Summary
Durchführen Zellkultur-Assays zur Untersuchung von bakteriellen Adhäsion und Invasion unter aeroben Bedingungen in der Regel nicht repräsentativ für die
Abstract
Die Wechselwirkungen von bakteriellen Erregern mit Wirtszellen wurden ausgiebig mit in vitro Zellkultur Methoden untersucht. Jedoch als solche Zellkultur-Assays unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird, diese in-vitro-Modellen nicht genau den in-vivo-Umgebung, wobei der Wirt-Pathogen-Interaktionen stattfinden. Wir haben ein in vitro-Modell der Infektion, die Kokultur von Bakterien und Wirtszellen ermöglicht unter verschiedenen mittel-und Gas-Bedingungen entwickelt. Die vertikale Diffusion Chamber (VDC) Modell imitiert die Bedingungen im menschlichen Darm, wo Bakterien unter Bedingungen mit sehr niedrigen Sauerstoff während Gewebe sein wird mit Sauerstoff aus dem Blutkreislauf zugeführt werden. Platzieren polarisiert intestinalen Epithelzellen (IEC) in Monoschichten Snapwell Einsätze in einer VDC gewachsen erstellt separate apikalen und basolateralen Kompartimenten. Basolateralen Kompartiment mit Zellkulturmedium gefüllt, verschlossen und mit Sauerstoff durchströmt während die apikale Fach mit Brühe gefüllt ist, offen gehalten und inkubiert unter mikroaeroben Bedingungen. Sowohl Caco-2 und T84 IECs können im VDC unter diesen Bedingungen ohne ersichtlichen nachteilige Auswirkungen auf das Überleben der Zelle oder Monoschicht Integrität beibehalten. Cokultivierung Experimente mit verschiedenen C durchgeführt jejuni Wildtyp-Stämme und unterschiedliche IEC Linien in der VDC-Modell mit mikroaeroben Bedingungen in der apikalen Kammer reproduzierbar in einer Erhöhung der Anzahl der Interaktion (nahezu 10-fach) und intrazelluläre (fast 100-fach) Bakterien gegenüber aeroben Kulturbedingungen führen 1. Das Umfeld, in dem VDC-Modell erstellt mehr imitiert die Umwelt durch C. angetroffen jejuni im menschlichen Darm und unterstreicht die Bedeutung der Durchführung in vitro Infektion Assays unter Bedingungen, die stärker die in vivo Realität zu imitieren. Wir schlagen vor, dass die Verwendung des VDC-Modell ermöglicht neue Interpretationen der Wechselwirkungen wettenween bakterielle Erreger und Wirtszellen.
Introduction
Die Wechselwirkungen von bakteriellen Erregern mit Wirtszellen wurden ausgiebig mit in vitro Zellkultur Methoden untersucht. Mit solchen Zellkulturassays, bakterielle Adhäsion an Wirtszellen, die Identifizierung von Wirtszellen Rezeptoren Wirtszelle Signalwege und Bakterienbefall von Wirtszellen sind alle im Detail untersucht, was in vielen wichtige Beobachtungen. Jedoch sind solche Zellkultur-Assays werden unter aeroben Bedingungen, die nicht repräsentativ für die in vivo-Umgebung kann durchgeführt. Eine wesentliche Einschränkung der in-vitro-Modellen verwendet werden, um Magen-Darm-Infektionen zu studieren, ist, dass die Kultur Bedingungen, einschließlich hoher Sauerstoffgehalt im Allgemeinen bevorzugen eukaryotischen Zelle Überleben. Allerdings Bedingungen im Darmlumen wird fast anaerob. Darmpathogene in sehr sauerstoffarmen Umgebung auszudrücken Virulenz Gene, deren Expression Änderungen unter aeroben Bedingungen 2. Als solche erhaltenen Daten unter Verwendung von Standard Zellkulturmodellen may geben eine ungenaue Angabe von bakteriellen Interaktionen mit Wirtszellen.
