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Bioengineering

Microinjection घाव परख और Published: November 1, 2013 doi: 10.3791/50750
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Sophie Davis School of Biomedical Education, The City College of New York, 2Cell & Developmental Biology, University of California, San Diego

Summary

बहुत देर से मंच ड्रोसोफिला भ्रूण के भ्रूण एपिडर्मिस तेजी पंचर घाव प्रतिक्रिया विश्लेषण के लिए एक Vivo प्रणाली प्रदान करता है और स्तनधारी मॉडल में अनुवाद के लिए घाव भरने में पढ़ाई करने के लिए अग्रिम आनुवंशिक जोड़तोड़ या रासायनिक microinjection उपचार के साथ जोड़ा जा सकता है.

Abstract

ड्रोसोफिला भ्रूण दोनों एक कठोर बाहरी वातावरण से आंतरिक कोशिकाओं की रक्षा करने के साथ ही सेलुलर homeostasis को बनाए रखने के लिए कार्य करता है कि एक मजबूत epidermal परत विकसित करता है. कांच सुइयों के साथ पंचर चोट रहने वाले भ्रूण या लार्वा में एक स्थानीय पत्रकार के संकेत से देखे जा सकते हैं जो घाव ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाताओं से सक्रिय है, कि एक तेजी से एपिडर्मल घाव प्रतिक्रिया ट्रिगर करने के लिए एक सीधा तरीका प्रदान करता है. पंचर या लेजर चोट भी घाव साइट पर hemocytes की भर्ती को बढ़ावा देने के संकेत है कि प्रदान करता है. हैरानी की बात है, देर चरण भ्रूण में गंभीर (के माध्यम से और के माध्यम से) पंचर चोट केवल शायद ही कभी इस तरह के घायल भ्रूण के 90% से अधिक भ्रूण पंचर साइटों से hemolymph के तत्काल रिसाव कि कम से कम एक तेल माध्यम में इंजेक्ट कर रहे हैं जब वयस्कता के लिए जीवित रहने के रूप में, सामान्य भ्रूण विकास बाधित . घाव प्रक्रिया एजी पर भ्रूण का मार्गदर्शन संरेखण सहित ड्रोसोफिला भ्रूण की micromanipulation, की आवश्यकता होती हैएआर प्लेटें और स्लाइड खुर्दबीन के लिए गठबंधन भ्रूण का स्थानांतरण. ड्रोसोफिला एपिडर्मल घाव प्रतिक्रिया परख घाव भरने, साथ ही घाव भरने को बढ़ावा देने की क्षमता है कि रासायनिक यौगिकों के लिए स्क्रीन के लिए एक तरह का प्रचार करने वाली जैविक कार्यों की एक किस्म के आनुवंशिक आवश्यकताओं को परीक्षण करने के लिए एक त्वरित प्रणाली प्रदान करता है. कम जीवन चक्र और आसान संवर्धन दिनचर्या ड्रोसोफिला एक शक्तिशाली जीव मॉडल बनाते हैं. ड्रोसोफिला साफ घाव भरने नियामक संरक्षित खोजने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करता है जो जांच के तहत अब भी कर रहे हैं कि मायनों में, सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ, एपिडर्मल पुनर्योजी प्रतिक्रिया समन्वय करने के लिए प्रकट होता है ड्रोसोफिला और स्तनधारी एपिडर्मल लोग घायल हो गए करने के लिए आम तंत्र.

