Summary
포유류의 외피는 개별 종의 화학 성분 특성을 제공 할 수있는 용매 추출 지질이 포함되어 있습니다. 이 논문은 박막 크로마토 그래피를 사용하여 외피 조직으로부터 격리 광범위한 지질 클래스 분리 및 매트릭스 - 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 형 질량 분광 분석에 의해 triacylglyceride 프로파일을 결정하기위한 통상적 인 방법을 제시한다.
Abstract
포유 동물의 외피는 피부 표면에 유성 물질을 분비하는 피지선이 포함되어 있습니다. 피지 생산은 병원성 미생물에 대한 보호이다 타고난 면역 시스템의 일부입니다. 비정상 피지 생성 및 화학 조성물은 또한 특정 피부 질환의 임상 증상이다. 피지는 종 특이하다 triacylglycerides 포함 지질의 복잡한 혼합물이 포함되어 있습니다. 다양한 지질 클래스에 의해 전시 된 다양한 화학적 특성 피지 조성물의 특정 결정을 방해. 지질에 대한 분석 기법은 일반적으로 노동 집약적 증가 샘플 준비 비용 있습니다 화학 유도체 화를 필요로한다. 이 논문은 박층 크로마토 포유류 외피, 분리 광범위한 지질 클래스로부터 지질을 추출하고, 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 형 질량 분석계를 사용 triacylglyceride 내용을 프로파일 링하는 방법을 설명합니다. 이 강력한 방법은 직접 측정 할 수종 및 개인간 triacylglyceride 프로파일, 그리고 용이 포유류의 임의의 분류 학적 그룹에 적용 할 수있다.
Introduction
포유류의 외피 조직은 표피 각질 구조 (예를 들어, 머리와 손톱), 및 외분비 샘이 (가) 있습니다. 피지선 형 외분비 샘은 공동으로 좌창 부 (1)이라고합니다 모낭과 연결되어 있습니다. 피지선은 피지이라 피부 표면에 기름 삼출물을 놓습니다. 피지는 glycerolipids (예 triacylglycerides [태그]), 유리 지방산의 acyls (유리 지방산), 스테롤 / 왁스 에스테르, 스쿠알렌으로 주로 구성되어있다. 피지의 화학적 조성은 종 특이이있다. 선천성 면역계의 일부인 및 항균 기능 3을 제공 할뿐만 아니라, 지질, 피부 피지선 4까지 증발 수분 손실, 셀룰러 무결성 및 유전자 조절 (5) 및 약물 흡수 6 등 중요한 생리 학적 과정에 영향을 미친다. 피지 지질 조성물은 질환의 마커 역할을 할 수 있습니다. 변경 비율 및 피지선 (B)의 양도로 지질 클래스는 다른 사람 (10) 사이에 여드름 7, 8 비듬, 지루성 피부염 8 asteatosis 9, 같은 질병의 임상 증상입니다. 표피와 헤어 조직 스테롤 및 파생 상품, 태그, 유리 지방산, 세라마이드, 인지질 및 기타 사소한 지질 성분을 함유 변수 프로파일을 포함한다. 외피 지질, 질병 프로세스에서 작동 할 수 있기 때문에 건강하고 병에 걸린 사람 사이의 태그의 화학 성분의 차이를 결정하는 것은 질병의 임상 진단에 유용 할 수 있습니다.
지질은 일반적으로 비극성 또는 하나 비극성 극성 치환체 (11)와 불용성 유기 화합물로 정의된다. 지질 구조체가 긴 탄화수소 사슬 (왁스 에스테르, 유리 지방산, 알콜, 케톤, 알데히드 등) 산소화 알칸, 또는 콜레스테롤 (12)과 같은 복잡한 고리 구조 일 수있다. 구조를 기반으로 지질의 주요 8 클래스 (유리 지방산, glycerolipi이 있습니다DS [GL] glycerophospholipids에 따라 화학적 특성의 다양한 전시 [GP], 스핑 고리 피드 [SP], 스테롤 지질 [ST], 프레 놀 지질 [PR] saccharolipids [SL] 및 polyketides [PK), 클래스 13. 때문에 지질 클래스의 화학적 특성의 폭 넓은 변화에 지질 분자의 사전 유도체없이 직접 프로파일이 요구되고있다. 지질 연구 한 출사 방법은 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 형 질량 분석 (MALDI-TOF MS) (14)와 결합하여 박층 크로마토 그래피 (TLC)이다.
