Summary
Uitvoeren celkweektesten voor het onderzoeken bacteriële adhesie en invasie onder aërobe omstandigheden is meestal niet representatief van de
Abstract
De interacties van bacteriële pathogenen met gastheercellen zijn uitgebreid onderzocht met in vitro celkweek werkwijzen. Maar als zodanig celkweekbepalingen worden uitgevoerd onder aërobe omstandigheden, die in vitro modellen kunnen niet nauwkeurig te vertegenwoordigen in vivo omgeving waarin de gastheer-pathogeen interacties plaatsvinden. Wij hebben een in vitro model van infectie die de co-cultuur van bacteriën en gastheercellen maakt onder verschillende middelgrote en gas omstandigheden ontwikkeld. De verticale Diffusion kamer (VDC) model bootst de omstandigheden in de menselijke darm waar bacteriën onder omstandigheden van lage zuurstof terwijl weefsel worden van zuurstof uit het bloed. Het plaatsen van gepolariseerde darmepitheelcel (IEC) monolagen gegroeid in Snapwell voegt in een VDC creëert aparte apicale en basolaterale compartimenten. De basolaterale compartiment wordt gevuld met celcultuurmedium, verzegeld en perfusie met zuurstof wHilst het apicale compartiment is gevuld met bouillon, open gehouden en geïncubeerd onder micro-aërobe omstandigheden. Zowel Caco-2 en T84 IECs kunnen de VDC wordt onder deze omstandigheden gehouden zonder duidelijke nadelige effecten op celoverleving of monolaag rechtschapen. Coculturing experimenten uitgevoerd met verschillende C. jejuni wild-type stammen en verschillende IEC lijnen in de VDC model met micro-aërobe omstandigheden in het apicale compartiment reproduceerbaar leiden tot een toename van het aantal interactie (bijna 10-voudig) en intracellulaire (bijna 100-voudig) vergeleken met aërobe bacteriën kweekomstandigheden 1. De omgeving gecreëerd in het VDC model nauwer bootst de omgeving ondervonden door C. jejuni in de menselijke darm en benadrukt het belang van het uitvoeren van in-vitro-infectie testen onder omstandigheden die beter na te bootsen de in vivo werkelijkheid. Wij stellen voor dat het gebruik van het VDC-model zal toelaten nieuwe interpretaties van de interacties weddenWeen bacteriële pathogenen en gastheercellen.
Introduction
De interacties van bacteriële pathogenen met gastheercellen zijn uitgebreid onderzocht met in vitro celkweek werkwijzen. Het gebruik van dergelijke celkweek testen bacteriële hechting aan gastheercellen geïdentificeerd gastheercel receptoren gastheercel signaalwegen en bacteriële invasie van gastheercellen zijn allemaal in detail bestudeerd, waardoor veel belangrijke observaties. Maar zoals celkweektesten worden uitgevoerd onder aërobe omstandigheden die mogelijk niet representatief voor de in vivo omgeving. Een belangrijke beperking van in vitro modellen gebruikt om gastro-intestinale infecties studeren is dat de kweekomstandigheden, zoals hoge zuurstofgehalte in het algemeen voorstander van eukaryote cel overleving. Echter omstandigheden in de intestinale lumen vrijwel anaërobe. Darmpathogenen in een zeer lage zuurstof omgeving uiten virulentie genen waarvan de expressie veranderingen onder aërobe omstandigheden 2. Als zodanig verkregen middels standaard celcultuurmodellen may geven een onjuiste indicatie van bacteriële interacties met gastheercellen.