Campylobacter jejuni ist der führende Erreger der bakteriellen akuten Gastroenteritis weltweit, mit Symptomen, die reichen von leichtem Durchfall bis zu schweren entzündlichen Darmentzündungen. Die meisten C. jejuni Infektionen führen unkomplizierten Gastroenteritis, aber C. jejuni ist auch der am häufigsten identifizierte Erreger in peripheren Neuropathien einschließlich Guillain-Barré-Syndrom (GBS). In Großbritannien wird geschätzt, dass es mehr als 500.000 Fälle von Enteritis verursacht durch C. jejuni-Infektion jedes Jahr mit einem prognostizierten Kosten für die britische Wirtschaft von £ 580.000.000. In den Entwicklungsländern, C. jejuni ist eine der Hauptursachen für die Sterblichkeit bei Kindern. Trotz der unbestrittenen Bedeutung von Campylobacter-Infektion und Jahrzehnten der Forschung, einschließlich einer gründlichen Genomik-basierte Analyse, C. jejuni Pathogenese ist noch weitgehend understood, im Gegensatz zu anderen enterischen Pathogenen wie Salmonella, Escherichia coli, Shigella und Vibrio cholerae. Der Mangel an einem geeigneten Tiermodell kleine ist ein wesentlicher Grund für diese 3. Auch die weit in vitro Infektion verwendeten Modelle sind ungeeignet für das Studium mikroaerophilen C. jejuni als für andere Darmpathogene, die fakultativ anaerob sind. Während C. jejuni als invasive Erreger, die Mechanismen von C. anerkannt jejuni Invasion von intestinalen Epithelzellen (IECs) sind noch unklar 4,5. C. jejuni Invasion hat sich gezeigt, dass in Abhängigkeit von entweder Mikrofilamente, Mikrotubuli, eine Kombination von beiden oder keiner 5. Die Verwirrung in diesem Bereich ist sehr wahrscheinlich auf die Verwendung ungeeigneter in vitro Assay-Bedingungen.
Eine Reihe von verschiedenen Zellkultur-Assays verwendet wurden, um die Wechselwirkungen zu untersuchen C. jejunimit Wirtszellen. Caco-2-6 wurden 407 INT 7 und 8 T84 Zelllinien alle verwendet worden, um die Adhäsion und Invasion Fähigkeiten verschiedener C. studieren jejuni Stämme. Jedoch sind die Werte der bakteriellen Adhäsion und Invasion von C. jejuni mit IECs sind dramatisch niedriger als bei anderen Darmpathogene 9. Die Co-Kultivierung von C. jejuni mit IECs wird normalerweise in einem CO 2-Inkubator unter Bedingungen nahe dem atmosphärischen Sauerstoff durchgeführt wird, erforderlich für das Überleben der IECs. C. jejuni Genexpression wird sehr unterschiedlich in der sauerstoffarmen Umgebung der Darmlumen gegenüber Luftsauerstoff Bedingungen.