Introduction

एक microinjection तकनीक का उपयोग ड्रोसोफिला भ्रूण की हेरफेर एक अच्छी तरह से स्थापित परख 1 है. एपिडर्मल घाव प्रतिक्रिया संवाददाता विधि के महत्व फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ पंचर / microinjection के लिए प्रोटोकॉल गठबंधन और ड्रोसोफिला भ्रूण में एपिडर्मल चोट करने के लिए एक में विवो प्रतिक्रिया कल्पना करने के लिए है. इस पद्धति का लक्ष्य एपिडर्मल पंचर चोट के transcriptional प्रतिक्रिया को विनियमित कि प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक उपकरण के रूप में ड्रोसोफिला का उपयोग करने के लिए वैज्ञानिकों की एक व्यापक सेट के लिए सक्षम है. ड्रोसोफिला में एकल स्तरित एपिडर्मिस एक पंचर चोट 2 के बाद एक epidermal घाव प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक सरल प्रणाली प्रदान करता है. ड्रोसोफिला भ्रूण आनुवंशिक रूप से घाव प्रतिक्रिया, सूजन, और reepithelialization 3 सहित, घाव की मरम्मत के चरणों काटना एक मजबूत मॉडल प्रणाली है. कई या सबसे युग्मज म्यूटेंट embryogenes के अंत तक जीवित रहते हैं क्योंकि इस हिस्से में हैऔर विकासात्मक patterning गहराई से धराशायी हो जाता है, तब भी जब एपिडर्मल बाधाओं का विकास. GRH लक्ष्य जीन Dopa decarboxylase (डीडीसी) और tyrosine hydroxylase (मिसाल) transcriptionally चोट 4 के स्थलों के आसपास सक्रिय कर रहे हैं. पहचान एक अच्छी तरह से संरक्षित प्रतिलेखन कारक दानेदार सिर (GRH), पिछले लक्षण वर्णन ड्रोसोफिला घाव प्रतिक्रिया के लिए एक मॉडल के रूप में जीव स्तनधारी घाव भरने 5 में पढ़ाई करने के लिए अग्रिम जांच के लिए एक पूरक लाइन प्रदान करता है. बाद के अध्ययन अतिरिक्त ड्रोसोफिला घाव प्रेरित जीन की पहचान की है और 6 लोग घायल हो गए साफ करने में विवो एपिडर्मल घाव प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए कई फ्लोरोसेंट घाव पत्रकारों के एक "टूलकिट" विकसित किया है. ड्रोसोफिला घाव भरने के नियमन पर हाल की रिपोर्टों से सेल प्रवास 7,8 के विनियमन के कई रास्ते की खोज की अनुमति, घाव बंद phenotype पर ध्यान केंद्रित किया है. के विश्लेषण के साथफ्लोरोसेंट घाव संवाददाताओं से, हमारे अध्ययन एपिडर्मल घाव inducible जीन 9 की स्थानीयकृत अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक जीन का एक उपन्यास सेट की पहचान की है. घाव प्रतिक्रिया संवाददाता विधि की खूबियों में से एक परिणाम संकेतों पड़ोसी कोशिकाओं को चोट की साइट से transduced रहे हैं, एक तंत्र में और अधिक जानकारी प्रदान करता है. हालांकि, घाव प्रतिक्रिया संवाददाता विधि का दोष का एक परिणाम सीधे घाव भरने या मरम्मत में phenotypes से लिंक नहीं है. आनुवंशिक और रासायनिक स्क्रीन में साफ घाव पंचर प्रोटोकॉल का व्यापक उपयोग ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया की नई नियामकों की पहचान की जा घायल हो गए एपिडर्मल और चोट के उपचार के स्तनधारी मॉडल में घाव भरने की खोजों का अनुवाद करने के लिए आगे की अनुमति देगा.

Protocol

ड्रोसोफिला भ्रूण घाव प्रोटोकॉल पांच चरणों में संक्षेप किया जा सकता है: (1) भ्रूण संग्रह, (2) भ्रूण तैयारी (3) भ्रूण लोग घायल हो गए, (4) भ्रूण Microinjection, और (5) भ्रूण फिक्सेशन.

1. भ्रूण संग्रह

  1. वयस्क मक्खियों लीजिए 2-3 दिनों eclosing के बाद, एक भ्रूण संग्रह पिंजरे में 50 महिलाओं और 25 पुरुषों को जोड़ें.
  2. 3 दिनों के लिए हर सुबह एक ताजा सेब का रस अगर प्लस खमीर प्लेट रखें.
    नोट: एक 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक 12 घंटा प्रतिदिन समय पर इष्टतम भ्रूण संग्रह, चक्र के लिए मक्खियों (और 17:00 रोशनी "बंद" "पर" 05:00 रोशनी); मादा मक्खियों प्रकाश चक्र में परिवर्तन का जवाब और रोशनी "बंद" 10,11 "पर" रोशनी से एक स्विच के दौरान अंडे की बड़ी मात्रा में जमा करेंगे.
  3. दिन -3 की दोपहर में, पिंजरे पर एक ताजा सेब का रस प्लस खमीर अगर प्लेट जगह और 2 घंटे के लिए भ्रूण लीजिए. पिंजरे पर एक नया खमीर थाली प्लेस और बचाने2 घंटा संग्रह थाली.
  4. भ्रूण उम्र को 25 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 14 घंटे के लिए संग्रह थाली स्टोर.
    नोट: घाव भरने ड्रोसोफिला विकास के दौरान किसी भी स्तर पर assayed किया जा सकता है, इस पत्र में वर्णित घाव प्रेरित ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाताओं चरणों 15-16 दिसम्बर के बीच एक इष्टतम गतिविधि है. देर चरण 17 से, भ्रूण आसानी से परिपक्व छल्ली पियर्स और कुशलता से घाव संवाददाताओं को सक्रिय या घाव प्रेरित प्रतिलेखन पता लगाने के लिए बहुत पुराना है. संग्रह समय और लोग घायल हो गए समय शिखर प्रयोगशाला घंटे के दौरान होने की अनुमति देने के लिए, हम, 18:00 पर एक नई प्लेट के साथ संग्रह थाली का आदान प्रदान, 2 घंटा (16:00-18:00) के लिए भ्रूण संग्रह की एक अनुसूची का पालन उम्र 14 घंटा (रातोंरात) के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर संग्रह प्लेट, और (अगले दिन) 8:00 पर भ्रूण घाव.

