Summary
뮤린 자궁 심장 이식 모델은, 면역뿐만 아니라 허혈 재관류 손상 연구에 매우 적합하다. 우리는 비 봉합 커프 기술을 사용하여 절차를 수정이 방법으로 1,000 개 이상의 성공적인 이식을 수행 하였다.
여기서, 우리는 비디오를 보충하기위한이 기술의 추가 정보를 제공합니다.
Abstract
마우스 모델은 단일 클론 항체의 다양한 이후 연구에 특별한 관심의 상업적 근친 정의 녹아웃 균주의 생체 내 (in vivo) 연구 기계적인 수행 할 수 있습니다. 봉합 기술을 사용하여 심장 이식 모델을 처음 성공적으로 쥐에서 개발 된 반면, 동일하게 널리 사용되는 쥐의 동등한로 번역이 미세 절차의 기술적 복잡성으로 인해 실현되지 않았습니다. 대조적으로, 또한, 쥐의 초기 개발 비 봉합 커프 기술들이 성공적으로 생쥐 1-3에서 사용하기에 적합 하였다. 혈관 재 형성을위한이 기술은 폴리에틸렌 커프 위에받는 용기 everting 개의 주요 단계 I)을 포함한다; II) 이전 everted받는 용기를 통해 기증자 용기를 당기고 원주 넥타이와 장소에 들고. 이것은 내피 층, 짧은 동작 시간 및 매우 높은 개존율 (4)의 연속성을 보장한다.
t는 "> 혈관 문합을 위해이 기술을 사용하여 우리는 경동맥 유입 동맥를 들어. 95 %의 성공률로 1,000 명 이상의 자궁 심장 이식을 수행 근위 대동맥 궁은 이식 된 심장의 역행 관류의 결과로 문합 하였다. 정맥 배수 이식의 폐동맥받는 사람 (5)의 외부 경정맥과 문합 하였다.여기서, 우리는 비디오를 보충하기위한이 기술의 추가 정보를 제공합니다.
Introduction
심장 이식은 다른 말기 심장 질환으로 고생하고있는 환자들을위한 선택의 치료를 나타냅니다. 수술 기법, 감염의 더 효과적인 예방 및 새로운 면역 억제 요법의 발전은 장기 이식 6에서 현저하게 향상된 결과를 초래. 그러나, 장기 이식 생존율은 지난 7 년 동안 엄격하게 개선되지 않았습니다. 이식 동맥 경화에 의해 특징 만성 거부, 장기 이식 생존 8-11에 큰 장애물이되고 있습니다.
생쥐 이소성 심장 이식 모델은 급성 동안 면역 학적 메커니즘의 분석을위한 중요하고 유효한 도구뿐만 아니라 만성 거부 반응 12-15을 제공합니다.
현재까지 가장 흔한 이식 모델은 봉합 기술을 사용하여 복부 마우스 심장 이식은 여전히있다. 기증자 심장의 대동맥이에 문합된다bdominal 대동맥과 폐동맥받는 사람의 하대 정맥에 문합된다. 봉합 모델 미세 어려움의 대부분은 16, 17을 봉합 용기의 작은 크기에 기초한다.
봉합 모델 달리 심장 외부 경정맥은 폐동맥 및 경동맥 기증자의 대동맥에 문합되는 수신자의 목 영역에 배치된다.
커프 기술을 사용하여 자궁 심장 이식 모델의 개발의 이론적 근거는이 모델의 광범위한 응용을 허용 기본적인 미세 기술로 높은 성공률을 달성 할 수 있도록 동물 모델을 가지고 있었다. 이 방법의 주요 이점은 봉합 모델 (18)에 비해 출혈 및 혈전증과 같은 합병증을 관련 현저히 적게 발생 문합이다.