Campylobacter jejuni is de belangrijkste verwekker van bacteriële acute gastro-enteritis wereldwijd, met symptomen die variëren van milde diarree tot ernstige inflammatoire enteritis. De meeste C. jejuni infecties resulteren in ongecompliceerde gastro-enteritis, maar C. jejuni is ook de meest aangewezen besmettelijke agent in perifere zenuwaandoeningen waaronder Guillain-Barre syndroom (GBS). In het Verenigd Koninkrijk, wordt geschat dat er meer dan 500.000 gevallen van enteritis veroorzaakt door C. jejuni infectie elk jaar met een voorspelde kosten voor de Britse economie van £ 580.000.000. In de derde wereld, C. jejuni is een belangrijke oorzaak van sterfte onder kinderen. Ondanks het onbetwistbare belang van Campylobacter infectie en tientallen jaren van onderzoek, met inbegrip van gedegen genomics-gebaseerde analyse, C. jejuni pathogenese is nog steeds slecht understood, in tegenstelling tot andere enterische pathogenen zoals Salmonella, Escherichia coli, Shigella en Vibrio cholerae. Het ontbreken van een geschikte kleine diermodel is een belangrijke reden hiervoor 3. Ook de gebruikte in vitro infectiemodellen zijn ongeschikt voor het bestuderen Microaërofiele C. jejuni dan voor andere darmpathogenen die facultatieve anaërobe zijn. Hoewel C. jejuni wordt erkend als een invasieve ziekteverwekker, de mechanismen van C. jejuni invasie van intestinale epitheelcellen (IECs) zijn nog onduidelijk 4,5. C. jejuni invasie is aangetoond dat afhankelijk of microfilamenten, microtubuli, een combinatie van beide of geen 5. De verwarring in dit gebied is hoogstwaarschijnlijk het gevolg van het gebruik van ongeschikte in vitro assay omstandigheden.
Een aantal verschillende celkweek assays werden gebruikt om de interacties van C. onderzoeken jejunimet gastheercellen. Caco-2 6, 7 INT 407 en T84 8 cellijnen allen toegepast om de hechting en invasie capaciteiten van verschillende C. bestuderen jejuni stammen. De niveaus van bacteriële adhesie en invasie van C. jejuni met IECs zijn dramatisch lager dan bij andere darmpathogenen 9. De coculturing van C. jejuni met IECs wordt gewoonlijk uitgevoerd in een CO2 incubator onder omstandigheden dicht bij atmosferische zuurstof, noodzakelijk voor de overleving van IECs. C. jejuni genexpressie zal heel anders zijn in de zuurstofarme omgeving van het darmlumen in vergelijking met atmosferische zuurstof voorwaarden.
Het gebruik van een verticale Diffusion kamer (VDC) systeem ontwikkeld waarbij de co-cultuur van bacteriën en gastheercellen onder verschillende medium en gascondities 1,10,11 toelaat. Dit systeem bootst de omstandigheden in de menselijke darm waar bacteriën un zalder problemen van zeer lage zuurstof terwijl weefsel worden van zuurstof uit het bloed. Gepolariseerde IEC monolagen gekweekt in speciale 0,4 urn filters werden geplaatst in een VDC creëren van een apicale en basolaterale compartiment, die individueel werden gevuld met bacteriële bouillon respectievelijk celkweekmedium (figuur 1). De VDC werd geplaatst in de variabele atmosfeer incubator bevattende 85% N2, 5% O2 en 10% CO2 bij 37 ° C, hetgeen optimale condities voor C. jejuni. De apicale compartiment open gelaten en blootgesteld aan het micro-aërobe atmosfeer binnen de variabele atmosfeer incubator, terwijl de verzegelde basolaterale compartiment werd zuurstof voorzien door een constante toediening van 5% CO 2/95% O 2 gasmengsel met een uitlaatbuis voorkomen accumulatie van druk . Caco-2 cel overleving en monolaag integriteit onder deze omstandigheden werden bevestigd door het toezicht op de transepitheliaal electrical weerstand (TEER) over de monolaag gedurende 24 uur voor het overleven van de Caco-2 cel monolaag en fysische scheiding van de apicale en basolaterale compartimenten onder lage zuurstofgehalte in het apicale compartiment tonen. De TEER monolagen in VDCs daarvan in de atmosfeer incubator variabele (micro-aërobe omstandigheden) en in een standaard celkweek CO2 incubator (aerobe omstandigheden) toonde geen significante verschillen, wat aangeeft integriteit van de cel monolaag onder verschillende weersomstandigheden 1. Onder microaerobe omstandigheden, krappe kruispunten bleef aanwezig en gelijkmatig verdeeld tussen de randen van cellen met een occludin kleuringspatroon vergelijkbaar met cellen gehandhaafd onder aërobe omstandigheden 1.
