Murint Cervical hjertetransplantasjon Model Ved hjelp av en modifisert Cuff Technique

Summary

Den murine cervical hjertetransplantasjonsmodell er godt egnet for immunologiske, så vel som iskemi reperfusjonsskade studier. Vi endret prosedyren ved hjelp av en ikke-sutur cuff teknikk og utført mer enn 1000 vellykkede transplantasjoner med denne tilnærmingen.

Heri, gir vi flere detaljer om denne teknikken for å supplere video.

Abstract

Muse modeller er av spesiell interesse i forskning siden et bredt utvalg av monoklonale antistoffer og kommersielt definert innavlet og knockout-stammer er tilgjengelige for å utføre mekanistisk in vivo studier. Mens hjertetransplantasjon modeller ved hjelp av en sutur teknikk ble først hell utviklet hos rotter, ble oversettelse til en like utbredt brukt murine tilsvar aldri oppnådd på grunn av den tekniske kompleksiteten av mikrokirurgisk prosedyre. I motsetning til dette ble det ikke-sutur cuff teknikker, også utviklet opprinnelig hos rotter, med hell tilpasset for bruk i mus ^1-3. Denne teknikken for revaskularisering involverer to store skritt I) ever mottakeren fartøy over en polyetylen mansjett; II) trekker donor fartøy over tidligere everted mottakeren fartøy og holde den på plass med en omkrets slips. Dette sikrer kontinuitet i endothelial laget, kort driftstid og svært høye patency priser ^fire.

t "> Ved hjelp av denne teknikken for vaskulær anastomose vi utført mer enn 1000 livmorhalshjertetransplantasjoner med en samlet suksessrate på 95%. For arteriell tilsig felles halspulsåren og den proksimale aortabue ble anastomoseres resulterer i en retrograd blodgjennomstrømming i transplantert hjerte. For venøs drenering lungearterien av graftet ble anastomoseres med ytre halsvenen til mottakeren ^fem.

Heri, gir vi flere detaljer om denne teknikken for å supplere video.

Introduction

Hjertetransplantasjon representerer behandling av valg for pasienter som lider av ulike end-stage hjertesykdommer. Fremskritt innen kirurgiske teknikker, mer effektiv profylakse mot infeksjoner, og romanen immunsuppressive regimer resulterte i markant forbedret utfallet av organtransplantasjon ^seks. Imidlertid har langsiktig pode overlevelse ikke bedret strengt de siste årene ^7. Kronisk avvisning, preget av transplantasjon arteriosklerose fortsetter å være et stort hinder for langsiktig pode overlevelse ^8-11.

Modellen av heterotop hjertetransplantasjon hos mus gir en viktig og gyldig verktøy for analyse av immunologisk mekanisme under akutt så vel som kronisk avvisning ^12-15.

Til dags dato den hyppigste transplantasjon modellen er fortsatt magemusehjertetransplantasjon ved hjelp av sutur teknikk. Den stigende aorta til donorhjerte er anastomosert til enbdominal aorta og lungearterien er anastomoseres til mottakerens vena cava inferior. Mye av mikro vanskelighetsgrad sutur modellen er basert på den lille størrelsen på skipene, som er suturerte ^16,17.

I motsetning til sutur-modellen hjertet er plassert i halsregionen for mottakeren, hvor den ytre halsvenen er anastomosert til lungearterien og den felles karotidarterie aorta av donor.

Begrunnelsen for utvikling av livmorhalshjertetransplantasjon modellen ved hjelp av mansjetten teknikken var å ha en dyremodell, som gjør det mulig å oppnå høy suksessrate med grunnleggende mikro ferdigheter som vil tillate bred anvendelse av denne modellen. De viktigste fordeler med denne fremgangsmåte er betydelig mindre forekommende anastomose relaterte komplikasjoner som blødning og trombose i forhold til sutur-modellen ^18.

