Summary
Udførelse celledyrkningsassays til at undersøge bakteriel vedhæftning og invasion under aerobe forhold er normalt ikke repræsentativt for
Abstract
Vekselvirkninger bakterielle patogener med værtsceller er undersøgt omfattende anvendelse af in vitro cellekultur metoder. Men sådanne celledyrkningsassays udføres under aerobe betingelser, disse in vitro-modeller kan ikke nøjagtigt repræsentere in vivo miljø, i hvilket værtspatogene interaktioner finder sted. Vi har udviklet en in vitro model af infektion, der tillader cokultur af bakterier og værtsceller under andet medium og gassen. Lodret diffusionskammer (VDC) model efterligner betingelserne i den menneskelige tarm, hvor bakterierne vil være under betingelser med meget lavt iltindhold, mens væv kan forsynes med ilt fra blodet. Anbringelse polariserede intestinale epitelceller (IEC) monolag dyrket i Snapwell indsætter i en VDC skaber separate apikale og basolaterale rum. Den basolaterale rum er fyldt med celledyrkningsmedium, forseglet og gennemskyllet med ilt wHilst den apikale rum er fyldt med bouillon, holdes åben og inkuberet under mikroaerobe betingelser. Både Caco-2 og T84 IECS kan opretholdes i VDC under disse betingelser, uden nogen tilsyneladende skadelige virkninger på celle overlevelse eller monolag integritet. Coculturing eksperimenter udført med forskellige C. jejuni vildtypestammer og forskellige IEC linjer i VDC modellen med mikroaerobe forhold i det apikale kammer reproducerbart resultere i en stigning i antallet af interagerende (næsten 10-fold) og intracellulære (næsten 100 gange) bakterier sammenlignet aerobe dyrkningsbetingelser 1.. Miljøet skabt i VDC-modellen mere nøje efterligner miljøet stødt af C. jejuni i den menneskelige tarm og fremhæver vigtigheden af at udføre in vitro infektion assays under betingelser, der mere nøje efterligner in vivo virkelighed. Vi foreslår, at brug af VDC-modellen vil give nye fortolkninger af samspillet betlem bakterielle patogener og værtsceller.
Introduction
Vekselvirkninger bakterielle patogener med værtsceller er undersøgt omfattende anvendelse af in vitro cellekultur metoder. Brug af disse celledyrkningsassays, bakteriel vedhæftning til værtsceller, identifikation af værtscellereceptorerne, værtscelle signalveje og bakteriel invasion af værtsceller er alle blevet undersøgt i detaljer, hvilket resulterer i mange vigtige iagttagelser. Men sådanne celledyrkningsassays er udført under aerobe forhold, som måske ikke er repræsentative for in vivo miljø. En væsentlig begrænsning af in vitro-modeller, der anvendes til at studere gastrointestinale infektioner er, at dyrkningsbetingelser herunder høje iltindhold generelt går eukaryot celle overlevelse. Men forhold i tarmen vil være næsten anaerobe. Enteropatogener i en meget lav ilt miljø udtrykker virulensgener hvis ekspression ændringer under aerobe forhold 2.. Som sådan kan data ved hjælp af standard cellekultur modeller may give et forkert indikation af bakterielle interaktioner med værtsceller.
Campylobacter jejuni er den førende agens af bakteriel akut gastroenteritis på verdensplan, med symptomer, der spænder fra mild diarré til svær inflammatorisk tarmbetændelse. Størstedelen af C. jejuni infektioner resulterer i ukompliceret gastroenteritis, dog C. jejuni er også den hyppigst identificerede smitstof i perifere neuropatier, herunder Guillain-Barré syndrom (GBS). I Storbritannien anslås det, at der er over 500.000 tilfælde af enteritis forårsaget af C. jejuni-infektion hvert år med et forventet udgifter for den britiske økonomi £ 580.000.000. I udviklingslandene, C. jejuni er en førende dødsårsag blandt børn. Trods den ubestridelige betydning Campylobacter infektion og årtiers forskning, herunder en grundig genomics-baseret analyse, C. jejuni patogenese er stadig dårligt understood, i modsætning til andre enteriske patogener, såsom Salmonella, Escherichia coli, Shigella, og Vibrio cholerae. Manglen på en bekvem lille dyr model er en væsentlig årsag til dette 3. Også meget udbredt i vitro infektion modeller er mere uhensigtsmæssig for at studere mikroaerofile C. jejuni end for andre enteriske patogener, der er fakultativt anaerobe. Mens C. jejuni er anerkendt som en invasiv patogen, mekanismerne i C. jejuni invasion af tarmepitelceller (IECS) er stadig uklart 4,5. C. jejuni invasion har vist sig at være afhængig af enten mikrofilamenter, mikrotubuli, en kombination af begge eller ingen af 5. Forvirringen på dette område er sandsynligvis på grund af brugen af uhensigtsmæssig in vitro assay forhold.
