Summary
Het murine cervicale harttransplantatie model is geschikt voor immunologische en ischemie-reperfusie schade studies. We pasten de procedure met een niet-hechtingsmanchet techniek en uitgevoerd meer dan 1000 succesvolle transplantaties met deze benadering.
Hierin geven we meer details van deze techniek om de video te vullen.
Abstract
Muismodellen zijn van bijzonder belang in het onderzoek omdat een groot aantal monoklonale antilichamen en commercieel gedefinieerd inteelt en knockout stammen zijn mechanistisch presteren in vivo studies. Terwijl harttransplantatie modellen met behulp van een hechting techniek werden voor het eerst met succes ontwikkeld in ratten, werd de vertaling in een even wijdverbreid gebruikte muizen gelijkwaardig nooit vanwege de technische complexiteit van de microchirurgische procedure bereikt. Daarentegen werden niet hechtingsmanchet technieken ook oorspronkelijk ontwikkeld in ratten met succes aangepast voor gebruik in muizen 1-3. Deze techniek voor revascularisatie omvat twee belangrijke stappen die ik) everting het ontvangende vaartuig over een polyethyleen manchet; II) het trekken van de overdragende vaartuig over de voorheen buiten gekeerde ontvangende vaartuig en houdt het op zijn plaats met een rondlopende band. Dit zorgt voor een continuïteit van de endotheliale laag, korte werktijd en zeer hoge doorgankelijkheid 4.
t "> Met deze techniek voor vasculaire anastomose voerden we meer dan 1000 cervicale harttransplantatie met een totale succespercentage van 95%. Voor arteriële instroom gemeenschappelijke halsslagader en de proximale aorta anastomose werden resulteert in een retrograde perfusie van het getransplanteerde hart. Voor veneuze drainage de longslagader van het transplantaat anastomose met de externe halsader van de ontvanger 5.Hierin geven we meer details van deze techniek om de video te vullen.
Introduction
Harttransplantatie is de behandeling van keuze voor patiënten met verschillende eindstadium hartziekten. Vooruitgang in chirurgische technieken, meer effectieve profylaxe van infecties, en nieuwe immunosuppressieve behandelingen resulteerde in sterk verbeterde uitkomst van orgaantransplantatie 6. Echter langdurige transplantaatoverleving niet strikt verbeterd in de afgelopen jaren 7. Chronische afstoting, gekenmerkt door transplantatie arteriosclerose blijft een belangrijk obstakel voor langdurige transplantaatoverleving 8-11 zijn.
Het model van heterotope harttransplantatie bij muizen een belangrijk en nuttig instrument voor analyse van immunologisch mechanisme tijdens acute en chronische afstoting 12-15.
Tot op heden de meest voorkomende transplantatie model nog steeds de buik muis harttransplantatie met de hechtdraad techniek. De opstijgende aorta van het donorhart anastomose aan de abdominal aorta en de longslagader wordt geanastomoseerd naar onderste holle ader van de ontvanger. Veel van de microchirurgische moeilijkheid van de hechtdraad model is gebaseerd op de geringe omvang van de schepen, die gehecht 16,17.
In tegenstelling tot de hechtdraad model het hart wordt geplaatst in de nek van de ontvanger wanneer de externe halsslagader wordt anastomose de longslagader en de gemeenschappelijke halsslagader de aorta van de donor.
De grondgedachte van de ontwikkeling van cervicale harttransplantatie model met de manchet techniek was een diermodel, waardoor een hoog succespercentage met basis microchirurgische vaardigheden die brede toepassing van dit model zal hebben. De grote voordelen van deze werkwijze zijn aanzienlijk minder voorkomende anastomose complicaties zoals bloedingen en trombose in vergelijking met de hechtdraad model 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieren worden gehuisvest in een barrière pathogeen gratis faciliteit. Alle dieren krijgen menselijke zorg in overeenstemming met de "Opdrachtgevers van Laboratory Animal Care" opgesteld door de National Society for Medical Research "en de" Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren "opgesteld door de National Academy of Sciences en gepubliceerd door de National Institutes of Health (NIH Publication No. 86-23, herzien 1985). Alle experimenten worden goedgekeurd door het Oostenrijkse Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Cultuur.
