Summary
Utföra cellkulturförsök för att undersöka bakteriell adhesion och invasion under aeroba förhållanden är oftast representativt för den
Abstract
Växelverkan av bakteriella patogener med värdceller har undersökts utförligt med in vitro-metoder cellkultur. Men som sådan cellkultur analyser utförs under aeroba förhållanden, dessa in vitro-modeller inte kan korrekt representera in vivo-miljö i vilken värdpatogen interaktion äger rum. Vi har utvecklat en in vitro modell av infektion som tillåter samodling av bakterier och värdceller under olika medelstora och villkor gas. Den vertikala Diffusionskammaren (VDC) modell efterliknar förhållandena i den mänskliga tarmen där bakterier kommer att vara under förhållanden med mycket låg syrehalt medan vävnad kommer förses med syrgas från blodet. Placering polariserade intestinala epitelceller (IEC) monolager odlas i Snapwell skär in i en VDC skapar separata apikala och basolaterala fack. Den basolaterala facket fylls med cellodlingsmedium, förseglades och perfusion med syre wHilst apikala facket fylls med buljong, hålls öppna och inkuberas under mikroaerob förhållanden. Både Caco-2 och T84 IECS kan upprätthållas i VDC under dessa betingelser utan några uppenbara skadliga effekter på cellöverlevnad eller monoskikt integritet. Samodling experiment med olika C. jejuni vildtyp stammar och olika IEC linjer i VDC-modeller med mikroaerob förhållanden i den apikala facket resultera reproducerbart i en ökning av det antal samverkande (nästan 10-faldig) och intracellulära (nästan 100-faldig) bakterier jämfört med aeroba odlingsbetingelser ett. Den miljö som skapas i VDC modellen närmare efterliknar miljön möter C. jejuni i den mänskliga tarmen och betonar vikten av att utföra in vitro infektion analyser under förhållanden som närmare efterlikna in vivo verkligheten. Vi föreslår att användningen av VDC-modellen kommer att möjliggöra nya tolkningar av samspelet satsalan bakteriella patogener och värdceller.
Introduction
Växelverkan av bakteriella patogener med värdceller har undersökts utförligt med in vitro-metoder cellkultur. Med användning av sådana cellodlingsanalyser, bakteriell vidhäftning till värdceller, identifiering av receptorer värdcell värdcell signalvägar och bakteriell invasion av värdceller har alla studerats i detalj, vilket resulterade i många viktiga iakttagelser. Men sådan cellkultur analyser utförs under aeroba förhållanden som inte kan vara representativt för den in vivo-miljö. En viktig begränsning av in vitro-modeller används för att studera gastrointestinala infektioner är att odlingsbetingelser inklusive höga syrenivåer i allmänhet gynnar eukaryot cell överlevnad. Dock förhållandena i tarmlumen kommer att vara nästan anaeroba. Enteropatogener i en mycket låg syrehalt miljö uttrycka virulensgener vars uttryck förändras under aeroba förhållanden 2. Som sådan, erhölls data med hjälp av standard cellodling modeller may ge en felaktig indikation av bakteriella interaktioner med värdceller.
Campylobacter jejuni är den ledande smittämnen av bakteriell akut gastroenterit i världen, med symtom som varierar från mild diarré till svår inflammatorisk enterit. Majoriteten av C. jejuni infektioner resulterar i okomplicerad gastroenterit, men C. jejuni är också den vanligaste identifierade smittämnet i perifera neuropatier inklusive Guillain-Barrés syndrom (GBS). I Storbritannien, är det uppskattas att det finns över 500.000 fall av enterit orsakad av C. jejuni infektion varje år med en förväntad kostnad för den brittiska ekonomin på £ 580.000.000. I utvecklingsländerna, C. jejuni är en ledande orsak till dödlighet bland barn. Trots den obestridliga betydelse för Campylobacter-infektion och årtionden av forskning, inbegripet grundlig genomik-baserade analyser, C. jejuni patogenes är fortfarande dåligt understood, till skillnad från andra enterala patogener, såsom Salmonella, Escherichia coli, Shigella och Vibrio cholerae. Avsaknaden av en praktisk liten djurmodell är en viktig orsak till detta 3. Även den ofta används in vitro infektion modeller är mer olämplig för att studera mikroaerofil C. jejuni än för andra tarmpatogener som är fakultativa anaerober. Medan C. jejuni är erkänd som en invasiv patogen, mekanismerna för C. jejuni invasion av tarmepitelceller (IECS) är fortfarande oklart 4,5. C. jejuni invasion har visat sig vara beroende av antingen microfilaments, mikrotubuli, en kombination av båda eller ingen 5. Den förvirring i detta område är sannolikt beroende på användningen av olämplig in vitro analysbetingelser.