De interacties van C. jejuni met Caco-2 en T84 cellen in de VDC werden onderzocht door het beoordelen bacterie interacties (adhesie en invasie) en invasie. Twee verschillende C. jejuni wild-type strains werden 1. C. jejuni 11168H is een hypermotile afgeleide van de oorspronkelijke volgorde stam NCTC11168. De 11168H stam toont veel hogere kolonisatie niveaus in een kuiken kolonisatie model en wordt dus beschouwd als een geschikte stam te gebruiken voor gastheer-pathogeen interactie studies. 81-176 is een menselijke isoleren en is een van de meest ingrijpende uitgebreid bestudeerd laboratoriumstammen. C. jejuni stammen werden aan het apicale compartiment van een VDC onder hetzij microaerobe of aërobe omstandigheden. We waargenomen hogere tarieven voor zowel de interactie en de invasie werden geregistreerd voor C. jejuni onder micro-aërobe omstandigheden 1. De toegenomen C. jejuni interacties niet door een toename in bacteriële aantallen onder micro-aërobe omstandigheden 1. Deze gegevens ondersteunt onze hypothese dat het zuurstofarme omgeving in het apicale compartiment van de VDC verbetert bacterie-gastheer interacties en geeft aan dat de invasieve eigenschappen van C. jejuni zijn incrversoepeld onder deze omstandigheden. Dit was het eerste verslag van het gebruik van het VDC-model om een invasieve bacteriële pathogenen bestuderen en benadrukt het belang van het uitvoeren van in-vitro-infectie testen onder omstandigheden die beter na te bootsen de in vivo situatie. De VDC model kan worden gebruikt om gastheer-pathogeen interacties voor vele verschillende bacteriële species te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Groei van IEC Monolayers op Special 0.4 micrometer Filters
- Cultuur Caco-2 cellen gemodificeerd essentieel medium van Dulbecco (DMEM) gesupplementeerd met 10% (v / v) foetaal kalfsserum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 1% (v / v) niet-essentiële aminozuren in een standaard weefselkweek incubator bij 37 ° C in 5% CO2 en 95% lucht. Seed 4 x 10 5 Caco-2 IECs per 0,4 micrometer filteren en te groeien tot polarisatie meer dan 21 dagen, het veranderen van de media om de 2-3 dagen.
- Meet de TEER tot polarisatie toestand van de monolaag met een Volt-Ohm weerstand meter bevestigen. In onze studies, de TEER van 21 dagen Caco-2 cellen die in deze 0,4 pm filters 700-800 Qcm 2.
2. Bereiding van C. jejuni en de Bacteriële Medium voor de Coculturing Assay
- 24 uur voorafgaand aan de gewenste startpunt van de VDC coculturing assay, bereiden een vers bloed agar plaat van C. jejuni en incubeer bij 37 ° C onder micro-aërobe omstandigheden (85% N2, 5% O2 en 10% CO2) in de atmosfeer variabele incubator.
- Tegelijkertijd, preincubate 30 ml van Brucella-bouillon bij 37 ° C onder micro-aërobe omstandigheden in een variabele atmosfeer incubator.
3. Bereiding en Sterilisatie van de VDC Half Chambers Vóór de Assay
- Volledig onderdompelen VDC half kamers evenals de O-ringen en de pluggen in de sterilisatie-oplossing.
- Met behulp van een steriele 20 ml spuit, spoelen de sterilisatie oplossing door de gasinlaten in beide halve kamers. Als u dit niet doet, kan dit leiden tot verontreiniging van de monsters tijdens coculturing.
- Voeg alle componenten ondergedompeld in de sterilisatieoplossing gedurende> 1 uur.