1 Ontvanger Voorbereiding
- Verdoven het ontvangende dier met een im injectie van xylazine (5 mg / kg lichaamsgewicht) en ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht).
- Verwijder alle haren van de laterale cervicale regio van het dier en schrob het operatiegebied drie keer met chlorhexdine.
- Plaats de muis in een liggende positie op het operatiegebied.
- Vervolgens maak je een incisie in de huid van de halsader incision rechts onderkaak.
- Vervolgens botweg mobiliseren van de juiste externe halsader (EJV) en verdeel de takken tussen ligaturen.
- Dan verdeel het EJV tussen ligaturen en zorg ervoor dat voldoende lengte te laten aan de proximale stomp buiten keren over de manchet lichaam.
- Vervolgens verwijdert u de juiste kwab van de glandula submandibularis.
- Voor de veneuze anastomose langs het proximale uiteinde van de EJV door het polyetheen manchet en repareren aan het handvat van de manchet met een micro klem.
- Verwijder de ligatuur aan het einde van het vat Evert de lumen over de manchet en zet deze vast met een 8-0 zijden lus (figuur 1a).
- Vervolgens doorsnijden rechts sternocleidomastoideus met bipolaire cauterisatie om toegang tot de gemeenschappelijke halsslagader krijgen.
- Volgende mobiliseren de gemeenschappelijke halsslagader en snijd het schip tussen de ligaturen.
- Volgende mobiliseren de gemeenschappelijke halsslagader en snijd het schip tussen de ligaturen.
- Passeer de disTal einde van het vat door de manchet en zet deze vast met de slagader klem.
- Verwijder de ligatuur aan het einde van het vat en uitzetten met het lumen vasculaire dilatators. Vervolgens, in analogie met het EJV Evert de slagader op de manchet en zet deze vast met een 8-0 zijden lus.
2 Heart Procurement
- Verdoven de donor muis met een im injectie van xylazine (5 mg / kg lichaamsgewicht) en ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht). Verwijder vervolgens alle haren van de buikstreek van het dier. Schrob de operatieve veld drie keer met chlorhexdine. Volgende plaats de muis in een liggende positie op het operatiegebied zoals eerder beschreven.
- Na een middellijn incisie in de buik, trek de ingewanden met Q-tips naar links om de vena cava inferior (IVC) bloot te leggen.
- Injecteer 400 ui van een 1: 4 heparine natrium oplossing in de IVC voor heparinisatie.
- Voer een thoracotomie en vouw de voorste borstwand dan craniaal naar acc krijgeness naar het hart.
- Verwijder vervolgens de thymus en maak ontluchten insnijdingen in de linker en rechter superieure vena cava.
- Vervolgens perfuseren het hart in een retrograde wijze met 4 ° C HTK oplossing canule van de aortaboog met een 27 G injectiespuit op het niveau van de brachycefale tak.
- Afbinden van de lagere en hogere vena cava met 8-0 zijde en verdeel ze distaal aan de ligaturen.
- Vervolgens verdelen de aortaboog op het niveau van de vorige infusen en ontleden gratis de truncus pulmonalis en verdeel het zo ver distaal mogelijk.
- Naar aanleiding van dat, bind de longaders met een bulk ligatie en verdeel ze distaal aan de ligaturen.
- Ten slotte wordt het hart van de donor plaats en bewaar het in 4 ° Celsius HTK oplossing (figuur 1b).