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Protocol
동물은 장벽 무균 시설에서 보관되어 있습니다. 모든 동물은 국가에 의해 의료 연구를위한 국가 사회 "및"국립 과학 아카데미에 의해 제조 실험 동물 "의 관리 및 사용을위한 설명서에 의해 공식화 및 출판"실험 동물 관리의 주체 "을 준수하여 인간의 서비스를받을 수 보건원 (NIH 공개 NO. 86-23은 1985 년 개정). 모든 실험은 교육 과학 문화의 오스트리아 교육부에 의해 승인됩니다.
1받는 사람 준비
- 자일 라진 (xylazine) (5 ㎎ / ㎏ 체중) 및 케타민 (100 ㎎ / ㎏ 체중)의 IM 주사받는 동물을 마취.
- 동물의 측면 자궁 지역의 모든 머리를 제거하고 수술 필드에게 chlorhexdine를 사용하여 세 번 닦습니다.
- 수술 필드에서 누운 자세에서 마우스를 놓습니다.
- 다음 경정맥 포함에서 피부 절개를오른쪽 아랫 부리에 ision.
- 그 후, 퉁명스럽게 오른쪽 외부 경정맥 (EJV)을 동원 합자 사이의 가지를 나눕니다.
- 그런 다음 커프 몸 근위 그루터기 에버트하기에 충분한 길이를 떠날 확인하는 합자 사이의 EJV를 나눕니다.
- 다음 악하선의 오른쪽 엽을 제거합니다.
- 정맥 문합를 들어 폴리에틸렌 커프를 통해 EJV의 기단부를 통과하고 마이크로 클램프 커프의 핸들에서 문제를 해결할.
- , 용기의 끝 부분에있는 합자를 제거 커프를 통해 루멘 에버트와 8-0 실크 루프 (그림 1a)로 고정한다.
- 그 후 경동맥에 액세스 할 양극성 소작과 오른쪽 흉쇄 근육을 가로로 쪼개다.
- 다음 경동맥을 동원하고 합자 사이의 혈관을 잘라.
- 다음 경동맥을 동원하고 합자 사이의 혈관을 잘라.
- DIS 합격탈의 팔목을 통해 용기의 끝은 동맥 클램프로 고정한다.
- 용기의 단부에 봉합사를 제거하고, 혈관을 사용 dilatators 루멘 넓히다. 다음에, EJV 유사하게, 커프 위에 동맥 에버트 및 8-0 실크 루프로 고정한다.
2 심장 조달
- 자일 라진 (xylazine) (5 ㎎ / ㎏ 체중) 및 케타민 (100 ㎎ / ㎏ 체중)의 IM 주사 공여 마우스를 마취. 그리고 동물의 복부의 모든 머리를 제거합니다. chlorhexdine를 사용하여 수술 필드에 세 시간을 스크럽. 수술 필드에서 앙와위에서 마우스 전술 된 바와 같이 다음 장소.
- 중간 선 복부 절개에 따라, 하대 정맥 (IVC)를 노출하기 위해 왼쪽에 Q-팁을 내장을 철회.
- 헤파린에 대한 IVC에 4 헤파린 나트륨 - 솔루션 : 1의 400 μl를 주입한다.
- ACC을 얻을 수 cranially를 통해 전방 흉벽을 개흉술을 수행하고 배심장에 ESS.
- 다음에, 흉선을 제거한 좌우 우수한 대정맥의 절개를 배출하게.
- 그 후, 완두 분기의 수준에서 27 G 주사기와 대동맥 삽관에 의해 4 섭씨 HTK 용액과 역행 방식으로 마음을 관류.
- 8-0 실크 열등한 우수한 대정 맥을 결찰과 합자로 원심을 나눕니다.
- 다음 이전 삽관의 수준에서 대동맥 궁을 분할하고 폐동맥을 무료로 해부하고 가능한 한 멀리 원심을 나눕니다.
- 그 후, 대량의 결찰 폐 혈관을 묶고 합자로 원심을 나눕니다.
- 마지막으로, 공여 부위에서 심장을 제거하고 4 ° 섭씨 HTK 용액 (그림 1b)에 보관합니다.
