרית וההעברה לצלחת תרבית תאי 6 גם סטרילי. שטוף את שלוש הפעמים IECs עם 400 μl של PBS סטרילי.
- לספירה של המספר הכולל של חיידקי אינטראקציה, להוסיף 400 μl של PBS סטרילי המכיל 0.1% (V / V) טריטון X-100 לIECs ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לlyse חברת החשמל. ביצוע דילול סדרתי מlysate התא הזה ואחריו ציפוי של דילולים המתאימים על צלחות אגר דם בשלושה עותקים, אז לדגור על 37 מעלות צלזיוס באווירת החממה משתנה עבור 48 שעות לכמת את מספר האינטראקציה CFUs חיידקיים.
- לספירה של המספר הכולל של חיידקים פולשים, להוסיף 400 μl של מדיום DMEM תרבית תאים המכילים 150 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין לIECs ודגירה עבור שעה 2 בתרבות תקן רקמות חממה ב 37 ° C ב 5% CO 2 ו 95% אוויר כדי להרוג חיידקים תאיים,לאחר מכן פעל כצעד ל7.4 לעיל.
8. ניקוי VDC לאחר Coculture
לשטוף עם מים וVDC חנות סטרילי לסיבוב של ניסויים הבאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניסויי Coculturing הופיעו עם ג זן פראי סוג jejuni וIECs במודל VDC עם תנאי microaerobic בתא הפסגה הראו עלייה במספר של אינטראקציה (כמעט פי 10) ותאיים (חיידקים כמעט פי 100) בהשוואה לתנאי תרבות אירוביות בזמן אופן תלוי 1. תצפית זו הייתה לשעתק באמצעות שני ג שונה זני jejuni פראי מסוג (11168H ו81-176) ושני קווים שונים (חברת חשמל קאקו-2 ו T84), המדגיש את תקפותו של מודל VDC 1.
התוצאות המייצגות המובאות כאן הן השוואה בין מספר ג jejuni אינטראקציה עם או פולשים לתאי קאקו-2 לאחר 3, 6, או 24 שעות של coculture תחת תנאי assay או תרבית תאים סטנדרטיים בCO 2 באינקובטור (איורים 2 א 'וב') או במודל VDC עם תנאי microaerobic בcom הפסגהpartment (האיורים 2C ו-D). הנתונים עבור שני ג שונה זני הבר מסוג jejuni (11168H ו81-176) מוצגים. בתנאי תרבית התאים הסטנדרטיים המשמשים ברובם המכריע של מחקרים בספרות המדעית, <10 7 CFU נצפו אינטראקציה עם קאקו-2 תאים (איור 2 א) בהשוואה ל ~ 10 8 CFU שנצפה באינטראקציה עם תאי קאקו-2 בVDC מודל (איור 2 ג) לאחר 24 שעות. לאחר coculture במודל VDC, ~ 10 CFU 7 תאי בודדו מ- 2 קאקו תאים (איור 2 ד), בהשוואה לרק ~ 10 5 CFU תאי מבודד מ- 2 קאקו תאים (איור 2) לאחר coculture בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים עבור 24 שעות.
השוואה ישירה בין מספר ג jejuni אינטראקציה עם או פולש IECs לאחר coculture במודל VDC עם או microaerobic או אירובי קונדי tions בתא הפסגה כבר ביצע בעבר 1. שימוש בתוצאות מודל VDC בגידול באינטראקצית ג jejuni של כמעט פי 10 ועלייה בג תאי jejuni של כמעט פי 100 אחרי 24 coculture שעה 1.
איור 1. סכמטי של לשכת דיפוזיה אנכית (VDC) מודל. תאי אפיתל במעי (IECs) גדלים על 0.4 תומך סינון מיקרומטר חדיר ונוסף לVDC, ובכך ליצור פסגת ותא basolateral. תאים אלה אז יכולים להיות מותאמים באופן אינדיבידואלי ביחס לבינונית והרכב גז כדי לאפשר coculturing של IECs עם ג jejuni עם תנאי microaerobic במשטח הפסגה של IECs ותנאים אירוביים על פני שטח basolateral של IECs.