Die Verwendung einer Vertikal Diffusionskammer (VDC-System) entwickelt worden, die erlaubt die Co-Kultivierung von Bakterien und Wirtszellen unter anderen Medium und Gas Bedingungen 1,10,11. Dieses System ahmt die Bedingungen im menschlichen Darm, wo Bakterien un wirdder Bedingungen des sehr niedrigen Sauerstoff während Gewebe wird mit Sauerstoff aus dem Blutkreislauf zugeführt werden. Polarized IEC Monoschichten in speziellen 0,4 um Filter angebaut wurden in einen VDC Schaffung einer apikalen und basolateralen Kammer, die einzeln mit bakteriellen Brühe und Zellkulturmedium bzw. (Abbildung 1) wurden gefüllt ist. Das VDC wurde in die Variable Atmosphäre Inkubator mit 85% N 2, 5% O 2 und 10% CO 2 bei 37 ° C, was optimale Bedingungen für C. platziert jejuni. Der apikale Kammer offen gelassen wurde und ausgesetzt, um die Atmosphäre innerhalb des mikroaerobe variable Atmosphäre Inkubator, während der abgedichtete basolateralen Kammer mit Sauerstoff durch konstante Verabreichung von 5% CO 2/95% O 2-Gasgemisch mit einem Auslaßrohr die Ansammlung von Druck zugeführt . Caco-2-Zell-Überleben und die Monoschicht Integrität unter diesen Bedingungen wurden durch die Überwachung der transepithelialen ele bestätigtctrical Widerstand (TEER) durch die Monoschicht über 24 h nachzuweisen Überleben des Caco-2-Zell-Monolayer und physikalische Trennung der apikalen und basolateralen Kompartimenten unter niedrigen Sauerstoffgehalt in der apikalen Kammer. Der TEER von Monoschichten in VDCs in der Variablen Atmosphäre Inkubator (mikroaeroben Bedingungen) und in einem Standard-Zellkultur CO 2-Inkubator (aeroben Bedingungen) beibehalten zeigten keine signifikanten Unterschiede, was darauf hinweist Integrität der Zellschicht unter verschiedenen atmosphärischen Bedingungen 1. Unter mikroaeroben Bedingungen blieb Tight Junctions Gegenwart und gleichmäßig zwischen den Zell-Grenzen mit einer Occludin Färbungsmusters ähnlich Zellen unter aeroben Bedingungen gehalten 1 verteilt.
Die Wechselwirkungen von C. jejuni Caco-2 und T84-Zellen in der VDC wurden durch die Bewertung bakteriellen Wechselwirkung (Adhäsion und Invasion) und Invasion untersucht. Zwei verschiedene C. jejuni Wildtyp Strains wurden 1 verwendet. C. jejuni 11168H eine hypermotile Derivat der ursprünglichen Sequenz Stamm NCTC11168. Die 11168H Stamm zeigt viel höhere Besiedlung Ebenen in einem Küken Kolonisation Modell und ist somit eine geeignete Sorte für Wirt-Pathogen-Interaktion Studien verwenden berücksichtigt. 81 bis 176 ist eine menschliche isolieren und ist eine der häufigsten untersuchten invasive Laborstämme. C. jejuni Stämme wurden zur apikalen Abteil eines VDC entweder unter mikroaeroben oder aeroben Bedingungen aufgenommen. Wir beobachteten höheren Raten sowohl für Interaktion und Invasion von C. wurden aufgezeichnet jejuni unter mikroaeroben Bedingungen 1. Die erhöhte C. jejuni-Wechselwirkungen nicht aufgrund einer Zunahme der Bakterienzahl unter mikroaeroben Bedingungen 1. Diese Daten stützen die Hypothese, dass die sauerstoffarme Umgebung in der apikalen Kammer des VDC Bakterien-Wirt-Wechselwirkungen erhöht und zeigt an, dass die invasive Eigenschaften C. jejuni sind incrgelockert unter diesen Bedingungen. Dies war der erste Bericht über die Verwendung der VDC-Modell, um eine invasive bakterielle Krankheitserreger studieren und unterstreicht die Bedeutung der Durchführung in vitro-Assays Infektion unter den Bedingungen, dass mehr genau imitieren die in vivo Situation. Das VDC Modell könnte verwendet werden, um die Wirt-Pathogen-Interaktionen für viele verschiedene Bakterienarten zu untersuchen.
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Protocol
1. Das Wachstum der IEC Monoschichten auf Spezial 0,4 um Filter
- Kultur Caco-2-Zellen in modifiziertem essentiellen Dulbecco (DMEM) mit 10% (v / v) fötalem Kälberserum, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 1% (v / v) nicht-essentielle Aminosäuren in einem ergänzt Standard-Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C in 5% CO 2 und 95% Luft. Seed 4 x 10 5 Caco-2 IECs pro 0,4 um Filter zu wachsen Polarisation über 21 Tage, die Änderung der Medien alle 2-3 Tage.