3 Implantatie
- Leg het hart graft in de ontvangende halsgebied in een omgekeerde positie (figuur 1c
- Vervolgens trekt u de pulmonale stam van het hart over de ader manchet constructie van de ontvanger en bevestig deze met een zijden lus (figuur 1d).
- Voer de anastomose tussen de aorta van de graft en eversie slagader van de ontvangende dieren op dezelfde wijze (Figuur 1e).
- Vervolgens verwijdert de veneuze klem, gevolgd door de arteriële klem. Het hart wordt gereperfundeerd en begint te slaan binnen 1-2 minuten. Tijdens reperfusie bevochtigen het hart met warme (35 ° Celsius) zoutoplossing.
- Tot slot sluit de chirurgische wond met 6-0 continue hechtingen (Figuur 1e).
4 postoperatieve zorg, Endpoint
- Geven tot 0,3 ml fysiologisch zout ip postoperatief voor vloeistof substitutie.
- Plaats het dier onder een warmtelamp tot ontwaken uit narcose.
- Eenmaal wakker, de terugkeer van de dieren naar de behuizing faciliteit waar zij ontvangen voedsel en water ad libitum.
- Naar Minimaliseren pijn tijdens de eerste postoperatieve dagen 7 toedienen carprofen (4 mg / kg elke 12 uur subcutaan (sc). Bovendien geven buprenorfine (0,1 mg / kg) direct na de operatie iedere 12 uur gedurende 5 dagen.
- Verkrijgen van het gewicht (g) van elke ontvanger dier wekelijks te beoordelen voor een goede voedingsinname. Als er sprake is van meer dan 10-15% gewichtsverlies ten opzichte van het gewicht op de operatie-datum, apathie, verlammende of een gebogen rug, offeren het dier met behulp van terminal isofluraan inademen voordat het klinische eindpunt bereiken. Ook offeren het dier nadat het hart is afgewezen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont representatieve gegevens overleving van cardiale allogene uit BALB / c donoren na transplantatie in volledige MHC mismatch C57BL / 6 ontvangers. Harten worden op dag 7 ± 1 na transplantatie afgewezen. Finger palpatie van de getransplanteerde allograft is een gevoelige methode voor het tijdsafhankelijke verloop van transplantaatafstoting detecteren. Alle syngenetische harttransplantaties uitgevoerd in onze serie overleefde voor onbepaalde tijd (> 150 dagen).
Figuur 1: Intraoperative foto's (a) Operative veld tijdens ontvanger voorbereiding (b) Hart transplantaat na de verkrijging (c) Het hart graft geplaatst in de ontvanger halsgebied in een omgekeerde positie (d + e) De donor plaats voorafgaand.... implantatie. (f) Schematische weergave ziekustrating het ontvangende vaartuig, de overdragende vaartuig en de manchet
Figuur 2: cardiale allograft overleving. Kaplan-Meier grafiek weergeven van de overleving van cardiale allograft van BALB / c muizen na transplantatie in volledig MHC mismatched BL6 ontvangers (n = 7; gemiddelde overlevingstijd = 7 dagen) en een syngene controlegroep (n = 7; transplantaatoverleving > 150 dagen). De dag van afstoting werd gedefinieerd als de dag waarop het hartslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Afwijzing van gevasculariseerde transplantaten brengt een overvloed aan verschillende stappen die alleen onvoldoende kan worden beoordeeld aan de hand van in vitro modellen. Fenomenen zoals de sensibilisering van de ontvangers, antigen processing in secundaire lymfoïde organen maar ook de differentiatie en proliferatie van immuun-competente cellen zijn beter gekarakteriseerd in vivo. Diermodellen zijn daardoor de ideale tool voor translationeel onderzoek 16. Muismodellen vertegenwoordigen nog altijd de gouden standaard in de basis transplantatie en immunologische onderzoek sinds een breed scala van transgene en knockout muizen zijn beschikbaar, en een groot aantal immunologische en diagnostische instrumenten zijn exclusief ontwikkeld voor muizen 18. Het murine cervicale harttransplantatie model een uniek instrument bevat pakken en uitvoeren mechanistische studies in verband met ischemie reperfusie schade, immunosuppressie, acute en chronische afstoting en tolerantie inductie 1-3, 17, 22.