Et antal forskellige cellekultur assays er blevet anvendt til at undersøge samspillet C. jejunimed værtsceller. Caco-2 6, har INT 407 7, og T84 8 cellelinier blevet benyttet til at undersøge adhæsion og invasion kapaciteter forskellig C. jejuni stammer. Men niveauet af bakteriel adhæsion og invasion for C. jejuni med IECS er dramatisk lavere end for andre enteriske patogener 9.. Den coculturing C. jejuni med IECS normalt udføres i en CO 2 inkubator under forhold tæt på atmosfærisk ilt niveauer, der kræves for overlevelse IECS. C. jejuni genekspression vil være meget forskellig i den lave ilt miljø tarmens lumen i forhold til luftens ilt forhold.
Anvendelsen af en vertikal diffusion Chamber (VDC) system er blevet udviklet, som tillader cokultur af bakterier og værtsceller under andet medium og gassen 1,10,11. Dette system efterligner betingelserne i den menneskelige tarm, hvor bakterierne vil være unDER betingelser med lavt oxygenindhold, mens væv vil blive leveret med ilt fra blodet. Polariserede IEC monolag dyrket i særlige 0.4 um filtre blev anbragt i en VDC skabe en apikal og basolaterale rum, som blev individuelt fyldt med bakteriel bouillon og celledyrkningsmedium (figur 1). VDC blev anbragt i den variable atmosfæren inkubator indeholdende 85% N2, 5% O2 og 10% CO2 ved 37 ° C, der repræsenterer optimale forhold for C. jejuni. Den apikale rum blev efterladt åbne og udsat for mikroaerobe atmosfære i den variable atmosfære kuvøse, mens den forseglede basolaterale rum blev leveret med oxygen ved konstant administration af 5% CO 2/95% O 2 gasblanding med et udløbsrør forhindrer ophobning af tryk . Caco-2-celle overlevelse og monolag integritet under disse betingelser blev bekræftet ved at overvåge transepithelial electrical modstand (TEER) over monolaget på over 24 timer at demonstrere overlevelse Caco-2 cellemonolag og fysisk adskillelse af de apikale og basolaterale rum under iltmangel i det apikale rum. Den TEER af monolag i VDCer holdes i variablen atmosfære inkubator (mikroaerobe betingelser) og i et standard cellekultur CO2-inkubator (aerobe forhold) viste ingen signifikante forskelle, hvilket indikerer integritet af cellemonolaget under forskellige atmosfæriske betingelser 1.. Under mikroaerobe forhold forblev stramme vejkryds stede og jævnt fordelt mellem cellekanterne med en occludin farvning mønster, der svarer til celler opretholdt under aerobe betingelser 1..
Interaktionerne af C. jejuni med Caco-2 og T84 celler i VDC blev undersøgt ved at vurdere bakteriel vekselvirkning (adhæsion og invasion) og invasion. To forskellige C. jejuni vildtype strains blev anvendt 1. C. jejuni 11168H er en hypermotile derivat af den oprindelige sekvens stamme NCTC11168. Den 11168H stammen viser meget højere kolonisering niveauer i en chick kolonisering model og derfor betragtes som et passende belastning at bruge for værtspatogene interaktionsundersøgelser. 81-176 er et menneske isolere og er en af de mest invasive almindeligt undersøgte laboratoriestammer. C. jejuni stammer blev tilsat til den apikale rum i en VDC under enten mikroaerobe eller aerobe betingelser. Vi observerede højere satser for både interaktion og invasion blev registreret for C. jejuni under mikroaerobe betingelser 1.. Den øgede C. jejuni interaktioner ikke var på grund af en stigning i antallet af bakterier under mikroaerobe betingelser 1.. Disse data understøtter vores hypotese, at den lave ilt miljø i det apikale rum i VDC forbedrer bakterier-vært interaktioner og viser, at de invasive egenskaber af C. jejuni er Incrlempet under disse betingelser. Dette var den første rapport om anvendelsen af VDC model til at studere en invasiv bakterielt patogen og fremhæver betydningen af at udføre in vitro infektion assays under forhold, der i højere grad efterligner in vivo situation. VDC model kunne anvendes til at studere værtspatogene interaktioner for mange forskellige bakteriearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Vækst af IEC Encellelag om Special 0,4 um filtre
- Kultur Caco-2-celler i Dulbeccos modificerede essentielle medium (DMEM) suppleret med 10% (v / v) føtalt kalveserum, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 1% (v / v) ikke-essentielle aminosyrer i en standard vævskultur inkubator ved 37 ° C i 5% CO 2 og 95% luft. Seed 4 x 10 5 Caco-2 IECS per 0,4 um filter og vokse til polarisering over 21 dage at ændre medierne hver 2-3 dage.