- Spoel alle onderdelen met verse steriel water, met behulp van een andere steriele 20 ml spuit om de gasinlaten spoelen.
4. Voorbereidingvan de bacteriële Inoculum
- Oogst een halve plaat van C. jejuni groei van de bloedagarplaat bereid de vorige dag tot 1 ml van het gepreïncubeerde brucella bouillon. Dat zou tot ~ 10 10 cfu / ml.
- Meet de optische dichtheid van de bacteriële suspensie bij 600 nm om bacteriële kolonie vormende eenheden (CFU) semiquantify.
- Stel de bacteriesuspensie het gewenste niveau inoculum in 4 ml van het gepreïncubeerde brucella bouillon.
- Voer een seriële verdunning van deze laatste bacteriesuspensie gevolgd door uitplaten van geschikte verdunningen op bloed agar platen in drievoud vervolgens incuberen bij 37 ° C in de atmosfeer variabele incubator gedurende 48 uur om het aantal bacteriële CFU's in de inoculum kwantificeren.
5. Het opzetten van het VDC
- Plaats de onderste helft kamer van een VDC plat op de bank. Past een O-ring op de onderste helft kamer.
- Detacheren een filter die de IECs van thij drager en drie keer wassen met 400 pi steriel PBS. Plaats het filter op de onderste helft kamer, zorg ervoor dat de O-ring op zijn plaats blijft.
- Voorzichtig lager de bovenste helft kamer op zijn plaats. Zodra de twee halve kamers worden gemonteerd, klemmen aan elkaar met behulp van de ring-klemmen. Plaats de VDC horizontaal op het werkblad met de twee openingen naar boven.
- Voeg de 4 ml van bacteriële inoculum in de apicale helft kamer.
- Voeg 4 ml van celcultuurmedium in de basolaterale halve kamer.
- Leg de eindstukken in de openingen aan beide halve kamers.
6. De VDC binnen de variabele Sfeer Incubator verbonden aan de Gas Manifold
- Plaats de VDC in de variabele lucht incubator dicht bij de gasspruitstuk.
- Open de gastoevoer regelaar aangesloten op het gas spruitstuk. Bevestig de buis van het spruitstuk in de gastoevoer op de basolaterale helft kamer van de VDC. Bevestig de gas afvoerpijp leidt uit van de variabele sfeer incubator op een van de verkooppunten in het eindstuk op de basolaterale halve kamer.
- Sluit de andere outlet in het eindstuk op de basolaterale halve kamer. Open de gasstroom op het gas spruitstuk, de zorg om het te openen heel langzaam om het overtollige gasdruk te vermijden, omdat dit kan leiden tot verdrijving van de basolaterale medium.
- Het doel is een gasstroom van 1 bubble om de 2-5 sec. Controleer regelmatig op de gasstroom in de loop van het experiment en eventueel aanpassen.
7. Demontage van de VDC na Coculture
- Na de juiste coculture periode, sluit de gastoevoer regulator aangesloten op het gas spruitstuk. Sluit de gastoevoer naar de VDC op het spruitstuk. Koppel de gas inlaat, de gas-uitlaat en de stop van de VDC.
- Verwijder het VDC van een variabele sfeer incubator. Verwijder de apicale en basolaterale bovenstaande vloeistoffen en bewaar bij -80 ° C voor subsequent analyse.
- Verwijder de ring klemmen en voorzichtig uit elkaar te halen de VDC. Verwijder het filter uit de halve kamer en overbrengen in een steriele 6-well celkweek schotel. De IECs drie keer wassen met 400 pi steriel PBS.
- Voor de telling van het totaal aantal bacteriën interactie, voeg 400 pl steriel PBS dat 0,1% (v / v) Triton X-100 aan de IECs en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur om de IEC lyseren. Voer een seriële verdunning van het cellysaat gevolgd door uitplaten van geschikte verdunningen op bloed agar platen in drievoud vervolgens incuberen bij 37 ° C in de atmosfeer variabele incubator gedurende 48 uur om het aantal interactie bacteriële CFU kwantificeren.