MALDI-TOF MS는 단백질을 식별하고 인해 트립신 소화 단백질 (15)로부터 생성 된 매우 정확한 펩타이드 이온 질량 "지문"을 특정 아미노산 서열에 연결하는 단백체 연구에서 광범위하게 사용된다. MALDI-TOF MS는 또한 태그 16-18과 같은 지질을 포함하는 다른 생체 분자 클래스를 프로파일 링하는 데 이용 될 수있다. MALDI는 행렬, 일반의 사용을 필요방향족과 공액 이중 결합 구조를 포함하는 유기 화합물을 ically. 매트릭스 분자는 온화, 분석 물에 레이저 에너지를 전달 양성자 전달을 촉진하고, 단독 청구 가스상 19-21 이온을 생성하는 역할을한다. 이온은 고 진공하에 높은 전압 필드를 실시하고 이온이 연속적 그들의 질량 대 전하 비율에 비례하는 속도 차이에 의해 분리된다 TOF 질량 분석기로 가속된다. 심지어 매우 큰 생체 분자 간략화 스펙트럼 분석을위한 단독 청구 분자 이온 종을 생산, 작은 조각으로 이온화 될 수있다. 이전 유도체 화하지 않고 직접 지질 분자를 분석 할 수있는 능력은 lipidomic 연구 18 MALDI-TOF MS의 준비 채택을 추진하고있다.
이 논문은 머리에서 외피 지질을 분리하고 분석 할 수있는 일상적인 방법을 제시, 피지 분비와 동부 붉은 박쥐의 plagiopatagium (Lasiurus boreali들). 이것은 화이트 코 증후군 (WNS) (22)의 질병 과정을 설명하기 위하여 박쥐 외피 지질의 종간의 차이를 확인하는 데 사용됩니다. WNS는 박쥐의 곰팡이 질환과 Geomyces가 23-25 destructans 새로 설명 호냉 종에 의해 발생합니다. WNS는 5 백만 북미 동굴 박쥐의 죽음의 원인 및 농업 산업 (26, 27)에 손상 수십억 달러의 잠재적 인 경제적 영향과 취약 박쥐 종의 멸종을 위협하고있다. G.의 단계를 조사하려면 감염 destructans, 지질은 동부 붉은 박쥐의 머리와 날개 조직에서 추출하고, MALDI-TOF MS에 의한 후속 분석을 위해 태그 부분을 분리하기 위해 TLC에 의해 광범위한 지질 클래스로 구분됩니다. 태그는 짧은 아실 체인을 포함하고 쉽게 작은 매트릭스 간섭 MALDI-TOF MS에 의해 감지됩니다.
Protocol
주의 : 사전에 처리 수송, 박쥐를 저장하기위한 모든 필요한 주 및 연방 정부의 허가를 얻습니다. 승인은 기관의 동물 관리 및 사용위원회뿐 아니라 기관 바이오 안전성위원회의에서도를 얻을 수 있어야합니다. 라이브 배트 (또는 신경계 조직)이 처리되는 경우, 동물 처리기는 광견병 백신을 접종한다. 현재의 연구에 사용 된 박쥐는 표준 방법 (아칸소 주립 대학의 기관 바이오 안전성위원회의 승인 번호 135349-1) 28에 따라 2010 년 여름 동안 오 자크 세인트 프랜시스 국립 산림, AR에서 수집되었다.
1. 조직 처리 및 지질 추출
- 이전과 다른 개인의 조직 모음 사이에 메탄올 모든 악기를 청소합니다. 125 ㎖의 삼각 플라스크에 가위와 장소, 피부에서 헤어 (약 1.0 g)을 낸다. 클로로포름으로 적신 6면 공 - 4로 피부를 문질러 날개 표면에서 샘플 피지: 메탄올 용매 (C : M; 3시 2분 V / V), 별도의 플라스크에 이들을 배치합니다.