Ett antal olika cellodlingsanalyser har använts för att undersöka växelverkan av C. jejunimed värdceller. Caco-2 6, har INT 407 7, och T84 8 cellinjer alla använts för att studera adhesion och invasion hos olika C. jejuni-stammar. Emellertid, nivåerna av bakteriell adhesion och invasion för C. jejuni med IECS är dramatiskt lägre än för andra tarmpatogener 9. Den samodling av C. jejuni med IECS utförs normalt i en CO2-inkubator under betingelser nära atmosfäriska syrenivåer, krävs för överlevnaden av IECS. C. jejuni genuttryck kommer att vara mycket annorlunda i omgivning med låg syrehalt av intestinala lumen jämfört med atmosfäriska syreförhållanden.
Användningen av en vertikal diffusionskammare (VDC) har utvecklats som medger samodling av bakterier och värdceller under olika medellång och förhållanden gas 1,10,11. Detta system efterliknar förhållandena i den mänskliga tarmen där bakterier kommer att under förhållanden mycket låg syrehalt medan vävnad kommer förses med syrgas från blodet. Polariserade IEC monoskikt odlade i speciella 0,4 xm filter placerades i en VDC skapa en apikal och basolaterala fack, som var för sig fylldes med bakteriellt buljong och cellodlingsmedium respektive (Figur 1). Den VDC placerades i den variabla atmosfären inkubator innehållande 85% N 2, 5% O2, och 10% CO2 vid 37 ° C, som representerar optimala förhållanden för C. jejuni. Den apikala fack lämnades öppen och exponeras för mikroaerobisk atmosfären inuti den variabla atmosfären inkubatorn, medan det förseglade basolaterala facket var levereras med syre genom konstant administrering av 5% CO 2/95% O 2 gasblandning med ett utloppsrör förhindrar ackumulering av trycket . Caco-2-cell överlevnad och cellslager integritet under dessa betingelser bekräftades genom övervakning av transepithelial electrical motstånd (TEER) över monolagret över 24 timmar för att demonstrera överlevnad Caco-2 cellmonoskiktet och fysisk separation av de apikala och basolaterala fack under låga syreförhållanden i apikala facket. Den TEER av monoskikt i VDCs upprätthålls i variabeln atmosfären inkubator (mikroaerob förhållanden) och i en standard cellkultur CO2-inkubator (aeroba betingelser) visade inga signifikanta skillnader, vilket indikerar integritet av cellmonoskiktet under olika atmosfäriska förhållanden 1. Under mikroaerob förhållanden, fortsatt tight junctions närvarande och fördelas jämnt mellan de cellkantlinjer med en occludin färgningsmönster liknande celler upprätthålls under aeroba förhållanden 1.
De interaktioner C. jejuni med Caco-2 och T84 celler i VDC undersöktes genom att bedöma bakteriell interaktion (adhesion och invasion) och invasion. Två olika C. jejuni vildtyp strains användes 1. C. jejuni 11168H är en hypermotile derivat av den ursprungliga sekvensen stam NCTC11168. Den 11168H stammen visar mycket högre kolonisering nivåer i en chick kolonisering modell och betraktas därmed en lämplig stam att använda för värdpatogen interaktionsstudier. 81-176 är en mänsklig isolera och är en av de mest invasiva studerats ingående laboratoriestammar. C. jejuni-stammar tillsattes till den apikala avdelningen av en VDC under antingen mikroaerob eller aeroba förhållanden. Vi observerade högre priser för både interaktion och invasion registrerades för C. jejuni enligt mikroaerob villkor 1. Den ökade C. jejuni interaktioner inte var på grund av en ökning av antalet bakterier i mikroaerob villkor 1. Dessa data stöder vår hypotes att den omgivning med låg syrehalt i den apikala avdelningen av VDC förbättrar bakterier-värd interaktioner och indikerar att de invasiva egenskaper hos C. jejuni är incrlättade under dessa förhållanden. Detta var den första rapporten om användningen av VDC modell för att studera en invasiv bakteriell patogen och betonar betydelsen av att utföra in vitro infektion analyser under förhållanden som närmare efterlikna in vivo-situationen. VDC-modellen kan användas för att studera värd-patogen interaktioner för många olika bakteriearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Tillväxt av IEC Enskiktslagren på Special 0,4 um filter
- Kultur Caco-2-celler i Dulbeccos modifierade essentiella media (DMEM) kompletterat med 10% (vol / vol) fetalt kalvserum, 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin och 1% (volym / volym) icke-essentiella aminosyror i en standard vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C i 5% CO2 och 95% luft. Seed 4 x 10 5 Caco-2 IECS per 0,4 pm filtrera och växa till polarisering över 21 dagar, byta media var 2-3 dagar.