- Messen Sie den TEER der Polarisation Status der Monoschicht mit einem Volt-Ohm-Widerstand Meter bestätigen. In unseren Studien, die TEER von 21 Tage Caco-2-Zellen in diesen 0,4 um Filter gewachsen ist 700-800 Qcm 2.
2. Herstellung von C. jejuni und die bakterielle Medium für die Co-Kultivierung Assay
- 24 Stunden vor dem gewünschten Startpunkt des VDC Cokultivierung Assay, eine frische Agarplatte von C. jejuni und bei 37 ° C unter mikroaeroben Bedingungen (85% N 2, 5% O 2 und 10% CO 2) in die Atmosphäre variable Inkubator.
- Zur gleichen Zeit, vorinkubiert 30 ml der Schaf-Brühe bei 37 ° C unter mikroaeroben Bedingungen in einer Variablen Atmosphäre inkubiert.
3. Aufbereitung und Sterilisation der VDC Halbkammern Vor dem Assay
- Vollständig einzutauchen VDC Halbkammern sowie die O-Ringe und die Stecker in der Sterilisation Lösung.
- Mit einem sterilen 20 ml Spritze, spülen Sie die Lösung durch die Sterilisation Gaseinlässen in beiden Kammern die Hälfte. Andernfalls kann eine Kontamination der Proben während der Co-Kultivierung führen.
- Lassen Sie alle Komponenten in der Sterilisation Lösung für> 1 h eingetaucht.
- Spülen Sie alle Teile mit frischem sterilem Wasser, mit einem anderen sterilen 20 ml Spritze, die Gaseinlässen spülen.
4. Vorbereitungdes bakteriellen Inokulums
- Ernte Hälfte eine Platte von C. jejuni Wachstum aus dem Blut-Agar-Platte vorbereitet am Vortag in 1 ml der vorinkubierten Brucella Brühe. Dies sollte zu ~ 10 10 KBE / ml.
- Anschließend wird die optische Dichte der Bakteriensuspension bei 600 nm, um bakterielle Kolonie bildenden Einheiten (KBE) semiquantify.
- Stellen Sie die Bakteriensuspension auf die gewünschte Ebene Inokulum in 4 ml des vorinkubierten Brucella Brühe.
- Durchführen einer Verdünnungsreihe von diesem letzten Bakteriensuspension durch Plattieren der geeigneten Verdünnungen auf Blut-Agar-Platten in dreifach, dann bei 37 ° C im Brutschrank inkubieren variable Atmosphäre für 48 Stunden, um die Anzahl von Bakterien in der KBE Inokulum quantifizieren gefolgt.
5. Einrichten des VDC
- Legen Sie die untere Hälfte Kammer eines VDC flach auf der Bank. Fit einen O-Ring auf die untere Hälfte der Kammer.
- Nehmen Sie einen Filter tragen die IECs von ter Träger und dreimal mit 400 ul sterilem PBS. Setzen Sie den Filter auf der unteren Hälfte der Kammer, so dass der O-Ring an seinem Platz bleibt.
- Senken Sie die obere Hälfte Kammer einrastet. Sobald die beiden Halbkammern zusammengebaut, spannen zusammen mit den Ring-Klemmen. Legen Sie das VDC horizontal auf der Tischplatte, mit den beiden Öffnungen nach oben.
- Fügen Sie die 4 ml Bakterieninokulum in die apikale Hälfte Kammer.
- 4 ml Zellkulturmedium in der basolateralen Halbkammer.
- Legen Sie die Endstücke in die Öffnungen auf beiden Halbkammern.
6. Anbringen des VDC zur Gasversorgung in der Variable Atmosphäre Incubator
- Legen Sie das VDC in die Variable Atmosphäre Inkubator in unmittelbarer Nähe zum Gasverteiler.
