Summary
De embryonale epidermis av svært sent stadium Drosophila embryoer gir en in vivo system for rask punktering sår responsanalyse, og kan kombineres med genetiske manipulasjoner eller kjemiske mikroinjeksjon behandlinger for å fremme studier i sårheling for oversettelse til pattedyr modeller.
Abstract
Den Drosophila embryo utvikler en robust epidermal lag som tjener både til å beskytte de interne celler fra en hard ytre miljø, så vel som å opprettholde cellulær homeostase. Stikkskade med glass nåler gir en direkte metode for å utløse en rask epidermal sår respons som aktiverer sår transkripsjons journalister, som kan visualiseres ved en lokalisert reporter signal i levende embryoer eller larver. Punktering eller laser skade gir også signaler som fremmer rekruttering av hemocytes til sårstedet. Overraskende, alvorlig (tvers igjennom) stikkskade i sent stadium embryoer bare sjelden forstyrrer normal embryoutvikling, som er større enn 90% av slike sårede embryo overlever til voksen alder når embryoer injiseres i et olje medium som minimerer umiddelbar lekkasje av hemolymph fra injeksjonssteder . Såret prosedyren krever micromanipulation av Drosophila embryoer, inkludert manuell justering av embryoene på agar plater og overføring av de sammenstilte embryoer til objektglass. Den Drosophila epidermal såret respons-analyse gir et raskt system for å teste de genetiske krav i en rekke biologiske funksjoner som fremmer sårheling, så vel som en metode for screening av potensielle kjemiske forbindelser som fremmer sårheling. Den korte livssyklus og enkel dyrking rutine gjør Drosophila en kraftig modell organisme. Drosophila ren sårtilheling ser ut til å koordinere epidermal regenerativ respons, med den medfødte immunforsvaret, på måter som er fortsatt under etterforskning, som gir et utmerket system for å finne bevart regulatoriske mekanismer som er felles for Drosophila og pattedyr epidermal såret.
Introduction
Manipulering av Drosophila embryoer ved hjelp av en mikroinjeksjon teknikken er en veletablert analysen en. Betydningen av den epidermale sår respons reporter metode er å kombinere den protokoll for punktering / mikroinjeksjon med fluorescerende reportere og visualisere en in vivo respons til epidermal skade i Drosophila embryo. Målet med denne metoden er å muliggjøre et bredere sett av forskere å bruke Drosophila som et verktøy for å undersøke de prosesser som regulerer transkripsjons respons på epidermal stikkskade. Singelen lag epidermis i Drosophila gir et enkelt system for å studere en epidermal såret respons etter stikkskade to. Den Drosophila embryo er et robust modellsystem for å genetisk dissekere stadier av sår reparasjon, inklusive såret respons, inflammasjon og reepithelialization 3.. Dette er delvis fordi mange eller de fleste Zygotic mutanter overleve til slutten av embryogeneser og utvikle epidermal barrierer selv når utviklings mønster går dypt forkjært. Forrige karakterisering av en godt bevart transkripsjonsfaktor Kornete hode (grh), identifisert som grh-målgener dopa decarboxylase (DDC) og tyrosin hydroksylase (ple) er transcriptionally aktiveres rundt områdene av skader 4. Drosophila som modellorganisme for sår respons gir et utfyllende linje med etterforskning for å fremme studier i pattedyr sårtilheling fem. Senere studier har identifisert flere Drosophila sår-indusert gener og utviklet en "verktøykasse" av mange fluorescerende såret journalister for å overvåke in vivo epidermal såret respons for å rense såret seks. Nyere rapporter om regulering av Drosophila sårtilheling har fokusert på såret nedleggelse fenotype, slik at oppdagelsen av mange veier som regulerer celle migrasjon 7,8. Ved analyse avfluorescerende såret journalister, har våre studier identifisert en roman sett av gener som kreves for den lokaliserte uttrykk for epidermal sår-induserbare gener 9. En av fordelene ved såret respons reporter metoden er at resultatene gir mer innsikt i en mekanisme for hvordan signalene omformet fra skadestedet til nabocellene. Imidlertid er en av de demerits av såret respons reporter metode som resultatene ikke koble direkte til fenotyper i sårheling eller reparasjon. Bredere bruk av rene sår punktering protokollen i genetiske og kjemiske skjermer vil tillate nye regulatorer av transkripsjons respons på epidermal såret for å bli identifisert og videre oversettelse av sårtilheling funn i pattedyr modeller av skadebehandlinger.