- Mät TEER att bekräfta polarisering status av monoskiktet med en Volt-Ohm motstånd meter. I våra studier, den TEER av 21 dag Caco-2-celler odlas i dessa 0,4 | im filter är 700-800 Qcm 2.
2. Framställning av C. jejuni och Bakteriell Medium för samodling analys
- 24 h före önskad startpunkt VDC samodling analysen, förbereda en färsk platta blodagar av C. jejuni och inkubera vid 37 ° C under mikroaerob förhållanden (85% N 2, 5% O2 och 10% CO 2) i den variabla atmosfären inkubatorn.
- Samtidigt, preinkubera 30 ml Brucella-buljong vid 37 ° C under mikroaerob förhållanden i en variabel atmosfär inkubator.
Tre. Förberedelse och sterilisering av VDC Half Chambers före analysen
- Helt Doppa VDC halv kammare samt O-ringar och pluggar i sterilisering lösningen.
- Med en steril 20 ml spruta, spola sterilisering lösningen genom gasinloppen i båda halva kamrarna. Underlåtenhet att göra detta kan leda till kontaminering av proverna under samodling.
- Låt alla komponenter nedsänkta i sterilisering lösningen för> 1 timme.
- Skölj alla delarna med färskt sterilt vatten, använd en annan steril 20 ml spruta för att spola gasinloppen.
4. Framställningav Bakteriell Inokulum
- Harvest halv tallrik C. jejuni tillväxt från blodet agarplatta framställdes föregående dag i 1 ml av det förinkuberade brucellabuljong. Detta bör ge ~ 10 10 cfu / ml.
- Mät den optiska tätheten av den bakteriella suspensionen vid 600 nm till semiquantify bakteriella kolonibildande enheter (CFU).
- Justera bakteriesuspension till önskad inokulum nivå i 4 ml av den förinkuberade brucellabuljong.
- Utför en serieutspädning från denna sista bakteriesuspension följt av utstrykning av lämpliga utspädningar på blodagarplattor i tre exemplar, sedan inkubera vid 37 ° C i variabeln atmosfären inkubator för 48 timmar för att kvantifiera antalet bakteriella CFU närvarande i inokulat.
Fem. Konfigurera VDC
- Placera den nedre halvan kammare i ett VDC platt på bänken. Montera en O-ring på den nedre halvan kammaren.
- Drag av ett filter som bär de IECS från than bärare och tvätta tre gånger med 400 | il av steril PBS. Placera filtret på den nedre halvan kammaren, och se till att O-ringen är på plats.
- Försiktigt sänka den övre halv kammare på plats. När de två halv-kammare monteras, klämma ihop med ringen-klämmor. Placera VDC horisontellt på bänken topp, med de två öppningar som vetter uppåt.
- Tillsätt 4 ml av bakteriell ymp i den apikala halva kammaren.
- Tillsätt 4 ml av cellodlingsmedium till den basolaterala halv kammaren.
- Placera gavlarna i öppningarna på båda halva kamrarna.
6. Fästa VDC till gasgrenröret inom Variable Atmosphere Incubator
- Placera VDC till variabeln atmosfären inkubator i nära anslutning till gasgrenröret.