- Öffnen Sie die Gaszufuhr Regler mit dem Gasverteiler. Befestigen Sie den Schlauch vom Verteiler in die Gas-Einlass auf der basolateralen Hälfte Kammer des VDC. Befestigen Sie die gas Auslassrohr, die aus der variablen Stimmung Inkubator zu einem der Auslässe in dem Endstück an der basolateralen Halbkammer.
- Schließen Sie das andere Steckdose in der Ende-Stück auf der basolateralen Halbkammer. Öffnen Sie die Gaszufuhr an der Gasverteiler, kümmert sich um sie sehr langsam öffnen, um überschüssige Gasdruck zu vermeiden, da dies zu einer Vertreibung der basolateralen Medium führen kann.
- Das Ziel ist ein Gasstrom von 1 Blase alle 2-5 sec. Regelmäßig auf den Gasstrom überprüfen im Laufe des Experiments und gegebenenfalls einstellen.
7. Demontage des VDC nach Cokultur
- Nach der entsprechenden Kokultur Zeit, schließen Sie die Gaszufuhr Regler mit dem Gasverteiler. Schließen Sie die Gaszufuhr in die VDC am Verteiler. Trennen Sie das Gas Einlass, den Gasaustritt und den Stopfen aus dem VDC.
- Entfernen Sie das VDC von einer variablen Atmosphäre Inkubator. Entfernen Sie die apikalen und basolateralen Überstände und bei -80 ° C für subsequent Analyse.
- Entfernen Sie die Ringklemmen und sanft auseinander nehmen das VDC. Entfernen Sie den Filter von der Hälfte der Kammer und den Transfer in eine sterile 6-well Zellkulturschale. Waschen Sie die IECs dreimal mit 400 ul sterilem PBS.
- Zur Zählung der Gesamtzahl der Bakterien interagieren, werden 400 ul sterilem PBS, enthaltend 0,1% (v / v) Triton X-100 zu den IECs und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur, um die IEC lysieren. Durchführen einer Verdünnungsreihe von diesem Zelllysat durch Plattieren der geeigneten Verdünnungen auf Blut-Agar-Platten in dreifach, dann bei 37 ° C im Brutschrank inkubieren variable Atmosphäre für 48 Stunden, um die Anzahl von interagierenden bakterielle KBE quantifizieren gefolgt.
- Zur Zählung der Gesamtzahl der eindringenden Bakterien, fügen Sie 400 ul DMEM Zellkulturmedium enthaltend 150 ug / ml Gentamicin den IECs und Inkubation für 2 Stunden in einem Standard-Zellkultur-Inkubator bei 37 ° C in 5% CO 2 und 95% Luft, um extrazelluläre Bakterien abzutöten,dann wie für Schritt 7.4 oben folgen.
8. Reinigung des VDC nach Cokultur
Waschen Sie die VDC mit sterilem Wasser und Speicher für die nächste Runde der Experimente.
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Representative Results
Cokultivierung Experimente mit einer C durchgeführt jejuni Wildtypstamm und IECs in der VDC-Modell mit mikroaeroben Bedingungen in der apikalen Kammer einen Anstieg in der Anzahl der Interaktion (nahezu 10-fach) und intrazelluläre (fast 100-fach) Bakterien gegenüber aeroben Kulturbedingungen in einem Zeitpunkt nachgewiesen -abhängigen Weise 1. Diese Beobachtung war reproduzierbar mit zwei verschiedenen C. jejuni Wildtypstämmen (11168H und 81-176) und zwei verschiedene IEC-Leitungen (Caco-2 und T84), Hervorhebung der Gültigkeit des Modells 1 VDC.