- C 10 ㎖로 조직을 추출 : M (2 : V / V)의 산화 (29)를 방지하기 위해 0.5 % 부틸 히드 록시 톨루엔 (BHT)를 포함. 만 HPLC 품질 용제를 사용합니다.
- 2 시간 후, 각 플라스크에 약 0.5 g에게 무수 황산을 추가 간략하게 혼합하고, 여과지로 여과하여 용매를 수집합니다.
- 반복 두 번 1.2 및 1.3 단계를 반복합니다. M. 일단 1:1 C 1:2 C와 M 순차적으로 풀 함께 여과 액.
- N 2 기류하에 풀링 여액을 증발, 건조 중량을 결정하고, 3:2의 C 지질 잔기 용해 : 10 ㎎ / ㎖의 농도로 M (0.5 % BHT를 가진). -20 ° C에서 유리 병에 보관 샘플 그것은 시료 채취 후 1 개월 이내에 샘플을 분석하고 동결 해동 사이클을 최소화하기 위해 일반적으로 가장 좋습니다.
2. 분취 박층 크로마토 그래피에 의해 분리 지방질
- 사전 솔벤트 세척 1.5 ml의 microce에 준비, M을 아세톤으로 세척하고, 공기 건조 : 3시 2분 C로 작성하여 ntrifuge 관. 이것은 나중에 질량 분석기 분석을 방해 할 수있는 가소제를 제거하기위한 것입니다. 먼지가없는 용기에 샘플 튜브를 저장하고 피부 오일의 오염을 방지하기 위해 전용 장갑이 튜브를 처리 할 수 있습니다.
- M. : 첫 번째 3시 2분 C로 미리 개발하여 TLC 판을 활성화 1 ㎝의 깊이로 TLC 챔버에 충분한 용매를 추가 한 다음 (가까운 유리 뚜껑) 챔버 플레이트를 배치하고 용매 플레이트의 상단에 완벽하게 실행할 수 있습니다. 이것은 약 45 분 소요됩니다.
- 용매 증발 (약 15 분)까지 흄 후드에서 플레이트와 건조를 제거한 다음 120 ℃에서 적어도 10 분 동안 오븐에 배치 샘플이 적용될 때 방향을 유지하기 위해 판의 상단에 연필로 표시를합니다. 시료와 표준이 위치 할 기준선을 표시하기 위해, 1.5 cm 판의 아래쪽 가장자리에서 직선 연필 선을 배치합니다.
- 를 절단하여 TLC 챔버를 준비두 개의 짧은 벽을 줄 수있을만큼 크고 하나의 긴 벽 필터 종이 조각. 챔버에 필터 종이 라이너를 놓습니다. 그것은 용매 챔버에 완전히 젖은 추가됩니다 때.
- 디 에틸 에테르 : 초산 헥산입니다 용매 이동상, 100 ㎖의 준비 (H : E :를, 80:20:2 V / V / V). 약 1cm의 깊이를주기 위하여 상기 챔버에 용매를 붓는다. 챔버의 위쪽 가장자리를 따라 실리콘 그리스 씰을 사용하여 유리 뚜껑 커버. 실 사용하기 전에 하룻밤 평형을 허용합니다.
- 다른 가장자리에 1.5 cm에 하나의 가장자리에서 약 1.5 cm에서 연속 행진으로 모세관 또는 피펫으로 제조 된 판에 수동으로 샘플을 적용합니다. 이보다 균일 한 행진에서 샘플을로드하기 때문에 자동 시료 도포하는 것이 바람직하다. 약 20 μL 스테롤의 혼합물, 유리 지방산, 태그 및 스테롤 에스테르 표준 탐지하는 TLC 판의 바깥 쪽 차선을 사용 (10 ㎎에 사용 / ㎖, 미리 만들어진 혼합물을 얻을 수있다).
- 에로드 된 TLC 판을 놓습니다평형 뚜껑을 닫기 챔버, 플레이트를 개발 용매 때까지 위쪽 가장자리에 실행됩니다. 이것은 여기에 설명 된 이동상 약 45 분 소요됩니다. 챔버에서 접시를 제거하고 여분의 용매가 약 1 분 동안 흄 후드에있는 접시에서 증발 할 수 있습니다.