Protocol
Drosophila embryonale såret protokollen kan oppsummeres i fem trinn: (1) Embryo Collection, (2) Embryo Forberedelse (3) Embryo såret, (4) Embryo Mikroinjeksjon, og (5) Embryo Fiksering.
En. Embryo Collection
- Samle voksne fluer, 2-3 dager etter eclosing, legger 50 hunner og 25 hanner til et embryo samling bur.
- Plasser en fersk eplejuice agar pluss gjær plate hver morgen for tre dager.
Merknader: For optimal embryo samling, sykle fluer på en 12 timers døgnlige planen i en 25 ° C inkubator (05:00 lamper "på" og 17:00 lights "OFF"); kvinnelige fluer svare på endringer i lys syklus og vil sette inn større mengder av egg i løpet av en overgang fra lys "ON" til lys "OFF" 10,11. - På ettermiddagen av Dag-3, plasserer en fersk eplejuice pluss gjær agar plate på buret og samle embryoer for 2 hr. Plasser en ny gjær plate på buret og redde2 timers samling plate.
- Oppbevar oppsamlingsplate i ytterligere 14 timer ved 25 ° C for å eldes embryoene.
Merknader: Wound healing kan bli analysert på noe tidspunkt under Drosophila utvikling; såret-indusert transkripsjons journalister som er beskrevet i denne artikkelen har en optimal aktivitet mellom trinnene 15 til 16 desember. Ved sent stadium 17, er embryoet for gammel til å enkelt pierce modning skjellaget og effektivt aktivere såret journalister eller oppdage sår-indusert transkripsjon. Å tillate innsamling tid og såret tid til å oppstå under peak lab timer, følger vi en tidsplan for embryo samling for to timers (16:00-18:00), utveksle samlingen plate med en ny plate på 18:00, alder oppsamlingsplate ved 25 ° C i 14 timer (over natten), og såret embryoene på 08:00 (neste dag).
2. Embryo Forberedelse
Merknader: Denne protokollen omfatter bruk av mange verktøy og objekter som er skarpe eller laget av glass. Håndter alle kryss og glassgjenstander med forsiktighet for å unngå personskader.
- Fjern forsiktig embryoer fra innsamlings plater med en pensel ved å tilsette 2-3 ml vann til plate og virvlende. Overføre vann og embryoer fra plate til nylon mesh og samling rør.
- Legg 4-5 ml av blekemiddel til hetten av en plast petriskål plate og suge mesh dekket slutten av samlingen tube inneholder embryoene i blekemiddel for 2 min, som fjerner den ytre eggeskall av embryoet. Manuelt rotere samling rør et par ganger for å hindre at embryoer fra klumper i blekemiddel. Skyll embryoer med vann 10x og tørk mesh dekket samling rør som inneholder de dechorionated embryo på et papirhåndkle.
- Bruk en dissekere nål å overføre ~ 50 embryoer fra nylon mesh til en agar plate. Vi legger grønn konditorfarge til den agarplate å legge til kontrast og bistand i embryo justering. Under en dissekere mikroskop, lage to parallelle rekker av ~ 25 embryoer, samkjøre Embryos på objektglasset, slik at de vil være i rett vinkel til punktering nålen på mikroinjeksjon apparat. Legg igjen en liten plass (ca 1 embryo lengde) mellom embryoer for gassutveksling formål. De to parallelle rekker bør være omtrent 5 mm fra hverandre.
- Plasser et lysbilde med dobbel stick tape på toppen av de sammenstilte embryo og forsiktig trykk lysbilde å overføre embryoer fra grønn plate til lysbildet. Da lufttørke embryoene ~ 25 min å redusere innvendig trykk på fosteret og hindre et utbrudd når såret.
- Plasser 2-3 dråper halokarbon olje mix over embryoene å hindre ytterligere dehydrering.
Tre. Embryo såret
- Plasser embryo raset i injeksjons mikroskop scenen. Finn embryoene i synsfeltet og øve flytte scenen av invertert mikroskop.
Merknader: Før du arbeider med nålen, fokuserer på midten planet av embryo langs dorsoventral aksen. For å muliggjøre effektiv såret avjustert embryoer, begynner såret raden nærmere nålen apparat. Beveg stadiet for å bringe toppen av rekken av innrettede embryoer inn i synsfeltet. - Nøye plassere og sikre en trakk-nål i nålholderen. Bruk mikromanipluatoren å flytte nålen ned mot lysbilde. Juster nålen med fosteret, i samme fokusplan. Når nålen er i fokus med fosteret, ikke flytte nålen med mikromanipluatoren.