Protocol

Dyr er plassert i en barriere patogen gratis anlegget. Alle dyr får menneskelig omsorg i samsvar med "Rektorer av Laboratory Animal Care" formulert av National Society for Medical Research "og" Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr "utarbeidet av National Academy of Sciences og publisert av National Institutes of Health (NIH Publikasjon nr. 86-23, revidert 1985). Alle forsøkene er godkjent av den østerrikske departementet for utdanning, vitenskap og kultur.

1. Mottaker Forberedelse

1. Bedøve mottakeren dyret med en IM injeksjon av xylazin (5 mg / kg kroppsvekt) og ketamin (100 mg / kg kroppsvekt).
2. Fjern alle hår av den laterale nakken av dyret og skrubbe den operative felt tre ganger ved hjelp av chlorhexdine.
3. Plasser mus i en liggende stilling på det operative området.
4. Neste gjøre et snitt i huden fra vena incision til høyre nedre kjeven.
5. Deretter rett ut mobilisere retten ytre halsvenen (EJV) og dele grenene mellom ligaturer.
6. Deretter dele EJV mellom ligaturer og sørg for å forlate nok lengde for vreng den proksimale stump over mansjetten kroppen.
7. Neste fjerne høyre lapp av kjeve kjertel.
8. For det venøse anastomose passere den proksimale enden av EJV gjennom polyetylen mansjetten og festes på håndtaket av mansjetten med en mikroklemme.
9. Fjern ligatur ved enden av fartøyet, vrengning av hulrommet over mansjetten og festes med en 8-0 silke sløyfe (Figur 1a).
10. Deretter transekt riktig sternocleidomastoideus med bipolar kirurgi for å få tilgang til det felles halspulsåren.
11. Neste mobilisere felles halspulsåren og kutte fartøy mellom ligaturer.
12. Neste mobilisere felles halspulsåren og kutte fartøy mellom ligaturer.
13. Passere distal slutten av fartøyet gjennom mansjetten og fikse det med arterien klemmen.
14. Fjern ligatur ved enden av fartøyet og distend hulrommet ved hjelp av vaskulære dilatators. Neste, i analogi til EJV Evert arterien over mansjetten og fikse det med en 8-0 silke loop.

2. Hjerte Procurement

1. Bedøve donor-mus med en IM injeksjon av xylazin (5 mg / kg kroppsvekt) og ketamin (100 mg / kg kroppsvekt). Deretter fjerner alle hår av mageregionen av dyret. Skrubb operative feltet tre tid bruker chlorhexdine. Neste sted musen i en liggende stilling på det operative felt som tidligere beskrevet.
2. Etter en midtlinje abdominal snitt, trekke innvollene med Q-tips til venstre for å avdekke vena cava inferior (IVC).
3. Injisere 400 mL av en 1: 4 heparin- natrium- løsning i IVC for heparinise.
4. Utfør en Thoracotomi og brett den fremre brystet veggen over kranialt å få access til hjertet.
5. Deretter fjerner thymus og gjøre lufting snitt i venstre og høyre superior vena cava.
6. Deretter perfuse hjertet i en retrograd måte med 4 ° Celsius HTK løsning ved kanylering av aortabue med en 27 G sprøyte på nivået av den brachiocephalic gren.
7. Ligate inferior og superior vena cava med 8-0 silke og dele dem distalt for ligaturer.
8. Neste dele aortabuen på nivået av det foregå kanylering og dissekere fri lunge stammen og dele det så langt distalt som mulig.
9. Etter det, knytte lungevenene med en bulk ligation og dele dem distalt for ligaturer.
10. Til slutt fjerner hjertet fra donor området og lagre den i 4 ° Celsius HTK løsning (Figur 1b).

3. Implantasjon

1. Plasser hjerte transplantat i mottakerens nakkeregionen i en opp-ned stilling (figur 1c
2. Neste trekk lunge stammen av hjerte over venen cuff konstruere av mottakeren og fikse det med en silkesløyfe (figur 1d).
3. Utfør anastomose mellom aorta av graftet og vrengt arterie til mottakeren dyret på samme måte (figur 1E).
4. Deretter fjernes den venøse klemmen først, etterfulgt av den arterielle klemmen. Hjertet er reperfusert og begynner å slå innenfor 1-2 min. Under reperfusjon fukte hjertet med varmt (35 ° Celsius) saltvann.
5. Til slutt lukke operasjonssåret med 6-0 kontinuerlige suturer (figur 1E).