- Måle TEER at bekræfte polarisering status monolaget under anvendelse af en Volt Ohm modstand meter. I vores studier, Caco-2 den TEER af 21 dage celler dyrket i disse 0.4 um filtre er 700-800 Qcm 2.
2.. Fremstilling af C. jejuni og Bakteriel Medium for Coculturing Assay
- 24 timer forud for den ønskede startpunkt VDC coculturing assay forberede en frisk blod agar plade C. jejuni og inkuberes ved 37 ° C under mikroaerobe betingelser (85% N2, 5% O2 og 10% CO2) i variablen atmosfære inkubator.
- På samme tid, preincubate 30 ml brucellanæringsvæske ved 37 ° C under mikroaerobe betingelser i en variabel atmosfære inkubator.
3.. Fremstilling og sterilisering af VDC Half Chambers Forud Assay
- Fordybe VDC halv kamre samt O-ringe og stikpropper i sterilisering løsning.
- Ved hjælp af en steril 20 ml sprøjte, sterilisering opløsningen skylles gennem gasindløbene i begge halve kamre. Undladelse af dette kan resultere i forurening af prøverne under coculturing.
- Lad alle komponenter nedsænket i sterilisationsopløsning for> 1 time.
- Skyl alle delene med frisk sterilt vand, bruge en anden steril 20 ml sprøjte til at skylle gasindløbene.
4.. Forberedelseaf bakteriel Inokulum
- Harvest halv plade af C. jejuni vækst fra blodagarpladen udarbejdet den foregående dag i 1 ml af forinkubereret brucellavæske. Dette forventes at give ~ 10 10 cfu / ml.
- Mål den optiske densitet bakteriesuspensionen ved 600 nm til semiquantify bakterielle kolonidannende enheder (CFU).
- Juster bakteriesuspension til det ønskede inokulum niveau i 4 ml af forinkubereret brucellavæske.
- Udfør en seriefortynding fra denne sidste bakteriesuspension efterfulgt af udpladning af passende fortyndinger på blodagarplader i tre eksemplarer, og derefter inkuberes ved 37 ° C i den variable atmosfære inkubator i 48 timer for at kvantificere antallet af bakterielle CFU'er stede i podestoffet.
5.. Opsætning af VDC
- Placer den nederste halvdel kammer i et VDC fladt på bænken. Monter en O-ring på den nederste halvdel kammer.
- Frigør et filter bærer IECS fra tHan bærer og vaskes tre gange med 400 ul sterilt PBS. Placer filteret på den nederste halvdel kammer, og sørg for O-ringen forbliver på plads.
- Sænk forsigtigt den øvre halvdel kammer på plads. Når de to halve kamre samles, monteres sammen med ringen-klemmer. Placer VDC vandret på bordpladen, med de to åbninger vender opad.
- Tilsæt 4 ml bakteriel podestof i det apikale halvdel kammeret.
- Tilsæt 4 ml celledyrkningsmedium i den basolaterale halvdel kammeret.
- Placer endestykkerne ind i åbningerne på begge halv kamre.
6.. Montering af VDC til Gas Manifold inden Variable atmosfære Incubator
- Placer VDC i den variable atmosfæren inkubator i umiddelbar nærhed af gasforgreningen.
- Åben gasforsyningen regulatoren tilsluttet gasforgreningen. Fastgør slangen fra manifolden ind gasindgangen på basolaterale halvdel kammer VDC. Fastgør gas afløbsrør der fører ud af den variable atmosfære inkubator til en af de forretninger i endestykket på basolaterale halvdel kammer.