2. भ्रूण तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल तेज कर रहे हैं या जी से बना है कि कई उपकरणों और वस्तुओं का उपयोग भी शामिल हैलड़की. व्यक्तिगत चोट से बचने के लिए सावधानी से सभी तेजधार और कांच की वस्तुओं संभाल लेना.

  1. धीरे थाली और घूमता को 2-3 मिलीलीटर पानी जोड़कर एक तूलिका के साथ संग्रह प्लेटों से भ्रूण को हटा दें. नायलॉन जाल और संग्रह ट्यूब थाली से पानी और भ्रूण स्थानांतरण.
  2. एक प्लास्टिक पेट्री डिश प्लेट की टोपी के लिए ब्लीच की 4-5 मिलीलीटर जोड़ें और 2 मिनट के लिए ब्लीच में भ्रूण युक्त संग्रह ट्यूब के जाल कवर अंत लेना; भ्रूण के बाहरी खोल हटा. मैन्युअल संग्रह ट्यूब ब्लीच में clumping से भ्रूण को रोकने के लिए समय की एक जोड़ी बारी बारी से. पानी 10x के साथ भ्रूण कुल्ला और एक कागज तौलिया पर dechorionated भ्रूण युक्त जाल कवर संग्रह ट्यूब सूखी.
  3. एक अगर प्लेट को जाल नायलॉन से ~ 50 भ्रूण स्थानांतरण करने के लिए एक विदारक सुई का प्रयोग करें. हम भ्रूण संरेखण में विपरीत और सहायता जोड़ने के लिए अगर प्लेट को हरे रंग भोजन जोड़ने. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, Embry aligning, ~ 25 भ्रूण की दो समानांतर पंक्तियों बनानेस्लाइड पर ओएस वे microinjection तंत्र पर पंचर सुई को सही कोण पर होना होगा. गैस विनिमय प्रयोजनों के लिए भ्रूण के बीच एक छोटी सी जगह (लगभग 1 भ्रूण की लंबाई) को छोड़ दें. दो समानांतर पंक्तियों के अलावा लगभग 5 मिमी होना चाहिए.
  4. गठबंधन भ्रूण के शीर्ष पर डबल स्टिक टेप के साथ एक स्लाइड प्लेस और ध्यान से स्लाइड करने के लिए हरी थाली से भ्रूण स्थानांतरण करने के लिए स्लाइड प्रेस. फिर हवा भ्रूण सूखी ~ 25 मिनट भ्रूण पर आंतरिक दबाव को कम करने और घायल हो गए जब एक फट रोकने के लिए.
  5. आगे निर्जलीकरण को रोकने के लिए भ्रूण से अधिक हेलोकार्बन तेल के मिश्रण की 2-3 बूंदें रखें.

3. भ्रूण घायल

  1. इंजेक्शन खुर्दबीन मंच में भ्रूण स्लाइड रखें. देखने के क्षेत्र में भ्रूण का पता और उलटा माइक्रोस्कोप के मंच चलती का अभ्यास करेंगे.
    नोट: सुई के साथ काम करने से पहले, dorsoventral अक्ष के साथ भ्रूण के बीच विमान पर ध्यान केंद्रित. के कुशल लोग घायल हो गए के लिए अनुमति देने के लिएगठबंधन भ्रूण, करीब सुई तंत्र को पंक्ति लोग घायल हो गए लगते हैं. देखने के क्षेत्र में गठबंधन भ्रूण की पंक्ति के ऊपर लाने के लिए मंच ले जाएँ.
  2. सावधानी से और सुई धारक में एक खींच लिया सुई सुरक्षित. स्लाइड की ओर नीचे सुई ले जाने के लिए micromanipulator का प्रयोग करें. एक ही फोकल हवाई जहाज़ में, भ्रूण के साथ सुई संरेखित करें. सुई भ्रूण के साथ ध्यान में है एक बार, micromanipulator के साथ सुई कदम नहीं है.
  3. फिर पंक्ति में अगले भ्रूण को ले जाते हैं, के माध्यम से और के माध्यम से भ्रूण पंचर करने के लिए मंच ले जाएँ. पहली पंक्ति लोग घायल हो गए जब किया, स्लाइड जाने से पहले चरण से ऊपर और दूर पूरी तरह से सुई को स्थानांतरित करने के micromanipulator का उपयोग करें, मैन्युअल रूप से स्लाइड 180 डिग्री बारी बारी से और दूसरी पंक्ति के घाव.
  4. कमरे के तापमान पर हेलोकार्बन तेल के तहत भ्रूण स्टोर और भ्रूण निर्धारण के साथ आगे बढ़ना सीटू संकरण या एंटीबॉडी धुंधला में कर अगर (प्रक्रिया चरण 5 देखें). वैकल्पिक रूप से, 4-6 घंटे के लिए भ्रूण की दुकानहेलोकार्बन तेल के तहत और घाव ट्रांसक्रिप्शनल फ्लोरोसेंट संवाददाता दृश्य (प्रतिनिधि परिणाम) के साथ आगे बढ़ना.
    नोट: फ्लोरोसेंट संवाददाता के दृश्य के लिए, हम 50% 1-phenoxy-2-propanol 13 का उपयोग भ्रूण anesthetize. भ्रूण हेलोकार्बन तेल से हटा दिया है और एक नई स्लाइड पर रखा जाता है. हम भ्रूण के चारों ओर कांच के मोती जगह संवेदनाहारी की कुछ बूँदें जोड़ने के लिए, और भ्रूण पर एक कवर पर्ची जगह.