4. Postoperativ Care, Endpoint

1. Gi opp til 0,3 ml fysiologisk saltvann ip postoperativt for væskeerstatning.
2. Plasser dyret under en varmelampe før man våkner fra narkose.
3. Når de er våkne, returnerer dyret til boliganlegg hvor de mottar mat og vann ad libitum.
4. Til MInimize smerte i løpet av de første 7 dager postoperative administrere karprofen (4 mg / kg hver 12. time subkutant (sc). Videre gir Buprenorphin (0,1 mg / kg) umiddelbart etter operasjonen hver 12. time i 5 dager.
5. Skaff vekt (g) til hver mottaker dyr ukentlig for å vurdere for riktig næringsinntak. Hvis det er tegn på mer enn 10-15% vekttap i forhold til vekt på kirurgi-date, apati, ødeleggende eller en veldig bøyd rygg, ofre dyret ved hjelp av terminal isofluran innånding før de når den kliniske endepunktet. Også ofre dyret etter at hjertet har blitt avvist.

Representative Results

Figur 2 viser representative overlevelsesdata av hjerte allografts fra BALB / c givere etter transplantasjon til full MHC umake C57BL / 6 mottakere. Hjerter blir avvist på dag 7 ± 1 etter transplantasjonen. Finger palpasjon av det transplanterte allograft er en følsom metode for å oppdage tidsavhengig løpet av allograft avvisning. Alle syngene hjertetransplantasjoner utført i vår serie levde på ubestemt tid (> 150 dager).

Figur 1: intraoperativ bilder (a) operative feltet under forberedelse mottager (b) Hjerte pode etter anskaffelser (c) Hjertet pode plassert i mottakerens halsregionen i en opp-ned stilling (d + e) donor området før.... implantering. (f) Prinsippskisse sykustrating mottakerfartøyet, donor fartøyet og mansjetten

Figur 2: Cardiac allograft overlevelse. Kaplan-Meier plott som viser overlevelse av hjertestans allograft fra BALB / c mus etter pode inn fullt MHC- umake BL6 mottakere (n = 7; bety overlevelse tid = 7 dager) samt en syngene kontrollgruppe (n = 7; graft overlevelse > 150 dager). Dagen for avvisning ble definert som dagen for opphør av hjerteslag.

Discussion

Avvisning av vascularized allografts innebærer en mengde ulike trinnene som bare kan være utilstrekkelig vurderes ved hjelp av in vitro-modeller. Fenomener som sensibilisering av mottakere, antigen prosessering i sekundære lymfoide organer, men også i differensiering og proliferasjon av immunkompetente celler er bedre karakterisert ved vivo. Dyremodeller er dermed det ideelle verktøy for translasjonell forskning ^16. Musemodeller fortsatt representerer gullstandarden i grunnleggende transplantasjon og immunologisk forskning siden et bredt spekter av transgene og genet knockout-mus er tilgjengelig, og et stort antall immunologiske og diagnostiske verktøy har blitt utviklet eksklusivt for mus ^18. Murine livmorhalshjertetransplantasjon modellen tilbyr et unikt verktøy for å håndtere spørsmål og utføre mekanistiske studier relatert til iskemi reperfusjonsskade, immunsuppresjon, akutt og kronisk avvisning og toleranseinduksjon ^{1-3, 17, 22.}

Musen abdominal hjertetransplantasjon modellen ved hjelp av en sutur teknikken ble først beskrevet av Corry et al. I 1973 ^19. Tekniske utfordringer knyttet til suture- anastomose av små fartøy imidlertid begrenset sin utbredt bruk.

I 1991 Matsuura et al. Introduserte livmorhalshjertetransplantasjon modellen ved hjelp av en ikke-sutur cuff teknikk i mus ^16. Siden introduksjonen av Zimmerman et al., Og Kamada og Calne "mansjetten teknikken" har blitt brukt for mikrovaskulær anastomose på flere forskjellige murine modeller av organtransplantasjon ^20-22.