- Luk for anden afsætningsmulighed i den endelige brik på basolaterale halvdel kammer. Åben gasstrømmen på gas manifold, idet man åbne det meget langsomt for at undgå overskydende gastryk, da dette kan føre til udvisning af den basolaterale medium.
- Målet er en gasstrøm på 1 boble hver 2-5 sek. Kontrollér med jævne på gasstrømmen i løbet af forsøget, og juster om nødvendigt.
7.. Demontering af VDC efter cokultur
- Efter passende cokultur periode, lukke gasforsyningen regulator tilsluttet gas manifold. Luk gastilførslen til VDC på manifolden. Afbryd gasindgangen, gasudgangen og proppen fra VDC.
- Fjern VDC fra en variabel atmosfære inkubator. Fjern de apikale og basolaterale supernatanter og opbevares ved -80 ° C til subsequent analyse.
- Fjerne ringen klemmer og forsigtigt tage hinanden VDC. Fjern filteret fra den halve kammer og overføres til en steril 6-brønds cellekultur skålen. Vask IECS tre gange med 400 ul sterilt PBS.
- Til tælling af det samlede antal vekselvirkende bakterier, tilsættes 400 ul sterilt PBS indeholdende 0,1% (v / v) Triton X-100 til IECS og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur for at lysere IEC. Udfør en seriefortynding fra denne cellelysat efterfulgt af udpladning af passende fortyndinger på blodagarplader i tre eksemplarer, og derefter inkuberes ved 37 ° C i den variable atmosfære inkubator i 48 timer for at kvantificere antallet af interagerende bakterielle CFU'er.
- Til tælling af det totale antal af invaderende bakterier, tilsættes 400 ul DMEM cellekulturmedium indeholdende 150 ug / ml gentamicin til IECS og inkuberes i 2 timer i et standard vævskultur inkubator ved 37 ° C i 5% CO 2 og 95% luft til at dræbe ekstracellulære bakterier,følg derefter som for trin 7.4 ovenfor.
8.. Rengøring af VDC efter cokultur
Vask VDC med sterilt vand og opbevares til næste runde af forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Coculturing eksperimenter udført med en C. jejuni vildtypestamme og IECS i VDC model med mikroaerobe forhold i det apikale kammer har vist en stigning i antallet af interagerende (næsten 10-fold) og intracellulære (næsten 100 gange) bakterier sammenlignet aerobe dyrkningsbetingelser i en tid -afhængig måde 1.. Denne observation var reproducerbar ved hjælp af to forskellige C. jejuni vildtypestammer (11168H og 81-176) og to forskellige IEC linjer (Caco-2 og T84), fremhæver gyldigheden af VDC model 1.
De repræsentative resultater, der præsenteres her, er en sammenligning mellem antallet af C. jejuni interagere med eller invadere Caco-2-celler efter 3, 6 eller 24 hr cokultur under enten standard cellekultur assaybetingelser i en CO2-inkubator (figur 2A og B) eller i VDC model med mikroaerobe forhold i den apikale comafdeling (figur 2C og D). Data for to forskellige C. jejuni vildtypestammer (11168H og 81-176) præsenteres. Under standard cellekultur betingelser, der anvendes i de fleste undersøgelser i den videnskabelige litteratur, blev <10 7 cfu observeret interagere med Caco-2-celler (figur 2A) i forhold til ~ 10 8 cfu observeret interaktion med Caco-2-celler i VDC'et model (figur 2C) efter 24 timer. Efter cokultur i VDC-modellen, blev ~ 10 7 intracellulær cfu isoleret fra Caco-2-celler (figur 2D), sammenlignet med kun ~ 10 5 intracellulær cfu isoleret fra Caco-2-celler (figur 2B) efter cokultur under standard cellekultur betingelser for 24 timer.
En direkte sammenligning mellem antallet af C. jejuni interagere med eller invaderende IECS efter cokultur i VDC model med enten mikroaerobe eller aerob betintioner i den apikale rum er blevet udført tidligere 1.. Anvendelse af VDC model resulterer i en stigning i interaktionen C. jejuni på næsten 10 gange og en stigning i intracellulært C. jejuni på næsten 100 gange efter 24 timers cokultur 1..