4. भ्रूण Microinjection

नोट: हम प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले microinjection तंत्र परख के दौरान विशिष्ट मात्रा देने के लिए स्वचालित नहीं है. हम microinjection कल्पना और वितरित मात्रा मानक के अनुसार करने के लिए प्रयास करने के लिए समाधान के लिए एक डाई जोड़ें. बहुत ज्यादा समाधान भ्रूण में इंजेक्ट किया जाता है, तो पीतक झिल्ली फट जाएगा.

  1. रासायनिक समाधान प्लस डाई का 1 μl के साथ पीछे से लोड सुई (जैसे 0.6 महाराष्ट्र 2 हे 2). केशिका अनुमति देंसुई की नोक के लिए रासायनिक घोल आकर्षित करने के लिए कार्रवाई की.
  2. एक सुई को तोड़ने के लिए एक स्लाइड और कोट हेलोकार्बन तेल के मिश्रण के साथ किनारे पर एक कोण पर एक कवर पर्ची जगह. Angled कवर पर्ची की बढ़त के साथ ध्यान में रखा होगा सुई ले आओ और धीरे टूट जब तक सुई की नोक भर में कवर पर्ची बढ़त चाल है. Microinjection तंत्र पर दबाव लागू करें और रासायनिक घोल प्लस डाई सुई बाहर बह रहा है कि जांच ले.
  3. खुर्दबीन मंच पर गठबंधन भ्रूण युक्त स्लाइड रखें. एक ही विमान में भ्रूण और सुई ध्यान केंद्रित करने के लिए आगे बढ़ें. इसके साथ ही पंचर और microinject रासायनिक समाधान के साथ साथ प्रत्येक भ्रूण में डाई.
    नोट: भरा सुइयों अक्सर होते हैं, अधूरा microinjection से बचने के लिए एक नई सुई टूट गया. एक कुंद सुई टिप के रूप में सफाई से एक angled सुई टिप के रूप में घाव नहीं है. टूटना के दौरान एक गैर 90 डिग्री कोण तक coverslip समायोजित करना एक angled सुई की नोक के उत्पादन के लिए इष्टतम है.

5. Formaldehyde फाईxation

नोट: यह ड्रोसोफिला निर्धारण में प्रयुक्त रसायनों हानिकारक हैं. रसायनों से निपटने जब ​​व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (जैसे दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, और सुरक्षा चश्मे) का प्रयोग करें. विनियमित रसायनों के निपटान के लिए व्यक्तिगत संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करें.