- Voor de telling van het aantal binnendringende bacteriën, voeg 400 ul DMEM-celkweekmedium bevattende 150 ug / ml gentamicine de IECs en incubeer gedurende 2 uur in een standaard weefselkweek incubator bij 37 ° C in 5% CO2 en 95% lucht te extracellulaire bacteriën te doden,dan volgen als bij stap 7.4 hierboven.
8. Het reinigen van de VDC na Coculture
Was de VDC met steriel water en slaan voor de volgende ronde van experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Coculturing experimenten uitgevoerd met een C. jejuni wildtype en IECs in de VDC model met micro-aërobe omstandigheden in het apicale compartiment een toename van het aantal interactie (bijna 10-voudig) en intracellulaire (bijna 100-voudig) vergeleken met aërobe bacteriën kweekomstandigheden in een tijd aangetoond afhankelijke wijze 1. Deze observatie was reproduceerbaar gebruik van twee verschillende C. jejuni wild-type stammen (11168H en 81-176) en twee verschillende IEC lijnen (Caco-2 en T84), aandacht voor de geldigheid van het VDC-model 1.
De representatieve studieresultaten een vergelijking tussen het aantal C. jejuni interactie met of invasie Caco-2 cellen na 3, 6 of 24 uur van de co-cultuur onder standard celkweek testomstandigheden in een CO2 incubator (figuur 2A en B) of in de VDC model met micro-aërobe omstandigheden in de apicale comcompartiment (figuur 2C en D). Gegevens voor twee verschi jejuni wild-type stammen (11168H en 81-176) worden gepresenteerd. Onder de standaard celkweekomstandigheden in de meeste studies in de wetenschappelijke literatuur, <10 7 cfu waargenomen interactie met Caco-2-cellen (Figuur 2A) tegenover ~ 10 8 cfu waargenomen interactie met Caco-2-cellen in de VDC model (figuur 2C) na 24 uur. Na co-kweek in de VDC model werden 10 ~ 7 intracellulaire cfu geïsoleerd van Caco-2 cellen (Figuur 2D), tegenover slechts ~ 10 5 cfu intracellulaire geïsoleerd van Caco-2 cellen (Figuur 2B) na co-cultuur onder standaard celkweekomstandigheden voor 24 hr.
Een directe vergelijking tussen het aantal C. jejuni interactie met of binnenvallende IECs na coculture in het VDC-model met ofwel microaerobe of aërobe omstandighedenties in het apicale compartiment is eerder 1 uitgevoerd. Gebruik van de VDC model leidt tot een toename van interactie C. jejuni bijna 10-voudige en een toename van intracellulair C. jejuni van bijna 100-voudig na 24 uur coculture 1.
Figuur 1. Schema van de verticale Diffusion Kamer (VDC) model. Intestinale epitheelcellen (IECs) worden geteeld op doorlatende 0,4 um filter steunen en ingevoegd in een VDC, waardoor een apicale en een basolaterale compartiment. Deze compartimenten kunnen dan individueel worden ingesteld met betrekking tot middelgrote en gassamenstelling voor de coculturing van de IECs mogelijk met C. jejuni met micro-aërobe omstandigheden op het apicale oppervlak van de IECs en aërobe omstandigheden in het basolaterale oppervlak van de IECs.