Figur 1. Skematisk Lodret diffusionskammer (VDC) model. Tarmepitelceller (IECS) dyrkes på permeable 0.4 um filter understøtninger og indsættes i en VDC, således at der skabes en apikal og en basolaterale rum. Disse rum kan derefter justeres individuelt med hensyn til medium og gassammensætning at tillade coculturing af IECS med C. jejuni med mikroaerobe betingelser på den apikale overflade IECS og aerobe betingelser på basolaterale overflade IECS.
Figur 2. Repræsentative resultater sammenligne antallet af C. jejuni 11168H eller 81-176 vildtypestammer vekselvirker med (A og C) eller invadere (B og D) Caco-2-celler efter 3, 6 eller 24 timer, når den cokultur Assayet blev udført under enten standard celle dyrkningsbetingelser i et CO 2 inkubator (A og B) eller i VDC model med mikroaerobe forhold i den apikale rum (C og D). Alle forsøg repræsenterer mindst tre biologiske replikater udført i to eksemplarer på hvert forsøg. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelsen af in vitro cellekultur metoder til at studere vekselvirkninger bakterielle patogener med værtsceller er en teknik almindeligt anvendt i mange forskningslaboratorier. Men sådanne celledyrkningsassays udføres under aerobe betingelser, disse in vitro-modeller kan ikke nøjagtigt repræsentere in vivo miljø, i hvilket værtspatogene interaktioner finder sted. Den udbredte in vitro infektion modeller er særligt uhensigtsmæssigt for at studere mikroaerofile C. jejuni sammenlignet med andre enteriske patogener, der er fakultativt anaerobe. Der er betydelig forvirring i litteraturen om de mekanismer invasion af menneskelige IECS af C. jejuni 4,5. Vi foreslår, at grunden mekanismerne for invasion er så dårligt forstået, er, fordi de in vitro-modeller, der anvendes i disse undersøgelser ikke præcist afspejler in vivo situation. Anvendelse af standard celledyrkningsassays, niveauetC. jejuni invasion af IECS er altid meget lav 9.. Udviklingen af VDC-modellen var vores svar at løse dette problem.
Vi har konstateret, at to forskellige IEC linjer kan opretholdes i VDC med mikroaerobe forhold ved den apikale overflade uden observerede uheldige virkninger over en 24 timers periode 1.. En tidsafhængig stigning i antallet af både interagerende og intracellulære C. jejuni 11168H vildtypestamme bakterier blev observeret efter coculturing med Caco-2 IECS i VDC med mikroaerobe forhold i det apikale kammer 1.. Disse observationer blev yderligere bekræftet ved hjælp af en anden IEC linje (T84) samt en anden C. jejuni vildtypestamme (81-176), hvilket indikerer ingen cellelinje eller bakteriestamme særlige virkninger 1.. Disse øgede niveauer af bakteriel interaktion og invasion medførte øget, polariseret medfødte immunrespons fra IECS 1.. Highendes niveauer af IL-8 blev detekteret efter mikroaerob coculturing, hvilket indikerer, at den øgede bakteriel udfordring modsvares af en øget vært reaktion. Højere niveauer af IL-8 blev detekteret i de basolaterale supernatanter forhold til de apikale supernatanter, hvilket indikerer, at IL-8 sekretion i IECS overvejende forekommer fra den basolaterale IEC overflade. IL-8 er som en neutrofil lokkemiddel, hvilket ville være af begrænset nytte i det intestinale lumen. Disse data viser, at den to-kompartment opsætning af VDC også mulighed for en effektiv identifikation af en polariseret vært reaktion.