- Öppna regulatorn gastillförseln ansluten till gasgrenröret. Fäst slangen från grenröret till gasinloppet på basolaterala halva kammaren av VDC. Fäst gas utloppsrör som leder ut på den rörliga atmosfären inkubatorn till en av butikerna i ändstycket på basolaterala halva kammaren.
- Stäng av andra utlopp i gaveln på basolaterala halva kammaren. Öppna gasflödet på gasgrenröret, var noga med att öppna den mycket långsamt för att undvika överskott av gastryck, eftersom detta kan leda till utstötning av basolaterala mediumet.
- Målet är ett gasflöde av 1 bubbla var 2-5 sekund. Kontrollera regelbundet på gasflödet under experimentet och justera vid behov.
7. Demontering av VDC efter Coculture
- Efter lämplig coculture perioden, stänger regulatorn gastillförseln ansluten till gasgrenröret. Stäng av gasflödet in i VDC vid grenröret. Koppla gasinloppet, gasutloppet och proppen från VDC.
- Avlägsna VDC från en variabel atmosfär inkubator. Ta bort de apikala och basolaterala överstående och förvara vid -80 ° C för subsequent analys.
- Ta bort ringen klämmor och försiktigt ta isär VDC. Avlägsna filtret från halv kammaren och överför till en steril 6-brunnars cellodlingsskål. Tvätta IECS tre gånger med 400 | il av steril PBS.
- För räkning av det totala antal samverkande bakterier, tillsätt 400 | il av steril PBS innehållande 0,1% (volym / volym) Triton X-100 till de IECS och inkubera under 20 min vid rumstemperatur för att lysera inom IEC. Utför en seriell spädning från denna cellysat följt av plätering av lämpliga utspädningar på blodagarplattor i tre exemplar, sedan Inkubera vid 37 ° C i variabeln atmosfären inkubator för 48 timmar för att kvantifiera antalet samverkande bakteriella CFU.
- För räkning av det totala antalet invaderande bakterier, tillsätt 400 | il DMEM cellodlingsmedium innehållande 150 | ig / ml gentamicin till de IECS och inkubera i 2 h i en standard vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C i 5% CO2 och 95% luft för att döda extracellulära bakterier,följ som för steg 7.4 ovan.
8. Rengöring av VDC efter Coculture
Tvätta VDC med sterilt vatten och butik för nästa omgång av experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Samodling experiment utförda med ett C. jejuni vildtypsstam och IECS i VDC-modeller med mikroaerob förhållanden i den apikala avdelningen har visat en ökning av antal samverkande (nästan 10-faldig) och intracellulära (nästan 100-faldig) bakterier jämfört med aeroba odlingsbetingelser i en tid -beroende sätt 1. Denna observation var reproducerbar använder två olika C. jejuni vildtyp stammar (11168H och 81-176) och två olika IEC linjer (Caco-2 och T84), belyser giltigheten av VDC-modeller 1.
De representativa resultat som presenteras här är en jämförelse mellan antalet C. jejuni interagera med eller invadera Caco-2-celler efter 3, 6, eller 24 timmar i samodling under antingen standardanalysförfaranden cellodlingsbetingelserna i en CO 2-inkubator (figur 2A och B) eller i VDC-modeller med mikroaerob förhållanden i den apikala compartment (figurerna 2C och D). Data för två olika C. jejuni vildtyp stammar (11168H och 81-176) presenteras. Under normala förhållanden cellodling används i de allra flesta studier i den vetenskapliga litteraturen, var <10 7 cfu observeras interagera med Caco-2-celler (Figur 2A) jämfört med ~ 10 8 cfu observerade interagera med Caco-2-celler i VDC modellen (figur 2C) efter 24 tim. Efter samodling i VDC-modellen, var ~ 10 7 intracellulär cfu isolerad från Caco-2-celler (Figur 2D), jämfört med endast ~ 10 5 intracellulär cfu isolerats från Caco-2-celler (Figur 2B) efter samodling under standardförhållanden cellodling för 24 tim.
En direkt jämförelse mellan antalet C. jejuni interagera med eller invadera IECS efter samodling i VDC-modeller med antingen mikroaerob eller aerob villkortioner i den apikala facket har utförts tidigare 1. Användning av VDC-modeller resulterar i en ökning av samverkande C. jejuni av nästan 10-faldigt och en ökning av intracellulär C. jejuni av nästan 100-faldigt efter 24 tim coculture 1.