Figuur 2. Representatieve resultaten vergelijken van aantallen C. jejuni 11168H of 81-176 veldstammen interactie met (A en C) of binnen te dringen (B en D) Caco-2 cellen na 3, 6 of 24 uur als de co-cultuur assay werd uitgevoerd onder standard celkweek omstandigheden in een CO 2 incubator (A en B) of in het VDC-model met micro-aërobe omstandigheden in het apicale compartiment (C en D). Alle experimenten ten minste drie biologische repliceert uitgevoerd in tweevoud in elk experiment. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van in vitro celcultuur methoden om de interacties van bacteriële pathogenen bij gastheercellen studie is een techniek veel toegepast in vele laboratoria. Maar als zodanig celkweekbepalingen worden uitgevoerd onder aërobe omstandigheden, die in vitro modellen kunnen niet nauwkeurig te vertegenwoordigen in vivo omgeving waarin de gastheer-pathogeen interacties plaatsvinden. De gebruikte in vitro infectie modellen zijn vooral geschikt voor het bestuderen Microaërofiele C. jejuni vergelijking met andere enterische pathogenen die facultatieve anaëroben zijn. Er is veel verwarring in de literatuur met betrekking tot de mechanismen van de invasie van de menselijke IECs door C. jejuni 4,5. Wij stellen voor dat de reden dat de mechanismen van de invasie zijn zo slecht begrepen is, omdat het in vitro modellen die in deze studies niet nauwkeurig de in vivo situatie. Met behulp van standaard celkweek assays, het niveauof C. jejuni invasie van IECs is altijd erg laag 9. De ontwikkeling van het VDC-model was onze reactie op deze kwestie aan te pakken.
We hebben vastgesteld dat twee verschillende IEC lijnen in de VDC met micro-aërobe omstandigheden op het apicale oppervlak kan worden gehandhaafd zonder waargenomen nadelige effecten over een 24 uurs periode 1. Een tijdsafhankelijke toename van het aantal zowel interagerende en intracellulaire C. jejuni 11168H wildtype bacteriën werd waargenomen na coculturing met Caco-2 IECs in de VDC met micro-aërobe omstandigheden in het apicale compartiment 1. Deze waarnemingen werden verder bevestigd met behulp van een tweede IEC lijn (T84), evenals een tweede C. jejuni wild-type stam (81-176), aangeeft dat er geen cellijn of een bacteriële stam specifieke effecten 1. Deze verhoogde niveaus van bacteriële invasie interactie en resulteerde in een verhoogde, gepolariseerde immuunreactie van de IECs 1. Highaar niveaus van IL-8 werden gedetecteerd na microaerobe coculturing, wat aangeeft dat de verhoogde bacteriële uitdaging gepaard met een verhoogde gastheerreactie. Hogere niveaus van IL-8 werd gedetecteerd in de supernatanten basolaterale opzichte van de apicale supernatanten, wat aangeeft dat de IL-8 secretie door de IECs overwegend optreden van de IEC basolaterale oppervlak. IL-8 is een neutrofiel attractant, die van weinig nut in het darmlumen zou zijn. Deze gegevens tonen dat de twee compartimenten setup van de VDC maakt ook efficiënte identificatie van een gepolariseerde gastheerreactie.
Verschillende functies met betrekking tot de technische / setup kant van het VDC-model moet worden geacht voor de toepassing van het model aan een pathogeen organisme te bestuderen. Ten eerste moet de IECs worden gekweekt tot een ondoordringbare monolaag speciale 0,4 um filters vormen. Dit duurt 14-21 dagen afhankelijk van de gebruikte cellijn en maakt de experimenten tamelijk lange vergelijking met klassieke coculturing experimenten uitgevoerd in celkweek platen en het gebruik IECs geteeld voor tussen de 1-7 dagen. Anderzijds, nadat deze een lange groeiperiode hebben de IECs aangetoond een volledig gepolariseerde monolaag vormen. Dergelijke monolagen gepolariseerde bootsen de situatie in vivo in het menselijk darmepitheel veel nauwer dan het ongepolariseerde, nonconfluent IEC lijnen dat in sommige studies en verschaffen als zodanig een ander voordeel van de VDC model. Ten tweede, de speciale 0,4 urn filters zijn aanzienlijk duurder dan een standaard 24-well celcultuur plaat. De grootste beperking van de VDC is de relatief lage doorzet. Dit is voornamelijk te wijten aan de beschikbaarheid van VDC kamers en de setup die het gas spruitstuk. Slechts relatief geringe aantal parallel duplo worden uitgevoerd in een keer, in tegenstelling tot de klassieke celkweekwerkwijze. Het VDC-model is daarom minder geschikt voor grootschalige screening experimenten of proeven waarbij een groot aantal replicates. Een andere factor om te overwegen is dat de zwaarte effect van het uitvoeren van co-cultuur assays in de VDC model betekent dat in tijd bacteriën beginnen te aggregeren op de bodem van het apicale compartiment resulteert in verminderde mogelijkheid van interactie met de IEC monolaag. Door echter de VDC model hebben we aangetoond dat de interactie van een nonmotile, nonaggregating 11168H rpoN mutant worden dramatisch verminderd in vergelijking met de beweeglijke aggregeren 11168H wildtype na 6 uur 1. We zijn momenteel bezig met aanpassingen aan de VDC-model dat sommige menging in het apicale compartiment dat nauwer zouden nabootsen peristaltiek van de darm lumen zou toestaan. Hoewel dus de VDC model beter is dan de klassieke, aerobic celcultuurmethodes door beter nabootsen van de in vivo situatie, vooral bacteriën zoals C. jejuni dat een strenge atmosferische eisen hebben, de VDC-model heeft nog steeds bepaalde beperkingen die moeten worden genomenrekening houden bij het ontwerpen van experimenten.