Flere funktioner vedrørende den tekniske / opsætning side af VDC-modellen skal overvejes før at anvende modellen til at undersøge sygdomsfremkaldende organisme. For det første skal IECS dyrkes til dannelse af en uigennemtrængelig monolag på særlige 0.4 um filtre. Dette tager mellem 14-21 dage afhængig af den anvendte celle linie og gør forsøgene forholdsvis lange i forhold til klassisk coculturing eksperimenter udført i cellekultur plader og bruge IECS bestemt til mellem 1-7 dage. På den anden side, efter sådan en lang periode med vækst kun har IECS blevet påvist at danne et fuldstændigt polariseret monolag. Sådanne polariserede monolag efterligner situationen in vivo i humane tarmepitelet meget tættere end de nonpolarized, nonconfluent IEC liner i nogle undersøgelser, og som sådan giver en anden fordel af VDC-modellen. For det andet, den særlige 0.4 um filtre er betydeligt dyrere end en standard 24-brønds cellekultur plade. Den væsentligste begrænsning ved VDC er den relativt lave gennemløb. Dette er primært på grund af tilgængeligheden af VDC kamre og opsætningen kræver gas manifold. Kun et relativt lille antal parallelle replikater kan udføres på én gang, i modsætning til den klassiske cellekultur metode. Den VDC-modellen er derfor mindre egnet til store screening eksperimenter eller forsøg, der kræver et højt antal replikates. En anden faktor til at overveje at gravitation udføre cokultur assays i VDC modellen betyder, at over tid bakterier vil begynde at aggregere ved bunden af den apikale kammer resulterer i reduceret mulighed for interaktioner med IEC monolag. Men ved hjælp af VDC-modellen, har vi vist, at samspillet mellem en nonmotile, nonaggregating 11168H rpoN mutant dramatisk er reduceret i forhold til den bevægelige, sammenstille 11168H vildtypestamme efter 6 timer 1.. Vi arbejder i øjeblikket på ændringer af VDC-model, der ville tillade en vis opblanding i apikale rum, der ville mere nøje efterligner peristaltikken i tarmen lumen. Derfor, mens VDC modellen er bedre end de klassiske, aerobe cellekultur metoder pga. nærmere efterligne in vivo-situationen, især for bakterier såsom C. jejuni, der har en strenge atmosfæriske krav VDC-modellen stadig har visse begrænsninger, der skal tagesi betragtning ved udformningen eksperimenter.
Vores data understøtter de resultater, der rapporteres til en lignende VDC model, der anvendes til at studere den humane gastriske patogen Helicobacter pylori, som viste øget bakteriel adhæsion til værtsceller, øget syntese af bakterielle virulensfaktorer samt en øget vært medfødte immunrespons, når H. pylori blev dyrket sammen med epitelceller under mikroaerobe forhold til aerobe betingelser 11. Som både H. pylori og C. jejuni kræver mikroaerobe vækstbetingelser, konstateringen af, at mikroaerobe betingelser fremmer interaktionen af organismerne med værtsceller er ikke overraskende. Men en anden undersøgelse ved hjælp af et VDC system til at analysere samspillet mellem de fakultative anaerobe enterohæmoragisk Escherichia coli med IECS viste forhøjede niveauer af bakteriel interaktion under anaerobe / mikroaerob cokultur forhold i VDC apikale rum 10.. Thans viser, at adfærden af bakterier, der er i stand til prolifererende under atmosfæriske iltforhold også ændres, når dyrket sammen med IECS under anaerobe / mikroaerob forhold. Dette antyder, at VDC modellen er en forbedret og værdifuld model for analysen af værtspatogene vekselvirkninger af mange forskellige patogene bakterier under betingelser, der mere trofast ligner in vivo-situationen i de humane tarm lumen.
Fra modellen perspektiv har VDC modellen vist sig at have nogle klare fordele i forhold til aerob in vitro C. jejuni-IEC coculturing modeller. Miljøet skabt i VDC-modellen mere nøje efterligner miljøet i den menneskelige tarmen under C. jejuni-infektion, hvilket fører til en meget betydelig stigning i antallet af bakterier interagere med og invaderer IECS. VDC-modellen i denne aktuelle format er ideel til at studere samspillet mellem enteritisbakterier med gastrisk eller intestinalepitelceller, men der er potentiale til at tilpasse VDC model for studiet af strenge anaerober fra afføringsprøver eller orale mikrobiologiske prøver, som blot to eksempler. Det vigtige princip bør altid være at tilstræbe at udføre disse cokultur eksperimenter under betingelser, mere nøje efterligner in vivo situationen. Den VDC model vil være et vigtigt redskab for yderligere undersøgelser af C. jejuni værtspatogene interaktioner og bør gælde for studiet af de patogene mekanismer af mange forskellige bakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dominic Mills blev understøttet af en Bloomsbury Colleges PhD Studentship (2007-2010). Forfatterne vil gerne takke både Ozan Gundogdu og Abdi Elmi for deres bistand til at udvikle VDC modellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
- Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
- Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
- Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. Campylobacter. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).
- Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
- Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
- Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
- Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
- Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
- Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).