3 주입
- 거꾸로 위치에받는 사람의 목 지역에서 심장 이식을 배치 (그림 1C
- 다음받는 사람의 정맥 커프 구조를 통해 심장의 폐동맥을 끌어와 실크 루프 (그림 1D)로 고정한다.
- 이식편의 대동맥과 같은 방식 (그림 1E)에서받는 동물의 everted 동맥 사이의 문합을 수행합니다.
- 이어서, 동맥 클램프이어서 제 정맥 클램프를 제거. 심장 재관류하고 1 ~ 2 분 이내에 치기 시작합니다. 재관류 동안 따뜻한 (35 ° 섭씨) 식염수로 마음을 적 십니다.
- 마지막으로 6-0 연속 봉합 (그림 1E)와 수술 상처를 닫습니다.
(4) 수술 후 관리, 엔드 포인트
- 유체 교체 수술 후 0.3 ml의 생리 식염수의 IP를 부여합니다.
- 마취에서 각성 할 때까지 가열 램프 아래에있는 동물을 놓습니다.
- 깨어 나면, 그들은 물과식이를받을 주거 시설에 동물을 반환합니다.
- MI하려면제 7 수술 후 일 동안 nimize 통증 carprofen (4 ㎎ / kg 매 12 시간의 피하 (SC)를 관리 할 수 있습니다. 또한, 오일에 바로 수술 후) Buprenorphin마다 12 시간을 (0.1 ㎎ / ㎏을 제공합니다.
- 적절한 영양 섭취에 대해 평가하기 위해 각받는 사람 동물 주간의 무게 (g)을 얻었다. 이상 ~ 15 %의 체중 감소의 증거가 수술 최신 무관심 마비 또는 매우 구부러진 뒤쪽에 비해 중량이있는 경우, 임상 적 종점에 도달하기 전에 단말기 흡입 이소 플루 란을 이용하여 동물을 희생. 심장이 거부 된 후에 또한 동물을 희생.
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Representative Results
그림 2는 완전히 MHC 일치하지 않는 C57BL / 6받는 사람에 이식 후 BALB / C의 기증자로부터 심장 이식을 대표하는 생존 데이터를 보여줍니다. 마음은 이식 후 일 7 ± 1에 거부됩니다. 이식 된 동종의 손가락 촉진은 동종 이식 거부 반응의 시간 의존적 과정을 감지하는 중요한 방법이다. 우리의 시리즈에서 수행되는 모든 동계 심장 이식 무기한 생존 (> 1백50일).
그림 1 : 수술 중 사진받는 사람 준비하는 동안 () 수술 필드 조달 후 (b)의 심장 이식 (C) 거꾸로 위치에받는 사람의 목 영역에 배치 심장 이식 (D + E) 전에 공여부.... 주입한다. (f)의 아픈 회로도받는 용기, 기증자 용기와 커프를 ustrating
그림 2 : 심장 이식 생존. 완전히 MHC- 부정합 BL6 수신자로 이식 후 BALB / c 마우스로부터 심장 동종 이식편의 생존 기간을 표시 카플란 - 마이어 플롯 (N = 7; 평균 생존 기간 = 7 일)뿐만 아니라 동계 대조군 (N = 7; 이식편 생존 > 150일). 거부의 일이 심장 박동의 정지의 일로 정의 하였다.
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Discussion
혈관 이식의 거부는 충분히 체외 모델에서 사용하여 평가 될 수있는 다른 단계의 과다를 수반한다. 받는 사람의 감작 항원 처리 이차 림프 기관에서뿐만 아니라 면역 능력 세포의 분화 및 증식 같은 현상은 생체 내에서 특성화 수 있습니다. 동물 모델함으로써 중개 연구 (16)을위한 이상적인 도구입니다. 마우스 모델은 여전히 형질 전환 유전자 녹아웃 마우스의 넓은 범위 때문에 기본적인 이식 및 면역 학적 연구에서 금을 나타내는 표준을 사용할 수 있으며, 면역 학적 및 진단 도구의 다수 마우스 (18)만을 위해 개발되어왔다. 쥐의 자궁 심장 이식 모델은 문제를 해결하고 허혈 재관류 손상, 면역 억제, 급성 및 만성 거부와 관용 유도 1-3, 17, 22과 관련된 기계적인 연구를 수행 할 수있는 독특한 도구를 제공합니다.