- 95 % 에탄올에 0.05 % 로다 민 6G에 스프레이. 장파장 자외선 램프하에 지질 밴드를 시각화. 연필로 마크 샘플 및 표준에서 해결 형광 밴드 R의 F 위치. 사진 기록은이 시점에서 취할 수 있습니다.
- TAG 표준에 해당하는 밴드를 확인하고 글라 신지 종이 무게의 큰 조각에 주걱으로 실리카를 긁어 판에서 제거합니다. 1.5 ㎖의 용매 세척 microcentrifuge 관에 실리카를 전송합니다.
- 3시 2분 C의 1.0 ML을 추가 : M 용매 샘플 튜브에 1 분 동안 초음파 처리는, 원심 분리하여 실리카 펠렛하고 새 미리 무게를 측정 관에 용매를 전송합니다. 반복 일E 이전 단계, 여액을 수영장, N이 스트림하에 용매를 증발.
- 추가 조직 샘플이 TLC로 분리하는 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 N 2에서 태그를 포함한 건조 된 잔류 물을 저장합니다. 로다 민 6G는 샘플에 존재하지만, 헥산에 불용이고 즉시 MS 분석 전에 샘플 중에 용해 제거된다.
3. MALDI-TOF MS에 의한 TAG 분석
- 용매 1 ㎖ (49.5 % 에탄올 49.5 % 아세토 니트릴, 및 1 % 수성 0.1 % TFA)에서 10 ㎎의 CHCA 용해하여 신선한 α-시아 노 -4 - 히드 록시 - 신 남산 (CHCA) 매트릭스 용액을 준비한다.
- 10 pmol의 / μl를 얻기 위해 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA)의 39.5 μL와 ACTH (1 ㎎ / ㎖) 1 μl를 혼합하여 기기의 해상도와 감도 테스트를 위해, adrenocarticotropic 호르몬 (18-39 클립, 2465.1989 다 ACTH)를 준비 원액. 이는 향후 사용을 위해 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 신선한 작업 ACTH의 한 solut를 준비, 10 pmol의 / μL 원액 1 μl를 복용 9 ㎕의 0.1 % TFA와 혼합 한 다음 500 fmol를 얻기 위해 CHCA 매트릭스 용액 10 μL와 (1:1)을 혼합하여 이온 (1 pmol의 / μL) / ㎕의 농도.
- 3시 2분 C 10 ㎎ / ㎖에서 TAG 표준을 준비 MALDI의 계측기 교정에 대한 M (예 tricaprin [470.361 다], 트리 카 프릴 린 [554.455 다], [638.549 다]를 trilaurin [722.642 다]를 트리 팔미틴, [800.689 다]를 tripalmitolein ,, [806.736 다]를 trimyristin [884.783 다], 트리-11-eicosenoin [968.877 다]를 트리 올레 인 및 trierucin [1052.971 다]).
- 외부 잠금 질량 교정 TAG 표준에 대한 M : 3시 2분 C 10 ㎎ / ㎖에서 트리 올레 준비합니다.
- 10 ㎎ / ㎖ 용액에 헥산에 저장 TAG 샘플을 녹입니다.
- 0.5 M (77.06 mg/1.0 ml)을 시료와 표준 매트릭스로 사용하기에 90 % 메탄올 2,5 - 디 히드 록시 벤조산 (DHB)의 주식 솔루션을 준비합니다. 또한 NaOH를 1.0 M (2.0 g/50.0의 ML) 솔루션을 준비합니다. 알루미늄 FOI를 사용 DHB 용액 튜브를 덮 빛으로부터 보호하기 위해 L.
- 믹스 (사전 세척 튜브) 10.0 μL DHB 매트릭스, 10.0 ㎕의 샘플 또는 표준, 및 5.0 ㎕의 1.0 M NaOH를. 혼합 간략하게 아래로 혼합물을 가지고 튜브를 원심 분리기.