Die repräsentativen hier vorgestellten Ergebnisse sind ein Vergleich zwischen der Anzahl von C. jejuni Interaktion mit oder eindringenden Caco-2-Zellen nach 3, 6, oder 24 h Kokultur entweder unter Standard-Testbedingungen Zellkultur in einem CO 2-Inkubator (2A und B) oder in der VDC-Modell mit mikroaeroben Bedingungen in der apikalen comAbteilung (2C und D). Daten für zwei unterschiedliche C. jejuni Wildtypstämmen (11168H und 81-176) werden vorgestellt. Unter den üblichen Bedingungen der Zellkultur in der überwiegenden Mehrheit der in der wissenschaftlichen Literatur verwendet wurden <10 7 cfu beobachteten Interaktion mit Caco-2-Zellen (2A) im Vergleich zu ~ 10 8 cfu beobachteten Interaktion mit Caco-2-Zellen in der VDC Modell (Abbildung 2C) nach 24 Stunden. Nach Co-Kultur in dem VDC-Modell wurden ~ 10 7 cfu intrazellulären von Caco-2-Zellen (Fig. 2D), im Vergleich zu nur ~ 10 5 cfu intrazellulären von Caco-2-Zellen (Fig. 2B) nach Co-Kultur unter Standard-Zellkulturbedingungen für isoliert 24 Stunden.
Ein direkter Vergleich zwischen der Anzahl von C. jejuni Interaktion mit oder eindringenden IECs nach Kokultur im VDC Modell entweder mit oder aeroben Bedingungen mikroaerobengen in der apikalen Kammer zuvor 1 durchgeführt. Die Nutzung der VDC-Modell führt zu einer Erhöhung in Interaktion C. jejuni von fast 10-fache und eine Erhöhung der intrazellulären C. jejuni von fast 100-fach nach 24 h Kokultur 1.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des Vertical Diffusion Chamber (VDC)-Modell. Intestinalen Epithelzellen (IECs) auf durchlässigen 0,4 um Filter unterstützt gewachsen und in eine VDC, wodurch eine apikale und eine basolaterale Fach. Diese Fächer können dann individuell in Bezug auf mittel-und Gas-Zusammensetzung eingestellt werden, um die Co-Kultivierung der IECs mit C. erlauben jejuni mit mikroaeroben Bedingungen an der apikalen Oberfläche der IECs und aeroben Bedingungen bei der basolateralen Oberfläche der IECs.
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse vergleichen Zahlen von C. jejuni 11168H oder 81-176 Wildtypstämmen Interaktion mit (A und C) oder in sie einzudringen (B und D) Caco-2-Zellen nach 3, 6 oder 24 Stunden, wenn der Co-Kultur-Assay wurde entweder unter Standard-Bedingungen der Zellkultur in einer CO durchgeführt 2-Inkubator (A und B) oder in der VDC-Modell mit mikroaeroben Bedingungen in der apikalen Kammer (C und D). Alle Experimente repräsentieren mindestens drei biologische Replikate in zweifacher Ausfertigung in jedem Experiment durchgeführt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
Die Verwendung von in vitro-Zellkultur Methoden, um die Wechselwirkungen von bakteriellen Erregern mit Wirtszellen zu studieren, ist eine Technik, die weit verbreitet in vielen Forschungslabors eingesetzt. Jedoch als solche Zellkultur-Assays unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird, diese in-vitro-Modellen nicht genau den in-vivo-Umgebung, wobei der Wirt-Pathogen-Interaktionen stattfinden. Die weit verbreitete Infektion in vitro Modelle sind besonders ungeeignet für das Studium mikroaerophilen C. jejuni zu anderen enterischen Pathogenen, die fakultativ anaerob sind verglichen. Es gibt erhebliche Verwirrung in der Literatur über die Mechanismen der Invasion des menschlichen IECs von C. jejuni 4,5. Wir vermuten, dass der Grund, die Mechanismen der Invasion so schlecht verstanden werden, da die in-vitro-Modellen in diesen Studien verwendet nicht exakt widerspiegeln die in vivo Situation ist. Mit Standard-Zellkultur-Assays, die HöheC. jejuni Invasion IECs ist immer sehr niedrig 9. Die Entwicklung des VDC Modell war unsere Antwort auf dieses Problem zu beheben.