- Flytt scenen for å punktere embryo tvers igjennom, deretter flytte til neste embryo i raden. Når du er ferdig såret den første raden, bruker mikromanipluatoren å flytte nålen helt opp og vekk fra scenen før han flyttet lysbildet; manuelt rotere raset 180 ° og såret den andre raden.
- Oppbevar embryoene henhold halogenkarbon olje ved værelsestemperatur, og videre med embryo fiksering hvis gjør in situ hybridisering, eller antistoff-farging (se prosedyre trinn 5). Alternativt, lagre embryoer for 4-6 timershenhold halokarbon olje og fortsett med sår transcriptional fluorescerende reporter visualisering (Representant Resultater).
Merknader: For visualisering av fluorescerende reporter, bedøve vi embryoene som bruker 50% 1-fenoksv-2-propanol 13. Embryoene blir fjernet fra halogenkarbon olje og plassert på en ny side. Vi legger glassperler rundt embryoene, tilsett noen dråper av narkosen, og plassere et dekkglass på embryoer.
4. Embryo Mikroinjeksjon
Merknader: Den mikroinjeksjon apparat som vi bruker i protokollen er ikke automatisert å levere bestemt volum under analysen. Vi legger et fargestoff til løsningen for å visualisere mikroinjeksjon og prøve å normalisere volumet levert. Hvis for mye oppløsningen er sprøytet inn i fosteret, vil vitelline membranen briste.
- Load nål bakfra med en ul av kjemisk løsning pluss fargestoff (f.eks 0,6 MH 2 O 2). Tillat kapillærhandling for å trekke den kjemiske løsning på spissen av nålen.
- Å bryte en nål, plassere en dekkglass i en vinkel på et lysbilde og frakk kanten med halokarbon oljeblanding. Bring den monterte nålen i fokus med kanten av det skråstilte dekkglass og forsiktig beveger dekkglass kant over spissen av nålen inntil brutt. Legge press på mikroinjeksjon apparater og kontroller at kjemisk løsning pluss fargestoff strømmer ut nålen.
- Plasser lysbildet som inneholder justert embryoer på mikroskopet scenen. Fortsett å fokusere embryoet og nålen i samme plan. Samtidig punktere og microinject kjemisk løsning pluss fargestoff inn i hvert embryo.
Merknader: Tette nåler forekommer ofte, bryte en ny nål for å unngå ufullstendig mikroinjeksjon. En sløv nålespissen ikke såret så rent som en vinklet nålespissen. Justering av dekkglass på en ikke-vinkel på 90 ° i løpet av brekkasje er optimalt å frembringe en vinklet nålespissen.
5. Formaldehyd FiEit eldorado
Merknader: Kjemikaliene som brukes i denne Drosophila fiksering er skadelig. Bruk personlig verneutstyr (f.eks hansker, laboratoriefrakk og vernebriller) ved håndtering av kjemikalier. Følg enkelte institusjonelle retningslinjer for avhending av regulerte kjemikalier.
- Etter såret, vente 15, 30, 60, minutter eller mer for transcriptional aktivering av sår-indusert gener å oppstå. For å fjerne embryo fra injeksjons lysbilder, nøye tømme halokarbon oljeblanding fra lysbildene, lene lysbildet mot et rack og blot til slutt med en Kimwipe.
- Bruk et glass pipette å skylle heptan over raset og vaske skylle væske i et glass petriskål. Heptan vil oppløse tape og slipp embryoene. Fortsett å skylle til alle embryoene blir fjernet fra raset. Gå videre til neste lysbilde, før alle embryoer blir fjernet fra lysbilder.
- Overfør heptan pluss embryo løsning fra glassform inn i en 20 ml scintillation hetteglass. Rist hetteglasset i 2-3 min, fjern heptan og tilsett 5 ml frisk heptan.
- Tilsett 5 ml frisk, fikseringsløsning (se reagenser liste for oppskrift). Cap hetteglasset og feste til en orbital plattformen shaker. Rist hetteglasset med embryoene for 25 minutter ved 220-230 rpm.