- 스팟 건조까지 데시 케이 터에서 MALDI 스테인리스 스틸 표적 판과 장소 상 표준, 샘플, 또는 ACTH의 1.0 μL. 데이터 수집을위한 장비로 표적 판을 놓습니다.
- 수행 MALDI-TOF MS는 긍정적 reflectron 모드에서 분석한다. 튜닝 및 ACTH와 TAG 표준 용액을 사용하여 기기의 제조자에 의해 설명 된대로 기기를 교정.
- 대상 접시에 발견 각 샘플에 대한 스펙트럼을 획득 (장비 사양과 일치,이 작품에 대한 매개 변수는 5 Hz에서 레이저 발사 속도, 평균 스펙트럼을 얻기 위해 자리 당 100 ~ 촬영했다). MALDI 스펙트럼의 배경을 부드럽게하고 뺀 후, 온라인 검색 엔진 지질 MAPS (수동 프로세스 이온 피크/ 도구 / MS / glycerolipids_batch "대상 ="_blank "> www.lipidmaps.org / 도구 / MS / glycerolipids_batch).
- 전구체 이온 강도 상자리스트에 목록의 스펙트럼을 복사하여 붙여 넣습니다. 원하는 아실 조성물로 검색을 제한합니다. 질량 / 충전 각 샘플의 스펙트럼에 존재하는 이온의 (M / Z) 비율에 의해 태그를 식별합니다. 지방산 메틸 에스테르 (FAME) 백분율은 별도의 GC / MS 분석에서 사용할 수있는 경우, 본 태그의 확률을 구하는 이러한 데이터를 추가한다.
INSTRUMENT : 본 연구에서 사용되는 질량 분석 장치는 (337 nm의 20 Hz에서 N 2 레이저를 탑재) 워터스 MALDI 마이크로 MX이다. 긍정적 reflectron 모드 능력을 가진 어떤 제조사의 MALDI 계기가 사용될 수있다. reflectron, 5,200 V,, 사용하는 일반 설정은 펄스 전압 2,000 V입니다 소스, 15,000 V, MassLynx 소프트웨어 (버전 4.0)를 사용하여 데이터 수집과 함께. 이러한 운영 조건은 12,000보다 큰 질량 해상도를 제공합니다.
Representative Results
Folch (30)에 의해 설명 조직의 총 지질을 분리하는 추출 방법은 여기에 적응하는 간단한 절차입니다. 조직 추출 및 용매를 증발시킨 후, 지질은 종종 황색 필름으로 나타납니다. 옐로우 색상은 대부분의 액체 - 액체 추출을 수행함으로써 제거 될 수 단백질 오염물로부터이다. 예비 TLC는 오염 물질에서 태그 부분을 분리하기 때문에 추가 샘플 처리는이 절차에서 필요하지 않습니다. 모든 필터링 단계에서 신선한 무수 황산나트륨의 추가는 정확한 지질 무게의 결정에 영향을 미치는 수질 오염을 줄일 수 있습니다.
포유류의 외피 지질 H와 예비 TLC에 의해 분석 : E를 : 모바일 상으로 보통 스테롤, 유리 지방산, 태그 및 스테롤 에스테르 / 왁스 에스테르 / 스쿠알렌 (그림 1) (원점에서 시작)에 해당하는 네 가지 밴드를 해결합니다. 경우에 analyti를 사용하는 경우E : H와 칼 고성능 (HP) TLC 이동상, 스테롤 에스테르, 왁스 에스테르, 스쿠알렌은 분리하고 별도의 세 가지 밴드로 나타납니다. 본 연구에 사용 된 조건에서, 스테롤 / 왁스 에스테르가 분리되지 않습니다. 에틸 에테르 (95:5 V / V)를, 그리고 HPTLC 플레이트 농도계를 스캔하여 분석 될 수있다 : 이들 대역은 관심이 있다면, 이동상 이소옥탄으로 전환 될 수있다. 다른 요소별로 분리가 발생할 수 있습니다. 이들은 일반적으로 일관된 품질 TLC 분리와 데이터를 얻기 위해, 챔버에 여과지를 배치 뚜껑에 단단히 밀착을 위해 그리스를 적용, 밤새 실을 평형화, 깨끗한 TLC 챔버를 유지하여 제거된다.