Wir haben festgestellt, dass zwei verschiedene IEC Linien im VDC mit mikroaeroben Bedingungen an der apikalen Oberfläche kann ohne beobachteten nachteiligen Effekte über einen Zeitraum von 24 Std. 1 beibehalten werden. Eine zeitabhängige Zunahme der Anzahl der sowohl wechselwirkenden und intrazelluläre C. jejuni 11168H Wildtypstamm Bakterien wurde nach Kokultur mit Caco-2 IECs im VDC mit mikroaeroben Bedingungen in der apikalen Kammer 1 beobachtet. Diese Beobachtungen wurden weiter bestätigt mit einem zweiten IEC Linie (T84) sowie eine zweite C. jejuni Wildtyp-Stamm (81 bis 176), was keine Zelllinie oder Bakterienstamm spezifischen Auswirkungen 1. Diese erhöhte bakterielle Interaktion und Invasion führte zu einem erhöhten, polarisiert angeborene Immunantwort aus der IECs 1. Higihr Spiegel von IL-8 wurden nach mikroaerobe Kokultur detektiert, was darauf hinweist, dass die erhöhte bakterielle Belastung durch eine erhöhte Wirtsantwort abgestimmt ist. Höhere Konzentrationen von IL-8 wurden in der basolateralen Überstände im Vergleich zu den apikalen Überstände detektiert, was darauf hinweist, dass die IL-8-Sekretion durch die IECs tritt vorwiegend von der basolateralen Oberfläche IEC. IL-8 als Neutrophil Lockstoff, die von begrenzter Verwendung im Darmlumen wäre. Diese Daten zeigen, dass das Zwei-Kompartiment-Einrichtung des VDC auch ermöglicht eine effiziente Identifizierung eines polarisierten Host-Reaktion.
Mehrere Merkmale in Bezug auf die technische / setup Seite des VDC Modell muss vor der Anwendung des Modells auf pathogene Organismus Studie zu prüfen. Erstens müssen die IECs sich zu einer undurchlässigen Monoschicht auf spezielle 0,4 um Filter zu bilden. Dies dauert zwischen 14-21 Tage je nach Zelllinie verwendet und macht die Experimente ziemlich lange zu klassischen cocultu VergleichRing Experimente in Zellkultur-Platten durchgeführt und mit IECs für zwischen 1-7 Tagen gewachsen. Auf der anderen Seite, nur nach einer so langen Zeit des Wachstums wurden die IECs nachgewiesen, dass sie vollständig polarisiert Monoschicht zu bilden. Solche polarisierten Monoschichten imitieren die Situation in vivo im menschlichen Darmepithel viel enger als die polarisierten, nonconfluent IEC Linien in einigen Studien verwendet und als solche stellen einen weiteren Vorteil des VDC-Modell. Zweitens sind die speziellen 0,4 um Filter deutlich teurer als ein Standard-24-Well-Zellkulturplatte. Die wichtigste Einschränkung des VDC ist die relativ geringe Durchsatz. Dies ist vor allem auf die Verfügbarkeit von VDC Kammern und das Setup erfordern den Gasverteiler. Nur der relativ geringen Anzahl von parallel repliziert können gleichzeitig durchgeführt werden, im Gegensatz zu der klassischen Methode Zellkultur. Die VDC-Modell ist daher weniger geeignet für groß angelegte Screening-Experimente oder Versuche, die eine hohe Anzahl von Replikates. Ein weiterer Aspekt ist, dass die Wirkung der Schwerkraft zur Durchführung Kokultur Assays in der VDC-Modell bedeutet, dass im Laufe der Zeit Bakterien zu aggregieren an der Unterseite der apikalen Kammer zu einer reduzierten Möglichkeit zur Wechselwirkung mit der IEC Monoschicht zu starten. Doch mit dem VDC-Modell haben wir gezeigt, dass die Wechselwirkungen eines unbewegliche, nichtaggregatsbildende 11168H rpoN Mutante dramatisch an den beweglichen reduziert im Vergleich, Aggregation 11168H Wildtyp-Stamm nach 6 h 1. Wir arbeiten derzeit an Änderungen am Modell VDC, mit denen eine gewisse Vermischung in der apikalen Fach, genauer nachahmen würde Peristaltik im Darm Lumen würde. Deshalb während der VDC-Modell ist besser als die klassischen, Aerobic Zellkulturverfahren aufgrund genauer imitiert die in vivo Situation, vor allem für Bakterien wie C. jejuni, die eine stringente atmosphärische Anforderungen haben, die VDC Modell hat noch gewisse Einschränkungen, die ergriffen werden müssen,Berücksichtigung bei der Gestaltung Experimente.