- Etter risting, la boblene på grensesnittet pop. Fullstendig å fjerne den nederste, vannholdig fase med en pipette, og unngå å trekke opp embryoene. Bunnlaget består av fikseringsløsning, og må være anordnet på riktig måte.
- Tilsett 5 ml metanol, cap hetteglasset og rist kraftig for hånd for 20-30 sek, virvel og plasser den på benken. Wounded embryoer vil bo på inter og vil ikke synke til bunns.
Bemerkninger: Etter fiksering vitelline membran av et unwounded embryo vil normalt briste under dehydratiseringstrinnet med metanol. Imidlertid er vitelline membran i en såret embryo allerede brutt og dehydrering trinnet vil ikke fjerne vitelline medl.rane. Hånd-devitellinzation er nødvendig for å fullføre fiksering protokollen. - Fjern forsiktig den øverste heptan laget og deretter legge til 5 ml fersk metanol. Rist flasken og embryoene skulle synke.
- Ta av metanol pluss embryo løsning med et glass overføringspipetten og samles i en nylon mesh samling rør i et glassfat.
- Ta av metanol og skyll embryoene med 1x PBS løsning.
- Overfør embryoene fra nylon mesh til en eplejuice plate. Spre embryoene ut langs overflaten av platen.
- Overføre embryoene til en dobbel stick tape glass slide. Dekk embryoene med 1x PBS.
Bemerkninger: Embryoene en tendens til å klumpe seg på grunn av den vitelline membran. Ved hjelp av en eplejuice sted gir mulighet for rask separasjon av de klumpet seg embryoer. Embryoene må fjernes fra platen og overført til en dobbel pinne tape glass-slide fordi embryoer synke inn i agar-plate når kraft utøves for å fjerne embryo fravitelline membran. - Presse embryoene nøye med en dissekere nål til "pop" vitelline membran. Embryoet skulle synke i PBS.
- Bruke et glass-pipette for å overføre 1 x PBS pluss embryoer i et 1,5 ml rør. Skyll embryoene med 1x PBS og oppbevar ved 4 ° C. Fortsett å dehydrere embryoene ved hjelp av en Etanol: PBS serien og fortsette med in situ hybridisering eller immunolocalization protokoll 14.
Representative Results
For å oppnå de resultater som er vist i denne metoden, er den åpne leseramme for grønt fluorescerende protein (GFP) fusjonert til en promotor / sår-indusert enhancer sekvens fra Dopa Decarboxylase (DDC) og DsRed er fusjonert til et sår enhancer sekvens fra tyrosin hydroksylase ( ple) 4,6. I en levende Drosophila embryo, i modningen av det fluorescerende reporter såret protein optimalt 4-6 timer etter at såret, noe som gir tid for oppsamling av tilstrekkelig protein for å visualisere, i tillegg til tiden for det fluorescerende protein for å oksydere til fluorescerende tilstand 15.. Å observere reporter lokalisering, er en sammensatt fluorescerende mikroskop tilstrekkelig. For å observere en høyere forstørrelse på reporteren lokalisering, er en konfokal mikroskop optimalt å generere en maksimal projeksjon av flere optiske seksjoner (figur 1). Konfokal in vivo avbildning av Drosophila embryoer kompliseres av rapid ondulerte av embryoet. . En full-visning av embryo kan fås med 20X objektiv og et nærbilde av såret kan fås med 40X objektiv. En topp-visning av epidermal såret reporter lokalisering kan avbildes med 10 påfølgende 1/iM optiske seksjoner. En lateral-visning av epidermal såret reporter lokalisering kan avbildes med 40 påfølgende 1 mikrometer optiske seksjoner.