De muis abdominale harttransplantatie model middels een hechting techniek werd eerst beschreven door Corry et al. 1973 19. Technische uitdagingen in verband met de suture- anastomose van kleine vaartuigen evenwel beperkt het wijdverbreide gebruik.
In 1991, Matsuura et al. Leidt het cervicale harttransplantatie model met een niet-hechtingsmanchet techniek bij muizen 16. Sinds de introductie van Zimmerman et al. En Kamada en Calne "de manchet technique" is gebruikt voor microvasculaire anastomoses in verschillende muismodellen van orgaantransplantatie 20-22.
We hebben een aangepaste non-hechtingsmanchet techniek voor revascularisatie ontwikkeld en hebben meer dan 1.000 succesvolle transplantaties in de afgelopen jaren aangevuld met slagingspercentages> 95%. Verschillende combinaties stam en behandelingsregimes gebruikt. Het toepassen van de techniek beschreef hijre, kan de totale operatie tijd worden teruggebracht tot ongeveer 45 minuten. Belangrijk is de totale ischemie tijd 20 min bewaard bij een implantatie van minder dan 7 min, die in tegenstelling gewoonlijk meer dan 15 min bij gebruik van de hechtdraad techniek 23. Vergeleken met de muis abdominale harttransplantatiemodel, cervicale harttransplantatie heeft verschillende voordelen, zoals kleine postoperatieve stress en hoge chirurgische slagingspercentage. De hartslag graft kan eenvoudig worden gecontroleerd door de oppervlakkige positie. Complicaties geassocieerd met hechtdraad anastomose, zoals bloeden en trombose aanzienlijk minder algemeen gebruikt bij de manchet techniek 18.
De volgende wijzigingen van dit voorstel door onze groep hebben geleid tot een betere kans op succes en een drastische vermindering van de bedrijfstijd techniek:
- Gebruik een retrograde perfusie door de aortaboog met 3 ml HTK oplossing.
- Houd het hart vochtig met HTK solution gedurende de hele oogst procedure.
- Niet ontleden en selectieve Ligeer de linker vena cava superior.
- Gebruik de micro klemmen om de schepen af te sluiten, maar, belangrijker nog, ook aan de manchetten te repareren.
- Gebruik vasculaire dilatators met superfijne tips om de gemeenschappelijke halsslagader, waardoor het veel gemakkelijker om het schip buiten keren over de manchet uitzetten.
- Plaats geen met hechtingen zo origineel beschreven door Matsuura et al.
- Voor de arteriële anastomose in een manchet met een binnendiameter van 0,5 mm en een buitendiameter van 0,63 mm, de veneuze anastomose een manchet met een binnendiameter van 0,75 mm en een uitwendige diameter van 0.94 mm.
- Gebruik manchetten met een lengte van 2 mm met een 1 mm handvat dat dient om de juiste bevestiging aan het vaartuig, met een vasculaire klem.
Een beperking dat deze werkwijze zou kunnen hebben is dat het moeilijk kan zijn om passende manchetten verkrijgen. We gebruikten ook commercieel verkrijgbaar polyethylene manchetten uit RIVERTECH medische (Chattanooga, TN).
Belangrijkste trouble shooting tijdens de procedure is als volgt.
Doorbloeding stoornis: Flush donorhart totdat de kleur wordt wit van kleur. Flush zonder al te veel druk als hoge druk beschadigt de graft.
- Moeilijkheid om het schip buiten keren over de manchet: Ga na dat het schip is (een) van voldoende lengte, (b) vrij van vastzittend vet en bindweefsel en (c) ervoor te zorgen dat het schip was goed opgezwollen, met vasculaire dilatators.