Unsere Daten unterstützen die Ergebnisse für eine ähnliche VDC-Modell verwendet, um den menschlichen Magen-Erreger Helicobacter pylori, die eine erhöhte bakterielle Adhäsion an Wirtszellen zeigte Studie berichtet, erhöhte Synthese von Virulenzfaktoren sowie eine erhöhte Host angeborenen Immunantwort bei H. pylori wurde mit Epithelzellen unter mikroaeroben Vergleich zu aeroben Bedingungen 11 kokultiviert. Da sowohl H. pylori und C. jejuni erfordern mikroaeroben Bedingungen für Wachstum, ist die Feststellung, dass mikroaeroben Bedingungen das Zusammenspiel der Organismen fördern mit Wirtszellen nicht überraschend. Jedoch zeigte eine andere Studie mit einer VDC-System, um die Wechselwirkungen der fakultativ anaerob enterohämorrhagischen Escherichia coli mit IECs analysieren erhöhte bakterielle Interaktion unter anaeroben / mikroaeroben Kokultur Bedingungen im VDC apikalen Kammer 10. Tseine zeigt an, dass das Verhalten der Bakterien, die in der Lage ist proliferierenden unter Luftsauerstoff Bedingungen auch geändert wird, wenn mit IECs unter anaeroben / mikroaeroben Bedingungen co-kultiviert werden. Dies deutet darauf hin, dass der VDC-Modell eine verbesserte und wertvolles Modell für die Analyse der Wirt-Pathogen-Interaktionen von vielen pathogenen Bakterien unter Bedingungen, die getreuer die in vivo Situation in den menschlichen Darmlumen ähneln.
Von dem Modell Perspektive hat die VDC-Modell erwies sich einige klare Vorteile gegenüber aeroben in vitro C. jejuni-IEC Cokultivierung Modelle besitzen. Das Umfeld, in dem VDC-Modell erstellt mehr imitiert die Umwelt im menschlichen Darm während C. jejuni-Infektion, was zu einer sehr deutlichen Anstieg der Zahl der Bakterien die Interaktion mit und die eindringenden IECs. Das VDC Modell in diesem aktuellen Format ist ideal, um die Wechselwirkungen von Darmbakterien mit studieren Magen-Darm-Epithelzellen, aber es ist das Potenzial, die VDC Modell für die Untersuchung der strengen Anaerobier aus Stuhlproben oder zur oralen mikrobiologischen Proben anzupassen, da nur zwei Beispiele. Der wichtigste Grundsatz sollte immer sein, wollen diese Kokultur Experimente unter Bedingungen durchzuführen, dass mehr genau imitieren die in vivo Situation. Die VDC-Modell wird ein wichtiges Instrument für weitere Studien von C. sein jejuni Wirt-Pathogen-Interaktionen und sollte für die Untersuchung der pathogenen Mechanismen vieler verschiedener Bakterien.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Dominic Mills wurde von einem Bloomsbury Colleges Doktoratsstipendium (2007-2010) unterstützt. Die Autoren möchten sowohl Ozan Gundogdu und Abdi Elmi für ihre Unterstützung bei der Entwicklung des VDC Modell danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
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