Ved hjelp av standard genetiske krysnings metoder, er det mulig å kombinere såret journalister med genetiske mutasjoner. Ett eksempel presentert i denne artikkelen er Flotillin-2 (Flo-2), fordi tap-av-funksjon (null allel generert med P-element innsetting) og få-av-funksjon (overekspresjon generert med allestedsnærværende uttrykk i alle celler) mutanter av flo-2 demonstrerer Flo-2-genproduktet er nødvendig og tilstrekkelig til å hemme lokalisering av DDC-GFP viklet reportere 9 (figurene 2A og 2B). Bruke microinjection protokollen, er det mulig å teste om innføring av kjemiske løsningene superactivates eller hemmer for lokalisering av sår pressen. Kjemisk-sårede embryoene ble samtidig såret og injisert med en 1:04 ratio på 1% toluidinblått fargestoff og oppløseliggjorte forbindelser. Toluidin blått fargestoff tillatt for visuell bekreftelse av solubiliserte forbindelser blir injisert inn i kroppens hulrom. Kontroll embryoer ble såret med en brukket nål inneholder 1:04 ratio på 1% toluidinblått fargestoff og oppløst stoff uten kjemisk. To eksempler presenteres i denne artikkelen er hydrogenperoksid (H 2 O 2) og metyl-β-syklodekstrin (MβCD), fordi både kjemiske løsninger er tilstrekkelig til globalt aktivere lokalisering av DDC-GFP sår reportere 9 (Tall 2C og 2D) . Hydrogenperoksid (H 2 O 2) ble fortynnet i H2O til 0,6 M. Metyl-β-cyklodekstrin (MβCD) ble solubilisert i 1 mM NaOH til 3 mM. Ved hjelp av fiksering embryo-protokollen, er det mulig å detektere transkripsjonen aktivering av sår responsgener i et lokalisert domene, som omgir en sårstedet. Ett eksempel presentert i denne artikkelen er det in situ hybridisering av RNA prober å oppdage DDC og ple transkripsjoner 4,6,9 (Tall 3A og 3B).
Figur 1. DDC-GFP og ple-DsRed sår reporter lokalisering. Lysfelt og fluorescerende bilder i såret villtype embryoer. (A) Høyt visning av DDC-GFP sår reporter. (B) Høyt syn på ple-DsRed sår reporter. Alle bildene ble samlet på en Leica SP2 confocal mikroskop, med 20X objektiv. Pilene markerer stedet av såret. Stiplede linjer i datapanelets markere konturene av embryoer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Lokalisering av DDC-GFP sår reporter i genetiske mutant bakgrunn og kjemiske microinjected embryoer. Lysfelt og fluorescerende bilder av sårede Flotillin-2 (Flo-2) mutante embryoer. (A) Tap av funksjon Flo-2 {KG00210} mutanter, utvidelse av reporter aktivitet gjennom alle epidermal cellene. (B) Gevinst-av-funksjon Flo-2 (armadillo-Gal4, UAS-Flo2) mutanter, hemming av reporter aktivitet gjennom alle epidermal cellene. (C) Hydrogenperoksid (H 2 O 2 ) løsning mikroinjeksjon, utvidelse av reporter aktivitet gjennom alle epidermale celler. (D) Metyl-β-cyklodekstrin (MβCD) oppløsning mikroinjeksjon, utvidelse av reporter-aktivitet i alle epidermale celler. Alle bildene ble samlet på en Leica SP2 confocal mikroskop, med 20X objektiv. Pilene markerer stedet av såret. Stiplede linjer i data paneler markere konturene av embryoer. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Påvisning av såret respons genet RNA transkripsjoner. Fluorescent bilder av in situ hybridisering og RNA deteksjon i sårede villtype embryoer. DDC (A) og ple (B) RNA transkripsjoner samler seg rundt sårstedet. Alle bildene ble samted på en Leica SP2 confocal mikroskop, med 20X objektiv. Pilene markerer stedet av såret. Stiplede linjer i data paneler markere konturene av embryoer. Klikk her for å se større bilde .
Tabell 1. Oppsummering av epidermal såret respons reportere. Innsett av de fire såret respons reportere (DDC, ple, msn, KKV) er tilgjengelig på både andre og tredje kromosomer. Alle sår respons reportere aktivere fluorescens genet (GFP eller DsRed) i et begrenset antall epidermal cellene rundt området av stikkskade i villtype bakgrunnen (f.eks "lokal" fenotype). DDC og msn sår respons reportere krever grh for aktivering av fluorescence genet etter stikkskade (for eksempel "ingen" fenotype). Alle såret journalister krever Flo-2 for lokalisering av fluorescens genet etter stikkskade (for eksempel "global" fenotype). Klikk her for å se større bilde .
Discussion
En umiddelbar transkripsjonen regulatorisk respons på eksterne signaler gjør det mulig for cellene å koordinere en lokal respons på ekstracellulære stimuli, noe som kan inkluderer stress, skade eller infeksjon. Den feilaktige kontroll over en lokalisert respons kan ha skadelige effekter på nabocellene, samt en sløsing med ressurser til å reparere skaden. Drosophila embryo gir et utmerket system for å gjennomføre grunnleggende sårheling eksperimenter i en billig og enkel å vedlikeholde modellorganisme. Potensialet for samarbeid mellom forskning i andre modellorganismer og Drosophila gir en unik mulighet til å utforske mange biologiske spørsmål.