Onze gegevens ondersteunt de bevindingen van een vergelijkbaar VDC model gebruikt om de menselijke maag pathogeen Helicobacter pylori, die toenam bacteriële hechting aan gastheercellen toonde bestuderen, verhoogde synthese van bacteriële virulentie factoren alsmede verhoogde gastheer aangeboren immuunrespons bij H. pylori werd gekweekt samen met epitheliale cellen onder microaerobe opzichte aërobe omstandigheden 11. Aangezien beide H. pylori en C. jejuni vereisen microaerobe voorwaarden voor groei, de bevinding dat microaerobe voorwaarden bevorderen de interactie van de organismen met gastheercellen is niet verrassend. Echter, een andere studie met een VDC-systeem om de interacties van de facultatieve anaërobe enterohemorragische Escherichia coli analyseren met IECs aangetoond verhoogde niveaus van bacterie interacties onder anaerobe / microaerobe coculture omstandigheden in het VDC apicale compartiment 10. Tzijn aangegeven dat het gedrag van bacteriën die kunnen prolifereren onder atmosferische zuurstofgehalte ook gewijzigd wanneer samen gekweekt met IECs onder anaërobe / micro-aërobe omstandigheden. Dit suggereert dat de VDC model is een verbeterd en waardevol model voor de analyse van de gastheer-pathogeen interacties van verschillende pathogene bacteriën onder omstandigheden die meer getrouw lijken op de in vivo situatie in het menselijk darmkanaal.
Van het model perspectief, heeft de VDC-model bleek een aantal duidelijke voordelen ten opzichte van aërobe bezitten in vitro C. jejuni-IEC coculturing modellen. De omgeving gecreëerd in het VDC model nauwer bootst het milieu in de menselijke darm tijdens C. jejuni infectie, wat leidt tot een zeer aanzienlijke toename van het aantal bacteriën interactie met invasie en de IECs. Het VDC-model in deze huidige formaat is ideaal om de interacties van darmbacteriën studeren met maag-en darmklachtenepitheliale cellen, maar er is de mogelijkheid om de VDC model aan voor de studie van strikte anaërobe uit ontlasting of voor orale microbiologische monsters, zoals twee voorbeelden. Het belangrijkste principe moet altijd zijn om te streven naar deze coculture experimenten onder voorwaarden uit te voeren die beter na te bootsen de in vivo situatie. Het VDC-model zal een belangrijk instrument voor de verdere studies van C. zijn jejuni gastheer-pathogeen interacties en dient voor de studie van de pathogene mechanismen van verschillende bacteriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dominic Mills werd ondersteund door een Bloomsbury Colleges PhD studententijd (2007-2010). De auteurs willen graag zowel Ozan Gundogdu en Abdi Elmi bedanken voor hun hulp bij de ontwikkeling van het VDC-model.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
- Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
- Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
- Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. Campylobacter. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).
- Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
- Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
- Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
- Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
- Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
- Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).