Vi har utviklet en modifisert non-sutur cuff teknikk for revaskularisering og har gjennomført over 1000 vellykkede transplantasjoner i de siste årene, med suksessrate> 95%. Flere forskjellige belastningskombinasjoner og behandlingsregimer ble brukt. Anvende teknikken beskrev hanre, kan den totale driftstiden reduseres til omtrent 45 min. Viktigere den totale iskemi tid kan holdes i 20 min med en implantasjon på mindre enn 7 min, som i kontrast er vanligvis mer enn 15 min ved bruk av sutur ²³ teknikken. Sammenlignet med musen abdominal hjertetransplantasjon modell, har livmorhalshjertetransplantasjonen flere fordeler, for eksempel mindre postoperativ stress og høy kirurgisk suksessrate. Den hjerteslag pode lett kan overvåkes på grunn av den overfladiske stilling. Komplikasjoner assosiert med sutur anastomose, inkludert blødning og trombose er betydelig mindre vanlig ved bruk av mansjetten ¹⁸ teknikken.

De følgende modifikasjoner av denne teknikken er foreslått av vår gruppe førte til en forbedret suksessrate og en dramatisk reduksjon av driftstiden:

• Bruk en retrograd perfusjon gjennom aortabuen med 3 ml HTK løsning.
• Holde hjertet fuktig ved hjelp av HTK solution under hele høsteprosedyren.
• Ikke dissekere og selektiv ligate venstre superior vena cava.
• Bruk mikro klemmer til occlude fartøy, men enda viktigere, også for å fikse ermet.
• Bruk vaskulære dilatators med Superfine tips til distend arteria carotis communis som gjør det mye enklere å vrengning av fartøy over mansjetten.
• Ikke plasser holder sting som opprinnelig beskrevet av Matsuura et al.
• For det arterielle anastomose bruke en mansjett med en innvendig diameter på 0,5 mm og en utvendig diameter på 0,63 mm, til den venøse anastomose en mansjett med en innvendig diameter på 0,75 mm og en utvendig diameter på 0,94 mm.
• Bruk mansjetter med en lengde på 2 mm med en 1 mm håndtak som tjener til sin riktige fiksering til fartøyet ved hjelp av en vaskulær klemme.

En begrensning for at denne metoden kan ha, er at det kan være vanskelig å få tak i egnede mansjetter. Vi brukte derfor kommersielt tilgjengelig polyethylene mansjetter fra RIVERTECH medisinsk (Chattanooga, Tennessee).

Hoved feilsøking under inngrepet var som følger.

Blodstrømmen lidelse: Skyll donor hjerte til fargen blir hvit i fargen. Flush uten for mye press som stort trykk skader pode.

• Vanskeligheter for vreng fartøyet over mansjetten: konstatere at fartøyet er (a) av tilstrekkelig lengde, (b) fri for festet fett og bindevev og (c) sørge for at fartøyet var vel oppblåst, ved hjelp av vaskulære dilatators.
• Blødning på anastomotic site: bruke Q-tips til å legge press på berørte området for ca 5 min.
• Venøst ​​blod flyte obstruksjon: Hovedsakelig på grunn av torsjon i halsvenen i løpet av prosesser av mansjetten plassering. Fjern mansjetten håndtaket på den venøse nettstedet.
• Graft kronglete og kvelning: Kontroller at pode er plassert riktig i giversiden før huden nedleggelse.

in vivo-studier i forbindelse med transplantasjon immunologi. Vår endret tilnærmingen gjør oppnå høy suksessrate med grunnleggende mikro ferdigheter som vil tillate bred anvendelse av denne modellen. Denne videoen har som mål å hjelpe og veilede andre forskere å etablere modellen i sine laboratorier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm	Aesculap	FE720K
Micro vessel clip	S & T	B1 00396 V
Microscissor	FST	14075-11
Vesseldilatator	S & T	D-5a.2 00125
Microforceps	FST	Dumont 11271- 30
Clipapplicator	S & T	CAF-4 00072
Microvessel clip	S & T	B1 00396 V