봉합 기술을 사용하여 마우스의 복강 심장 이식 모델은 제 코리 외 의해 설명되었다. 1973 19. 작은 혈관 suture- 문합과 관련된 기술적 과제 그러나, 그것의 광범위한 사용을 제한했다.
1991 년, 마츠우라 동부 표준시 알. 쥐 16에서 비 봉합 커프 기술을 이용하여 자궁 경부 심장 이식 모델을 소개했다. 짐머만 등. 및 Kamada 및 Calne "커프 기술"에 의해 도입 이후 장기 이식 20-22 여러 가지 다른 쥐 모델에서 미세 혈관 문합 사용되어왔다.
우리는> 95 % 성공률, 혈관 재 형성을위한 수정 된 비 봉합 커프 기술을 개발하고 지난 몇 년 동안 1,000 명 이상의 성공적인 이식을 완료했습니다. 여러 다른 변형 및 조합 치료 요법을 사용 하였다. 기법을 적용하는 것은 그 설명다시, 전체 작동 시간은 약 45 분으로 감소 될 수있다. 중요한 것은 전체 허혈 시간은 봉합 기술 (23)을 사용하는 경우와 달리 보통 15 분 이상이다 7 분 미만의 주입 시간이 20 분으로 유지 될 수있다. 마우스 복부 심장 이식 모델에 비해 자궁 심장 이식은 수술 후 약간의 스트레스와 높은 수술 성공률과 같은 몇 가지 장점을 가지고 있습니다. 심장 이식의 구타는 쉽게 표면 위치로 인해 모니터링 할 수 있습니다. 커프 기술 18를 사용하는 경우 봉합 문합 포함 출혈 및 혈전증과 관련된 합병증으로는 훨씬 적은 일반적이다.
우리 그룹 개선 성공률과 동작 시간의 극적인 감소를 이끌었다 의해 제안이 기술의 다음 변형 :
- 3 ML HTK 용액과 대동맥 궁을 통해 역 행성 관류를 사용합니다.
- HTK 졸을 사용하여 촉촉한 마음을 유지전체 수확 절차를 수행하는 동안의 ution.
- 왼쪽 우수한 대정 맥을 해부 선택적 결찰하지 마십시오.
- 수갑을 해결하기 위해 또한 중요한 혈관을 폐색 만하는 마이크로 클램프를 사용합니다.
- 훨씬 쉽게 커프를 통해 선박을 입으 할 수 경동맥을 넓히다하는 극상의 팁 혈관 dilatators를 사용합니다.
- 마츠우라 등으로 설명 원본과 봉합을 잡고 놓지 마십시오.
- 동맥 문합 0.75 mm의 내경 및 0.94 mm의 외경 정맥 문합에 대해 0.5 mm의 내경 및 0.63 mm의 외경과 커프 커프를 사용한다.
- 혈관 클램프를 사용하여 용기에 적절한 고정하는 역할을 1mm 핸들을 포함하여 2mm의 길이와 소매를 사용합니다.
이 방법이있을 수 있습니다 하나의 한계는 적절한 커프를 구입하기 어려울 수 있기 때문입니다. 따라서 우리는 상업적으로 이용 가능한 페이지를 사용의료 Rivertech (채터 누가, TN)에서 olyethylene 갑.
다음과 같은 절차를 수행하는 동안 주요 트러블 슈팅이었다.
혈류 장애 : 색상까지 세척 기증자 심장 색 흰색이된다. 과도한 압력의 손해에 너무 많은 압력 이식없이 세척합니다.
- 난이도 커프 위에 용기를 에버트하기 : 용기가 있음을 확인하라 (a) 충분한 길이, (b) 첨부 지방 및 결합 조직 및 (c) 용기 혈관 dilatators를 사용하여 잘 팽창 것을 확인 프리의.