Figur 1. Skiss över Vertikal diffusionskammaren (VDC) modell. Tarmepitelceller (IECS) odlas på genomsläppliga 0,4 um filter stöd och infogas i en VDC, vilket skapar en apikal och en basolaterala fack. Dessa fack kan därefter justeras individuellt med hänsyn till mediet och gas sammansättning att tillåta samodling av IECS med C. jejuni med mikroaerob förhållandena på apikala ytan av IECS och aeroba förhållanden vid basolateral yta IECS.
Figur 2. Representativa resultat att jämföra antal, C. jejuni 11168H eller 81-176 vildtyp stammar interagerar med (A och C) eller invadera (B och D) Caco-2-celler efter 3, 6 eller 24 timmar när samodling utfördes under antingen standard-cellodlingsbetingelser i en CO 2 inkubator (A och B) eller i VDC-modeller med mikroaerob förhållanden i den apikala facket (C och D). Alla experiment representerar minst tre biologiska replikat utförs i två exemplar i varje experiment. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av cellodling in vitro metoder för att studera interaktioner mellan bakteriella patogener med värdceller är en teknik som ofta används i många forskningslaboratorier. Men som sådan cellkultur analyser utförs under aeroba förhållanden, dessa in vitro-modeller inte kan korrekt representera in vivo-miljö i vilken värdpatogen interaktion äger rum. Den används ofta in vitro infektion modeller är speciellt olämpligt för att studera mikroaerofil C. jejuni jämfört med andra tarmpatogener som är fakultativa anaerober. Det råder stor förvirring i litteraturen om mekanismerna för invasion av mänskliga IECS av C. jejuni 4,5. Vi föreslår att orsaken mekanismerna i invasionen är så dåligt förstådd beror på att de in vitro-modeller som används i dessa studier inte korrekt återspeglar situationen in vivo. Med användning av standardtekniker cellodlingsanalyser, nivånav C. jejuni invasion av IECS är alltid mycket låg 9. Utvecklingen av VDC-modellen var vårt svar på denna fråga.
Vi har konstaterat att två olika IEC linjer kan upprätthållas i VDC med mikroaerob förhållandena vid den apikala ytan utan några observerade ofördelaktiga effekter över en 24 timmarsperiod 1. En tidsberoende ökning av antalet både samverkande och intracellulär C. jejuni 11168H vildtypsstam bakterier observerades efter samodling med Caco-2 IECS i VDC med mikroaerob förhållanden i den apikala avdelningen 1. Dessa observationer bekräftades ytterligare med användning av en andra IEC linje (T84) samt en andra C. jejuni vildtypsstam (81-176), vilket indikerar ingen cellinje eller bakteriestam särskilda effekter 1. Dessa ökade nivåer av bakteriell interaktion och invasion ledde till en ökad, polariserad medfödda immunförsvaret från IECS 1. Highennes nivåer av IL-8 upptäcktes efter mikroaerobisk samodling, vilket tyder på att den ökade bakteriella utmaningen motsvaras av ett ökat immunförsvar. Högre nivåer av IL-8 detekterades i basolaterala supernatanterna jämfört med de apikala supernatanterna, vilket indikerar att IL-8 sekretion via IECS sker huvudsakligen från den basolaterala IEC ytan. IL-8 är en neutrofila lockmedel, vilket skulle vara av begränsad nytta i intestinala lumen. Dessa data visar att två-compartmental inställningen av VDC också möjliggör effektiv identifiering av en polariserad värdsvar.