- Bloeden op anastomotische website: gebruik van Q-tips om druk uit te oefenen op de getroffen site voor ongeveer 5 minuten.
- Veneuze bloedstroom obstructie: Voornamelijk veroorzaakt door torsie van de halsader tijdens de processen van de cuff. Verwijder de manchet handvat van de veneuze plaats.
- Graft draaien en wurging: Zorg ervoor dat het transplantaat goed in de donor zijde is geplaatst voorafgaand aan het sluiten van de huid.
in vivo studies met betrekking tot transplantatie-immunologie. Onze gewijzigde aanpak maakt het mogelijk met een hoog succespercentage met basis microchirurgische vaardigheden die een brede toepassing van dit model zal toelaten. Deze video is bedoeld om te helpen en te begeleiden andere onderzoeken naar het model in hun laboratoria te vestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm | Aesculap | FE720K | |
| Micro vessel clip | S & T | B1 00396 V | |
| Microscissor | FST | 14075-11 | |
| Vesseldilatator | S & T | D-5a.2 00125 | |
| Microforceps | FST | Dumont 11271- 30 | |
| Clipapplicator | S & T | CAF-4 00072 | |
| Microvessel clip | S & T | B1 00396 V |
References
- Brandacher, G., et al. Tetrahydrobiopterin compounds prolong allograft survival independently of their effect on nitric oxide synthase activity. Transplantation. 81, 583-589 (2006).
- Schneeberger, S., et al. The effect of secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) on ischemia/reperfusion injury in cardiac transplantation. Am J Transplant. 8, 773-782 (2008).
- Sucher, R., et al. IDO and regulatory T cell support are critical for cytotoxic T lymphocyte-associated Ag-4 Ig-mediated long-term solid organ allograft survival. JImmunol. 188, 37-46 (2012).
- Yamashita, K., et al. Heme oxygenase-1 is essential for and promotes tolerance to transplanted organs. FASEB J. 20, 776-778 (2006).
- Kienzl, K., et al. Proteomic profiling of acute cardiac allograft rejection. Transplantation. 88, 553-560 (2009).
- Aurora, P., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: tenth official pediatric lung and heart/lung transplantation report--2007. J Heart Lung Transplant. 26, 1223-1228 (2007).
- Häyry, P. Chronic allograft vasculopathy new strategies for drug development. Transplant Proc. 30, 3989-3990 (1998).
- Hosenpud, J. D. Immune mechanisms of cardiac allograft vasculopathy an update. Transpl Immunol. 1, 237-249 (1993).
- Libby, P., Pober, J. S.
- Kouwenhoven, E. A., de Bruin, R. W., Heemann, U. W., Marquet, R. L., Ijzermans, J. N. Late graft dysfunction after prolonged cold ischemia of the donor kidney inhibition by cyclosporine. Transplantation. 68, 1004-1010 (1999).
- Kouwenhoven, E. A., Ijzermans, J. N., de Bruin, R. W. Etiology and pathophysiology of chronic transplant dysfunction. Transpl Int. 13, 385-401 (2000).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Huang, X., Chen, D., Chen, L. [A modified model of cervical heterotopic cardiac transplantation for chronic rejection research]. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22, 1508-1510 (2008).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nat Protoc. 2, 471-480 (2007).
- Wang, C. Y., et al. Suppression of murine cardiac allograft arteriopathy by long-term blockade of CD40-CD154 interactions. Circulation. 105, 1609-1614 (2002).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Tomita, Y., et al. Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. 64, 1598-1601 (1997).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplant Proc. 11, 571-577 (1979).
- Maglione, M., et al. Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ischemia reperfusion injury in a mouse model. Am J Transplant. 10, 2231-2240 (2010).
- Heron, I. A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats. Actapathologica et microbiologica Scandinavica Section A, Pathology. 79, 366-372 (1971).