En annen teknikk for såret reportere er det genetiske kombinasjon av mutante bakgrunn, og gir en effektiv metode for testing av bidraget av nye gener til aktivering av den epidermale sår respons pathway. Vi har epidermal sår-indusert transkripsjons reportere en vailable på både 2. og 3. kromosomer fem. I denne studien bruker vi UAS og Gal4 systemer av overekspresjon 16. For studier med dødelige mutant alleler bestemmer vi den genetiske bakgrunnen ved hjelp av et fluorescerende balanserer kromosom, f.eks Kruppel-GFP 17. Vi har analysert såret reporter lokalisering i flere genetiske bakgrunn (Tabell 1).
En mulig modifikasjon av den teknikk er å kombinere mikroinjeksjon og såret. Mikroinjeksjon kan brukes for å innføre en kjemisk løsning i embryo. Mange kjemiske forbindelser er blitt testet og ble funnet å regulere aktiviteten av de epidermale sår reportere 9. Denne metode for simultan såret, og mikroinjeksjon kan være nyttig for å øke antall celler i Drosophila embryo som reagere et sår signal og kan direkte brukes til å overvåke endringer i genekspresjon etter at såret 18. En fremtidig anvendelse av mikroinjeksjon teknikken vil være å teste nye kjemikalier for regulering av den epidermale sår respons.
Drosophila som et modellsystem for genetiske studier tilbyr et bredt utvalg av enkle protokoller for å effektivt håndtere komplekse spørsmål. Nylige rapporter om gjennomførbarheten av Drosophila teknikker høydepunkter bruk av hemocyte migrasjon 19 og parasittiske veps infeksjon 20 som et middel for å ytterligere utvide virkningen av Drosophila forskningsmiljøet. I tillegg til sår reparasjon studier, gir Drosophila en klassisk modell for regenerering med imaginal plate system 21,22. De kombinerte fremskritt i imaginal plate regenerering studier og punktering / mikroinjeksjon såret gir et utmerket system for å oppdage godt bevarte deler av vev reparasjon.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Denne protokollen er utviklet i samarbeid med tidligere medlemmer av McGinnis Lab, Kim A. Mace og Joseph C. Pearson. Vi takker de fortsatt innsats fra Bloomington Drosophila Stock Center for sitt arbeid for å organisere og distribuere verdifulle aksjer. Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Institutes of Health (R01 GM077197 og K12 GM68524) og familien til Herbert Stern. MTJ støttes av Grant Antall 5G12RR003060-26 fra National Center for Research Resources og Grant Antall 8G12MD7603-27 fra National Institute on minoritetshelse og helseforskjeller. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institute on minoritetshelse og helseforskjeller eller National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
| apple juice | Generic | ||
| agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
| bleach | Generic | ||
| halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
| halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
| 1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
| methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
| toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
| formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
| heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
| methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
| 10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
| Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
| fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
| embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
| plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
| double-stick tape | Generic | ||
| paintbrush | Generic | ||
| dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
| glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
| microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
| capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
| needle puller | Narishige | PC10 | |
| microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
| micromanipulator | Narishige | MN151 | |
| inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
| glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
| glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
| transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
| scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
| orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
| fixation solution | (5 ml) | ||
| 16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
| 10x PBS | 0.5 ml | ||
| 0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
| RNase free H2O | 1.5 ml | ||
| Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
| halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
| halocarbon oil, 27 W | 5 ml |
References
- Germeraad, S. Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA. Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).
- Payre, F. Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head. Science. 308 (5720), 381-385 (2005).
- Ting, S. B., Caddy, J., et al. A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice. Science. 308 (5720), 411-413 (2005).
- Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, Ø, McGinnis, W. Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).
- Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair. Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).
- Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes. Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila. PLoS Genet. 7 (12), e1002424 (2011).
- Allemand, R. Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).
- Allemand, R. Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster. Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).
- Pierre, S. E., Thurmond, J. FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase. Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).
- Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. 1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology. J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP. BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).
- Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila. PloS one. 8 (4), e61773 (2013).
- Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations. J. Vis. Exp. (36), e1696 (2010).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J. Vis. Exp. (63), e3347 (2012).
- Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs. Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).
- Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs. Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).