Flera funktioner beträffande tekniska / setup sidan av VDC modellen måste beaktas innan tillämpa modellen för att studera eventuella sjukdomsframkallande organism. För det första måste de IECS odlas för att bilda en ogenomtränglig monoskikt på speciella 0,4 | im filter. Det tar mellan 14-21 dagar beroende på vilken cellinje och gör experimenten ganska långa jämfört med klassisk coculturing experiment utförts på cellodlingsplattor och använda IECS odlas för mellan 1-7 dagar. Å andra sidan, endast efter en sådan lång period av tillväxt har IECS visats och bildar ett helt polariserad monolager. Sådana polariserade monoskikt härma situationen in vivo i den mänskliga tarmepitelet mycket närmare än de nonpolarized, nonconfluent IEC linjer som används i vissa studier och som sådan ger en annan fördel med VDC-modeller. Det andra, de särskilda 0,4 um filter är betydligt dyrare än en vanlig 24-brunnars cellkultur plattan. Den största begränsningen av VDC är den relativt låga genomströmning. Detta beror främst på tillgången på VDC kammare och installationen kräver gasgrenröret. Endast relativt få parallell replikat kan utföras på en gång, i motsats till den klassiska cellodling metod. VDC-modellen är därför mindre lämplig för storskalig screening experiment eller försök som kräver ett stort antal replikates. En annan faktor att beakta är att allvaret effekten av att utföra Coculture analyser i VDC-modellen innebär att över tiden bakterier börjar att samla på botten av den apikala facket resulterar i minskad möjlighet för interaktioner med IEC monoskiktet. Men med hjälp av VDC-modeller, har vi visat att samverkan mellan en orörliga, nonaggregating 11168H rpoN mutant dramatiskt minskas jämfört med den rörliga, aggregering 11168H vildtypsstam efter 6 h 1. Vi arbetar för närvarande med ändringar av VDC-modellen som skulle tillåta viss blandning i apikala facket som skulle närmare efterlikna peristaltiken i tarmen lumen. Därför, medan VDC modellen är bättre än de klassiska, aeroba metoder cellodling grund närmare efterlikna in vivo-situationen, särskilt för bakterier som C. jejuni som har en stringent atmosfäriska krav har VDC modellen fortfarande vissa begränsningar som måste tasbeaktas vid utformningen av experiment.
Våra data stöder resultaten rapporterats för ett liknande VDC modell som används för att studera den mänskliga gastric patogen Helicobacter pylori, som visade ökad bakteriell vidhäftning till värdceller, ökad syntes av bakteriella virulensfaktorer samt en ökad värd medfödda immunsvaret när H. pylori samodlades med epitelceller enligt mikroaerob jämfört med aeroba förhållanden 11. Eftersom både H. pylori och C. jejuni kräver mikroaerob förutsättningar för tillväxt, är konstaterandet att mikroaerob förhållanden främjar samspelet mellan organismerna med värdceller förvånande. Dock visade en annan studie med ett VDC system för att analysera samspelet mellan de fakultativ anaerob enterohemorragisk Escherichia coli med IECS ökade nivåer av bakteriell interaktion under anaeroba / mikroaerobisk coculture förhållandena i VDC apikala facket 10. Thans indikerar att beteendet hos bakterier som kan föröka sig under atmosfäriska syreförhållanden även ändras när samodlades med IECS under anaeroba / mikroaerob förhållanden. Detta tyder på att VDC-modellen är en förbättrad och värdefull modell för analys av värd-patogen interaktioner av många olika patogena bakterier under förhållanden som mer troget likna in vivo-situationen i de mänskliga intestinala lumen.
Från modellen perspektiv har VDC modellen visat sig ha några tydliga fördelar jämfört aerob in vitro C. jejuni-IEC samodling modeller. Den miljö som skapas i VDC modellen närmare efterliknar miljön i den mänskliga tarmen under C. jejuni infektion, vilket leder till en mycket kraftig ökning av antalet bakterier interagerar med och invadera IECS. Den VDC modell i denna nuvarande formatet är idealiskt för att studera interaktioner mellan tarmbakterier med mag-och tarmepitelceller, men det finns potential att anpassa VDC-modeller för studier av strikta anaerober från avföringsprover eller för orala mikrobiologiska prover, eftersom bara två exempel. Den viktiga principen bör alltid vara att sträva efter att utföra dessa samodling experiment under förhållanden som närmare efterlikna in vivo-situationen. VDC-modellen kommer att vara ett viktigt verktyg för fortsatta studier av C. jejuni värd-patogen interaktioner och bör vara tillämplig på studiet av de patogena mekanismerna hos många olika bakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Dominic Mills fick stöd av ett Bloomsbury Högskolor doktorand (2007-2010). Författarna vill tacka både Ozan Gundogdu och Abdi Elmi för deras hjälp i utvecklingen av VDC-modeller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
- Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
- Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
- Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. Campylobacter. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).
- Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
- Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
- Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
- Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
- Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
- Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).