עבור: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 2. נציג תוצאות השוואת מספרים של ג 11168H או 81-176 זני הבר מסוג jejuni אינטראקציה עם (A ו-C) או פולשים (B ו-D) תאי קאקו-2 לאחר 3, 6 או 24 שעות כאשר assay coculture בוצע תחת תנאים או תרבית תאים סטנדרטיים בCO 2 באינקובטור (A ו-B) או במודל VDC עם תנאי microaerobic בתא הפסגה (C ו-D). כל הניסויים מייצג לפחות שלוש ביולוגיים משכפל שבוצע בשני עותקים בכל ניסוי. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש בשיטות תרבות תאים במבחנה כדי לחקור את יחסי הגומלין של חיידקים פתוגנים עם תאי מארח הוא טכניקה מועסקות באופן נרחב במעבדות מחקר רבות. עם זאת כמבחני תרבית תאים מסוג זה מבוצעים בתנאים אירוביים, אלה במודלים חוץ גופית עשויים שלא לייצג במדויק בסביבת vivo שבאינטראקציות בין המאכסן לפתוגן תתקיים. שימוש נרחב במודלים של זיהום מבחנה אינן מתאימים במיוחד ללימוד ג microaerophilic jejuni בהשוואה לפתוגנים מעיים אחרים, כי הם אנאירוביים הפקולטטיביים. יש בלבול רב בספרות לגבי המנגנונים של הפלישה לIECs אדם על ידי ג jejuni 4,5. אנו מציעים כי הסיבה המנגנונים של פלישה הם הבינו כל כך גרועים היא כי הדגמים במבחנה המשמשים במחקרים אלה אינם משקפים במדויק את מצב vivo. באמצעות מבחני סטנדרטיים תרבות תא, ברמהשל ג פלישת jejuni של IECs היא תמיד נמוכה מאוד 9. פיתוח מודל VDC היה התגובה שלנו כדי לטפל בבעיה זו.
הקמנו שאפשר לקיים שני קווים שונים בחברת החשמל VDC עם תנאי microaerobic במשטח הפסגה ללא תופעות מקפחות נצפו על פני תקופת 24 שעות 1. עלייה תלויה זמן של המספרים של שניהם אינטראקציה וג תאי חיידקי זן פראי סוג jejuni 11168H נצפו לאחר coculturing עם קאקו-2 IECs בVDC עם תנאי microaerobic בתא הפסגה 1. תצפיות אלה נוספות אושרו באמצעות חברת חשמל שורה שנייה (T84), כמו גם ג שני זן jejuni פראי סוג (81-176), המעיד על שום קו תא או השפעות ספציפיות חיידקי זן 1. הרמות של אינטראקציה ופלישה חיידקים גדלו אלה הביאו לתגובה מוגברת, מקוטבת מולדת חסינה מפני IECs 1. HIGרמותיה של IL-8 התגלו לאחר coculturing microaerobic, המציין כי אתגר החיידקים המוגבר משתווה תגובת מארח מוגברת. רמות גבוהות יותר של IL-8 התגלו בsupernatants basolateral השוואה לsupernatants apical, המציין כי IL-8 הפרשה על ידי IECs מתרחשת בעיקר על פני השטח מחברת חשמל basolateral. IL-8 הוא כattractant נויטרופילים, אשר יהיה של שימוש מוגבל בחלל המעי. הנתונים אלה מוכיחים כי התקנת שני compartmental של VDC גם מאפשרת זיהוי יעיל של תגובת מארח מקוטבת.
תכונות אחדות הנוגעות לצד / התקנה הטכני של דגם VDC יש לקחת בחשבון לפני החלת המודל ללמוד כל אורגניזם פתוגניים. ראשית, חייב להיות מבוגר כדי ליצור את IECs monolayer בלתי חדירה על 0.4 מיקרומטר מסננים מיוחדים. זה לוקח בין 14-21 ימים, בהתאם לקו הסלולרי בשימוש, והופך את הניסויים הממושכים למדי בהשוואה לקלסי cocultuניסויים שבוצעו בטבעת צלחות תרבית תאים ושימוש IECs גדל לבין 1-7 ימים. מצד השני, רק לאחר תקופה כה ארוכה של צמיחה יש את IECs הודגם בצורת monolayer מקוטבת באופן מלא. monolayers המקוטבת לחקות את מצב in vivo באפיתל במעי האנושי הרבה יותר הדוקה מאשר קווי חברת חשמל nonpolarized, nonconfluent משמשים בחלק מהמחקרים ובתור שכזה מספקים יתרון נוסף של מודל VDC. שנית, את מסנני מיקרומטר 0.4 המיוחדים הם באופן משמעותי יקרים יותר מאשר צלחת תרבית תאי 24 גם סטנדרטית. המגבלה העיקרית של VDC היא התפוקה הנמוכה יחסית. זאת בעיקר בשל הזמינות של VDC תאים וההתקנה המחייבת את סעפת הגז. מספרים בלבד נמוכים יחסית של מקביל משכפל ניתן לבצע בפעם אחת, בניגוד לשיטה הקלסית תרבית התאים. מודל VDC הוא לכן פחות מתאים לניסוי הקרנה בקנה מידה גדול או ניסויים הדורשים מספר גבוה של העתקTES. גורם נוסף שיש לקחת