  1. लोग घायल हो गए, के बाद घटित करने के लिए घाव प्रेरित जीनों के transcriptional सक्रियण के लिए 15, 30, 60, या अधिक मिनट इंतज़ार करो. इंजेक्शन स्लाइड से भ्रूण को निकालने के लिए, ध्यान से, स्लाइड्स से हेलोकार्बन तेल मिश्रण नाली एक रैक के खिलाफ स्लाइड दुबला और एक Kimwipe के साथ अंत दाग.
  2. स्लाइड पर हेपटैन कुल्ला और एक गिलास पेट्री डिश में कुल्ला तरल धोने के लिए एक गिलास विंदुक का प्रयोग करें. हेपटैन टेप को भंग करने और भ्रूण जारी करेंगे. सभी भ्रूण स्लाइड से हटा रहे हैं जब तक कुल्ला करने के लिए आगे बढ़ें. सभी भ्रूण स्लाइड से हटा रहे हैं, जब तक अगली स्लाइड पर आगे बढ़ें.
  3. एक 20 मिलीलीटर विज्ञान में गिलास पकवान से हेपटैन प्लस भ्रूण समाधान स्थानांतरणntillation शीशी. 2-3 मिनट के लिए शीशी शेक, हेपटैन हटाने और ताजा हेपटैन के 5 मिलीलीटर जोड़ें.
  4. ताजा निर्धारण समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें (नुस्खा के लिए अभिकर्मकों सूची देखें). शीशी टोपी और एक कक्षीय मंच प्रकार के बरतन को देते हैं. 220-230 rpm पर 25 मिनट के लिए भ्रूण युक्त शीशी हिलाएँ.
  5. झटकों के बाद, इंटरफ़ेस पॉप बुलबुले करते हैं. पूरी तरह से भ्रूण खींच परहेज, एक विंदुक के साथ नीचे, जलीय चरण हटा दें. नीचे की परत निर्धारण समाधान के होते हैं और ठीक से निपटाया जाना चाहिए.
  6. मेथनॉल के 5 मिलीलीटर जोड़ें शीशी टोपी और 20-30 सेकंड, चक्कर आने के लिए हाथ से सख्ती से हिला और बेंच पर जगह है. घायल भ्रूण अंतरावस्था में रहना होगा और नीचे सिंक नहीं होगा.
    नोट: निर्धारण के बाद एक unwounded भ्रूण की पीतक झिल्ली सामान्य रूप से मेथनॉल के साथ निर्जलीकरण चरण के दौरान फट जाएगा. हालांकि, एक घायल भ्रूण में पीतक झिल्ली पहले से ही टूटा हुआ है और निर्जलीकरण कदम पीतक memb दूर नहीं होगाराणे. हाथ devitellinzation निर्धारण प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए आवश्यक है.
  7. ध्यान से शीर्ष हेपटैन परत को हटा दें और फिर नए सिरे से मेथनॉल के 5 मिलीलीटर जोड़ें. शीशी हिला और भ्रूण को डुबोना चाहिए.
  8. एक गिलास हस्तांतरण विंदुक के साथ मेथनॉल प्लस भ्रूण समाधान निकालें और एक गिलास पकवान में एक नायलॉन जाल संग्रह ट्यूब में इकट्ठा.
  9. मेथनॉल निकालें और 1x पीबीएस समाधान के साथ भ्रूण कुल्ला.
  10. एक सेब का रस प्लेट के लिए नायलॉन के जाल से भ्रूण स्थानांतरण. थाली की सतह के साथ भ्रूण बाहर बिखरा हुआ है.
  11. एक डबल स्टिक टेप गिलास स्लाइड पर भ्रूण स्थानांतरण. 1x पीबीएस के साथ भ्रूण को कवर.
    नोट: भ्रूण क्योंकि पीतक झिल्ली के पेड़ों का झुरमुट के लिए करते हैं. एक सेब का रस जगह का उपयोग clumped भ्रूण की त्वरित अलग होने के लिए अनुमति देता है. बल से भ्रूण को निकालने के लिए लागू किया जाता है जब भ्रूण अगर प्लेट में डूब क्योंकि भ्रूण की थाली से हटा दिया है और एक डबल स्टिक टेप गिलास स्लाइड के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिएपीतक झिल्ली.
  12. ध्यान से पीतक झिल्ली "पॉप" के लिए एक विदारक सुई के साथ भ्रूण धक्का. भ्रूण पीबीएस में डूब जाना चाहिए.
  13. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब 1x पीबीएस प्लस भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए एक गिलास विंदुक का प्रयोग करें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस और दुकान के साथ भ्रूण कुल्ला पीबीएस श्रृंखला और सीटू संकरण या immunolocalization प्रोटोकॉल 14 में साथ जारी: एक इथेनॉल का उपयोग भ्रूण निर्जलीकरण के लिए आगे बढ़ें.

Representative Results

इस विधि में यह परिणाम प्राप्त करने के लिए, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) का खुला पढ़ने फ्रेम Dopa decarboxylase (डीडीसी) और DsRed (tyrosine hydroxylase से एक घाव बढ़ाने अनुक्रम से जुड़े हुए है से एक प्रमोटर / घाव प्रेरित बढ़ाने अनुक्रम से जुड़े हुए है मिसाल) 4,6. एक लाइव ड्रोसोफिला भ्रूण में, फ्लोरोसेंट घाव संवाददाता प्रोटीन की परिपक्वता इष्टतम 4-6 पर्याप्त प्रोटीन के संचय के लिए समय कल्पना करने के लिए अनुमति देता है जो लोग घायल हो गए के बाद मानव संसाधन,, साथ ही फ्लोरोसेंट राज्य से 15 oxidize के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए समय है. संवाददाता स्थानीयकरण का निरीक्षण करने के लिए, एक यौगिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के लिए पर्याप्त है. संवाददाता स्थानीयकरण की एक उच्च वृद्धि का निरीक्षण करने के लिए, एक confocal खुर्दबीन कई ऑप्टिकल वर्गों की एक अधिकतम प्रक्षेपण (चित्रा 1) उत्पन्न करने के लिए इष्टतम है. ड्रोसोफिला भ्रूण के vivo इमेजिंग में Confocal आरए से जटिल हैभ्रूण की पीआईडी ​​undulations. . भ्रूण की एक पूर्ण देखने 20X उद्देश्य के साथ प्राप्त किया जा सकता है और घाव साइट की एक बंद हुआ देखने 40X उद्देश्य के साथ प्राप्त किया जा सकता है. एपिडर्मल घाव संवाददाता स्थानीयकरण के एक शीर्ष देखने 10 लगातार 1μm ऑप्टिकल वर्गों के साथ imaged किया जा सकता है. एपिडर्मल घाव संवाददाता स्थानीयकरण का एक पार्श्व देखें 40 लगातार 1 माइक्रोन ऑप्टिकल वर्गों के साथ imaged किया जा सकता है.