- 문합 부위에서 출혈 : 약 5 분 동안 영향을받는 사이트에 압력을 적용하는 Q-팁을 사용합니다.
- 정맥 혈류 폐색 : 주로 커프 배치 프로세스 중에 경정맥의 비틀림에 의해 발생. 정맥 사이트에서 커프 핸들을 제거합니다.
- 이식 왜곡과 교살 : 이식 전에 피부 폐쇄 기증자 측에서 제대로 배치되어 있는지 확인합니다.
생체 내에서 어떠한 기계적인위한 황금 표준 남아있다. 우리의 수정 된 접근 방식은이 모델의 광범위한 응용 프로그램을 수 있도록 기본 미세 기술로 높은 성공률을 달성 할 수 있습니다. 이 동영상은 도움이 자신의 실험실에서 모델을 수립하기 위해 다른 연구를 안내하는 것을 목표로하고있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm | Aesculap | FE720K | |
| Micro vessel clip | S & T | B1 00396 V | |
| Microscissor | FST | 14075-11 | |
| Vesseldilatator | S & T | D-5a.2 00125 | |
| Microforceps | FST | Dumont 11271- 30 | |
| Clipapplicator | S & T | CAF-4 00072 | |
| Microvessel clip | S & T | B1 00396 V |
References
- Brandacher, G., et al. Tetrahydrobiopterin compounds prolong allograft survival independently of their effect on nitric oxide synthase activity. Transplantation. 81, 583-589 (2006).
- Schneeberger, S., et al. The effect of secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) on ischemia/reperfusion injury in cardiac transplantation. Am J Transplant. 8, 773-782 (2008).
- Sucher, R., et al. IDO and regulatory T cell support are critical for cytotoxic T lymphocyte-associated Ag-4 Ig-mediated long-term solid organ allograft survival. JImmunol. 188, 37-46 (2012).
- Yamashita, K., et al. Heme oxygenase-1 is essential for and promotes tolerance to transplanted organs. FASEB J. 20, 776-778 (2006).
- Kienzl, K., et al. Proteomic profiling of acute cardiac allograft rejection. Transplantation. 88, 553-560 (2009).
- Aurora, P., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: tenth official pediatric lung and heart/lung transplantation report--2007. J Heart Lung Transplant. 26, 1223-1228 (2007).
- Häyry, P. Chronic allograft vasculopathy new strategies for drug development. Transplant Proc. 30, 3989-3990 (1998).
- Hosenpud, J. D. Immune mechanisms of cardiac allograft vasculopathy an update. Transpl Immunol. 1, 237-249 (1993).
- Libby, P., Pober, J. S.
- Kouwenhoven, E. A., de Bruin, R. W., Heemann, U. W., Marquet, R. L., Ijzermans, J. N. Late graft dysfunction after prolonged cold ischemia of the donor kidney inhibition by cyclosporine. Transplantation. 68, 1004-1010 (1999).
- Kouwenhoven, E. A., Ijzermans, J. N., de Bruin, R. W. Etiology and pathophysiology of chronic transplant dysfunction. Transpl Int. 13, 385-401 (2000).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Huang, X., Chen, D., Chen, L. [A modified model of cervical heterotopic cardiac transplantation for chronic rejection research]. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22, 1508-1510 (2008).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nat Protoc. 2, 471-480 (2007).
- Wang, C. Y., et al. Suppression of murine cardiac allograft arteriopathy by long-term blockade of CD40-CD154 interactions. Circulation. 105, 1609-1614 (2002).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Tomita, Y., et al. Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. 64, 1598-1601 (1997).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplant Proc. 11, 571-577 (1979).
- Maglione, M., et al. Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ischemia reperfusion injury in a mouse model. Am J Transplant. 10, 2231-2240 (2010).
- Heron, I. A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats. Actapathologica et microbiologica Scandinavica Section A, Pathology. 79, 366-372 (1971).