בחשבון הוא שהשפעת הכבידה של ביצוע מבחני coculture במודל VDC אומרת שחיידקים לאורך הזמן יתחילו לצבור בחלק התחתון של התא וכתוצאה מפסגת ההזדמנות מופחתת עבור אינטראקציות עם monolayer חברת החשמל. עם זאת שימוש במודל VDC, שהראינו כי האינטראקציות של nonmotile, nonaggregating 11168H rpoN מוטציה הם הצטמצמו באופן דרמטי בהשוואה לניעתי, צבירת זן פראי סוג 11168H לאחר 6 1 שעות. כרגע אנחנו עובדים על שינויים בדגם VDC שיאפשר קצת ערבוב בתא הפסגה שהייתי לחקות באופן הדוק יותר תנועת מעיים בלומן המעי. לכן, בעוד שהמודל VDC הוא טוב יותר מאשר בשיטות הקלסיים, אירובי תרבית התאים עקב מחקה באופן הדוק יותר במצב vivo, במיוחד לחיידקים כגון ג jejuni שיש להם דרישות מחמירות באטמוספרה, עדיין יש לו את מודל VDC מגבלות מסוימות שצריכות להילקחבחשבון בעת תכנון ניסויים.
הנתונים שלנו תומך בממצאים שדווחו למודל VDC דומה משמש ללמוד פילורי אנושי הקיבה הפתוגן הליקובקטר, אשר הראה הידבקות חיידקים גדלו לארח תאים, הגדילו את הסינתזה של גורמים ארסיות חיידקים, כמו גם תגובה חיסונית מוגבר מולדת מארח כאשר ח פילורי היה cocultured עם תאי האפיתל מתחת microaerobic לעומת תנאים אירוביים 11. כמו גם ה פילורי וג jejuni דורש תנאי microaerobic לצמיחה, הממצא שתנאי microaerobic לקדם את האינטראקציה של אורגניזמים עם תאי מארח מפתיע. עם זאת, מחקר אחר שמשתמש במערכת VDC לנתח את האינטראקציות של החיידק הפקולטטיביים anaerobe enterohemorrhagic Escherichia עם IECs הפגין רמות גבוהות של אינטראקציה חיידקים בתנאים אנאירוביים coculture / microaerobic בVDC פסגת התא 10. Tשלו מצביע על כך שהתנהגותם של חיידקים המסוגלים מתרבה בתנאי חמצן אטמוספרי גם השתנתה כאשר cocultured עם IECs בתנאים אנאירוביים / microaerobic. הדבר מצביע על כך שמודל VDC הוא דגם משופר ויקר ערך לניתוח של האינטראקציות בין מאכסן לפתוגן של חיידקים פתוגניים רבים ושונים בתנאים שיותר דומה לנאמנות במצב vivo בחלל מעי האדם.
מנקודת המבט של המודל, מודל VDC הוכיח את עצמו להחזיק כמה יתרונות ברורים על פני אירובי בדגמי coculturing jejuni-IEC ג חוץ גופית. הסביבה שנוצרה במודל VDC מחקה את הסביבה באופן הדוק יותר במעי האדם בג זיהום jejuni, מה שמוביל לעלייה משמעותית ביותר במספרם של חיידקים ופולשים באינטראקציה עם את IECs. מודל VDC במתכונתו הנוכחית זו הוא אידיאלי כדי לחקור את יחסי הגומלין של חיידקי מעיים בקיבה או במעיתאי אפיתל, אבל יש פוטנציאל להתאים את מודל VDC לחקר אנאירוביים מחמירים מדגימות צואה או דגימות מיקרוביולוגיות לפה, כפי שרק שתי דוגמאות. תמיד העיקרון החשוב צריך להיות לשאוף לבצע ניסויי coculture אלה בתנאים המחקים במצב vivo באופן הדוק יותר. מודל VDC יהיה כלי חשוב למחקרים נוספים של ג אינטראקציות jejuni מאכסן לפתוגן וצריכות להיות רלוונטיות למחקר של המנגנונים פתוגניים של חיידקים רבים ושונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
דומיניק מילס נתמכה על ידי בלומסברי מכללות PhD Studentship (2007-2010). המחברים מבקשים להודות לשניהם Gundogdu האוזן ועאבדי Elmi על סיועם בפיתוח מודל VDC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
- Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
- Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
- Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. Campylobacter. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).
- Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
- Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
- Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
- Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
- Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
- Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).