मानक आनुवंशिक पार करने के तरीकों का उपयोग करना, यह आनुवंशिक परिवर्तन के साथ घाव संवाददाताओं से गठबंधन करने के लिए संभव है. इस अखबार में प्रस्तुत एक उदाहरण Flotillin -2 (फ़्लो -2) है, क्योंकि (पी तत्व प्रविष्टि के साथ उत्पन्न अशक्त एलील) घाटे में चल समारोह के लिए और लाभ के समारोह (सभी कोशिकाओं में सर्वव्यापी अभिव्यक्ति के साथ उत्पन्न overexpression) म्यूटेंट की FLO-2 फ़्लो 2 जीन उत्पाद संवाददाताओं से 9 घाव DDC-GFP के स्थानीयकरण को बाधित करने के लिए आवश्यक और पर्याप्त है का प्रदर्शन (आंकड़े 2A और 2 बी). मील का प्रयोगcroinjection प्रोटोकॉल, यह रासायनिक समाधान superactivates की शुरूआत या घाव संवाददाताओं का स्थानीयकरण रोकता परीक्षण है कि क्या संभव है. रासायनिक घायल भ्रूण एक साथ घायल और 1% toluidine नीले रंग की डाई और solubilized यौगिकों का एक 01:04 अनुपात के साथ इंजेक्शन थे. Toluidine नीले रंग की डाई शरीर गुहा में इंजेक्ट किया जा रहा solubilized यौगिकों के दृश्य पुष्टि के लिए अनुमति दी. नियंत्रण भ्रूण रासायनिक बिना 1% toluidine नीले रंग की डाई और घुला हुआ पदार्थ के 01:04 अनुपात से युक्त एक टूटी हुई सुई के साथ घायल हो गए. इस अखबार में प्रस्तुत दो उदाहरण हाइड्रोजन पेरोक्साइड हैं (एच 2 हे 2) और मिथाइल β-cyclodextrin (MβCD), दोनों रासायनिक समाधान में विश्व स्तर पर DDC-GFP के स्थानीयकरण संवाददाताओं से घाव को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त हैं क्योंकि 9 (आंकड़े -2 सी और 2 डी) . हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ 2) एच में पतला था 2 हे एम. मिथाइल β-cyclodextrin (MβCD) 0.6 से 1 मीटर में solubilized गया थाएम NaOH 3 मिमी. भ्रूण निर्धारण प्रोटोकॉल का उपयोग करना, यह एक घाव स्थल के आसपास के, एक स्थानीय डोमेन में घाव प्रतिक्रिया जीन के प्रतिलेखन सक्रियण पता लगाने के लिए संभव है. इस अखबार में प्रस्तुत एक उदाहरण डीडीसी और मिसाल टेप 4,6,9 (आंकड़े 3 ए और 3 बी) का पता लगाने के लिए शाही सेना जांच के स्वस्थानी संकरण में है.

चित्रा 1
चित्रा 1. DDC-GFP और मिसाल-DsRed (बी). (ए) DDC-GFP घाव संवाददाता के ऊपर से देखने. घायल जंगली प्रकार भ्रूण में संवाददाता स्थानीयकरण. Brightfield और फ्लोरोसेंट छवियों घाव मिसाल-DsRed के ऊपर से देखने संवाददाता घाव. सभी छवियों 20X उद्देश्य के साथ एक Leica SP2 के confocal खुर्दबीन पर एकत्र किए गए थे. तीर घाव की साइट निशान. डेटा पैनल में धराशायी लाइनोंएस भ्रूण की रूपरेखा निशान. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. आनुवंशिक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि और रासायनिक microinjected भ्रूण. Brightfield और घायल Flotillin -2 (फ़्लो -2) उत्परिवर्ती भ्रूण के फ्लोरोसेंट छवियों में DDC-GFP घाव संवाददाता का स्थानीयकरण. (ए) हानि के समारोह फ़्लो-2 {KG00210} म्यूटेंट, सभी एपिडर्मल कोशिकाओं भर संवाददाता गतिविधि का विस्तार. (बी) के लाभ के समारोह फ़्लो -2 (Armadillo-GAL4, यूएएस Flo2) म्यूटेंट, सभी एपिडर्मल कोशिकाओं भर संवाददाता गतिविधि के निषेध. (सी) हाइड्रोजन (एच 2 ओ 2 ) समाधान microinjection, प्रतिनिधि का विस्तारorter गतिविधि सभी एपिडर्मल कोशिकाओं भर में. (डी) मिथाइल β-cyclodextrin (MβCD) समाधान microinjection, सभी एपिडर्मल कोशिकाओं भर संवाददाता गतिविधि का विस्तार. सभी छवियों 20X उद्देश्य के साथ एक Leica SP2 के confocal खुर्दबीन पर एकत्र किए गए थे. तीर घाव की साइट निशान. डेटा पैनल में धराशायी लाइनों भ्रूण की रूपरेखा निशान. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. घाव प्रतिक्रिया जीन शाही सेना टेप की जांच. घायल जंगली प्रकार भ्रूण में स्वस्थानी संकरण और आरएनए का पता लगाने में की फ्लोरोसेंट छवियों. डीडीसी (ए) और मिसाल (बी) शाही सेना टेप घाव स्थल के चारों ओर जमा हो. सभी छवियों का संग्रह थे20X उद्देश्य के साथ एक Leica SP2 के confocal खुर्दबीन, पर टेड. तीर घाव की साइट निशान. डेटा पैनल में धराशायी लाइनों भ्रूण की रूपरेखा निशान. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

तालिका 1
तालिका 1. एपिडर्मल घाव प्रतिक्रिया संवाददाताओं का सारांश. चार घाव प्रतिक्रिया संवाददाताओं (डीडीसी, लोक, एमएसएन, KKV) के सम्मिलन दोनों दूसरे और तीसरे गुणसूत्रों पर उपलब्ध हैं. घाव प्रतिक्रिया संवाददाताओं के सभी जंगली प्रकार पृष्ठभूमि (उदाहरण के लिए "स्थानीय" phenotype) में पंचर चोट के स्थल के आसपास के एपिडर्मल कोशिकाओं की एक सीमित संख्या में प्रतिदीप्ति जीन (GFP या DsRed) को सक्रिय करें. डीडीसी और एमएसएन घाव प्रतिक्रिया पत्रकारों के लिए GRH आवश्यकता fluorescen की सक्रियतापंचर चोट (उदाहरण के लिए "कोई नहीं" phenotype) के बाद CE जीन. घाव संवाददाताओं की सभी पंचर चोट (उदाहरण के लिए "वैश्विक" phenotype) के बाद प्रतिदीप्ति जीन का स्थानीयकरण के लिए फ़्लो -2 की आवश्यकता होती है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

बाह्य संकेत के लिए एक तत्काल विनियामक प्रतिक्रिया कोशिकाओं तनाव, क्षति, या संक्रमण शामिल कर सकते हैं जो बाह्य उत्तेजनाओं को एक स्थानीय प्रतिक्रिया, समन्वय करने के लिए अनुमति देता है. एक स्थानीय प्रतिक्रिया के अनुचित नियंत्रण चोट की मरम्मत के लिए हानिकारक पड़ोसी कोशिकाओं पर प्रभाव है, साथ ही संसाधनों की बर्बादी हो सकती है. ड्रोसोफिला भ्रूण एक सस्ता और आसान करने के लिए बनाए रखने के जीव मॉडल में बुनियादी घाव भरने के प्रयोगों का संचालन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करता है. अन्य मॉडल जीवों में अनुसंधान और ड्रोसोफिला के बीच सहयोग के लिए संभावित कई जैविक सवालों का पता लगाने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है.

घाव पत्रकारों की एक और तकनीक एपिडर्मल घाव प्रतिक्रिया मार्ग के सक्रियण के लिए नए जीनों का योगदान परीक्षण के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करने, उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के आनुवंशिक संयोजन है. हम एपिडर्मल घाव प्रेरित ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाताओं av है2 एन डी और 3 गुणसूत्रों 5 दोनों पर ailable. इस अध्ययन में हम यूएएस और overexpression 16 GAL4 सिस्टम का उपयोग करें. घातक उत्परिवर्ती alleles के साथ पढ़ाई के लिए हम एक फ्लोरोसेंट balancer गुणसूत्र, जैसे Kruppel-GFP 17 का उपयोग आनुवंशिक पृष्ठभूमि का निर्धारण. हम कई आनुवंशिक पृष्ठभूमि (Table1) में घाव संवाददाता स्थानीयकरण का विश्लेषण किया है.

तकनीक का एक संभावित संशोधन microinjection और लोग घायल हो गए गठबंधन है. Microinjection भ्रूण में एक रासायनिक घोल को पेश करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कई रासायनिक यौगिकों का परीक्षण किया गया है और epidermal घाव संवाददाताओं से 9 की गतिविधि को विनियमित करने के लिए पाए गए. एक साथ लोग घायल हो गए और microinjection का यह तरीका एक घाव संकेत जवाब और सीधे 18 लोग घायल हो गए के बाद जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ड्रोसोफिला भ्रूण में कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए उपयोगी हो सकता है. Microinjection तकनीक का भविष्य आवेदन एपिडर्मल घाव प्रतिक्रिया के नियमन के लिए उपन्यास रसायनों का परीक्षण किया जाएगा.

आनुवंशिक अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में ड्रोसोफिला कुशलता से जटिल सवालों का पता करने के लिए सरल प्रोटोकॉल की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध कराता है. ड्रोसोफिला तकनीक की व्यवहार्यता पर हाल की रिपोर्टों से आगे ड्रोसोफिला अनुसंधान समुदाय के प्रभाव को व्यापक बनाने के लिए एक साधन के रूप में hemocyte माइग्रेशन 19 और परजीवी ततैया संक्रमण 20 के उपयोग पर प्रकाश डाला गया. घाव की मरम्मत के अध्ययन के अलावा, ड्रोसोफिला imaginal डिस्क सिस्टम 21,22 साथ उत्थान के लिए एक शास्त्रीय मॉडल उपलब्ध कराता है. imaginal डिस्क उत्थान अध्ययन और पंचर / microinjection लोग घायल हो गए में संयुक्त अग्रिम ऊतकों की मरम्मत के साथ अच्छी तरह से संरक्षित घटकों को खोजने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस प्रोटोकॉल McGinnis लैब, किम ए गदा और यूसुफ सी. पियर्सन के पिछले सदस्यों के सहयोग से विकसित किया गया है. हम मूल्यवान कंपनियों के शेयरों को संगठित करने और वितरित करने के लिए अपने काम के लिए ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र द्वारा जारी प्रयासों धन्यवाद. इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R01 GM077197 और K12 GM68524) और हर्बर्ट स्टर्न के परिवार से धन के द्वारा समर्थित किया गया. MTJ वर्तमान में अल्पसंख्यक स्वास्थ्य और स्वास्थ्य असमानताओं पर राष्ट्रीय संस्थान से अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र और अनुदान संख्या 8G12MD7603 -27 से अनुदान संख्या 5G12RR003060-26 के द्वारा समर्थित है. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी अल्पसंख्यक स्वास्थ्य और स्वास्थ्य असमानताओं या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान पर राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
yeast Sigma Aldrich 51475
apple juice Generic
agar Fisher Scientific 50-824-297
bleach Generic
halocarbon oil, 700 W Sigma Aldrich H8898
halocarbon oil, 27 W Sigma Aldrich H8773
1-phenoxy-2-propanol Sigma Aldrich 484423
hydrogen peroxide Fisher Scientific H324
methyl-β-cyclodextrin Sigma Aldrich C4555
toluidine blue Sigma Aldrich 89640
formaldehyde, 16% Polysciences, Inc 18814-20 toxic chemical
heptane Fisher Scientific H360-1 toxic chemical
methanol Fisher Scientific A412-1 toxic chemical
10x PBS Fisher Scientific 50-899-90013
0.5 M EGTA Fisher Scientific 50-255-956
RNase free H2O Fisher Scientific BP2819-100
Drosophila incubator Genessee Scientific 59-197
fly cage Genessee Scientific 59-100
embryo collection tube Genessee Scientific 46-101
plastic Petri dish Fisher Scientific 50-202-037
double-stick tape Generic
paintbrush Generic
dissection needle Fisher Scientific 08-965A sharp object
glass cover slip Thermo Scientific 3306 sharp object
microscope slide Thermo Scientific 4445 sharp object
dissecting microscope Carl Zeiss Stemi-2000
capillary needle FHC 30-30-1 sharp object
needle puller Narishige PC10
microinjection needle holder Narishige MINJ4
micromanipulator Narishige MN151
inverted microscope Carl Zeiss Primo-Vert
glass Petri dish Fisher Scientific 08-747A sharp object
glass Pasteur pipette Fisher Scientific 22-063-172 sharp object
transfer bulb Fisher Scientific 03-448-25
Kimwipe Fisher Scientific 06-666A
scintillation vial Fisher Scientific 03-337-7 sharp object
orbital shaker Fisher Scientific 14-259-260
1.5 ml tube Fisher Scientific 05-408-129
laser scanning confocal Leica SP2
fixation solution (5 ml)
16% formaldehyde 2.5 ml toxic chemical
10x PBS 0.5 ml
0.5 M EGTA 0.5 ml
RNase free H2O 1.5 ml
Halocarbon oil mix (10 ml)
halocarbon oil, 700 W 5 ml
halocarbon oil, 27 W 5 ml

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 81 घाव microinjection एपिडर्मल स्थानीयकरण, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) आनुवंशिक परिवर्तन
Microinjection घाव परख और<em&gt; में विवो</em&gt; एपिडर्मल का स्थानीयकरण रिस्पांस रिपोर्टर में घाव<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण.
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Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, … More

Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.. J. Vis. Exp. (81), e50750, doi:10.3791/50750 (2013).

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