동부 적색 버트로부터 격리 태그 얻어진 주제 MALDI-TOF 질량 스펙트럼은도 2 및 3에 나타낸다. 비 수생 포유 동물에서 분리 된 태그에 일반적으로 사용되는 910, - 이러한 스펙트럼은 m / z 850 사이의 질량 범위 TAG 이온 피크를 포함의. 1.0 M NaOH를 첨가 단독으로 H + 이온보다 더 안정적 나 + 이온 충전을 촉진. 안정성 이외에, H + 및 K + 이온의 부재는 스펙트럼 분석의 용이성을 증가시킨다. M / Z는 850-910 이온 피크는 16시, 18시, 18시 1분에 대응하고 18시 2분 FA의 부분은 태그의 지배적 아실 성분 (표 1)을 주도했습니다. 태그 가능한 FA의 부분은 초기에 총 이온 m / z의 MALDI-TOF MS 스펙트럼에 존재하고, 추론 종과 개인 간의 차이에 의해 결정 될 수있다. 아실 콘텐츠의 특정 비율이 요구되는 경우에는, 그 다음 MS / MS 또는 가스 크로마토 그래피 (GC / MS)이 사용되어야한다. 아 비율에 대한 자세한 정보는 스펙트럼의 디아 실 글리세 라이드 지역 (그림 4)에서 피크를 관찰하여 추론 할 수있다. 디아 실 글리세 라이드는 MALDI 소스 TAG 분열에서 생산되고, m / z 590에서 찾을 수 있습니다 - 650 지역. TAG 조각화가 증가 할 수있다1.0 M의 NaOH (16)의 첨가를 생략. 동부 붉은 박쥐 날개 조직은 m / z 881.8 (각각 그림 2와 3)에서 지배적 인 피크 m / z 879.7 헤어 조직에서 지배적 인 피크에 의해 특징입니다. m / z 907.8, 879.7 및 855.7 (POP, PPO의)에서 피크가 853.7 존재 ~ 40 %의 피크 머리카락 조직에서 (~ 50 %) 강도도 약합니다.
| 구성 | 원소 조성 | 관측 된 질량 |
| 나 + 태그 | 나 + 태그 | |
| SSO | C 57 H 108 O 6 | 911.8 |
| OOS, LSS | C 57 H 106 O 6 | 909.8 |
| OOO, LnSS, LSO | C 57 H104 O 6 | 9,078 |
| LOO, LLS | C 57 H 102 O 6 | 905.8 |
| LLO, OOLn | C 57 H 100 O 6 | 903.7 |
| 평생 학습 | C 57 H 98 O 6 | 901.7 |
| LLLn | C 57 H 96 O 6 | 899.7 |
| LLnLn | C 57 H 94 O 6 | 897.7 |
| LnLnLn | C 57 H 92 O 6 | 895.7 |
| OSP | C 55 H 104 O 6 | 883.8 |
| LSP, OOP, SOPO | C 55 H 102 O 6 | 881.8 |
| LOP, LnSP, LSPo | C 55 H 100 O 6 </ TD> | 879.7 |
| LLP, LnOP, LOPo | C 55 H 98 O 6 | 877.7 |
| LnLP, LLPo, LnOPo | C 55 H 96 O 6 | 875.7 |
| LnLnP, LnLPo | C 55 H 94 O 6 | 873.7 |
| LnLnPo | C 55 H 92 O 6 | 871.7 |
| PPS | C 53 H 102 O 6 | 857.8 |
| POP, PPO의 | C 53 H 100 O 6 | 855.7 |
| OOM, PPL, PoPoS, 포포 | C 53 H 98 O 6 | 853.7 |
| PPLn, PPoL, PoPoO, MYOO | C 53 H 96 O 6 | 851.7 |
| LLM, LnOM | C 53 H 94 6 | 849.7 |
| PPP, SSLa | C 51 H 98 O 6 | 829.7 |
| PPPo, OSLa | C 51 H 96 O 6 | 827.7 |
| PPoPo, PMyO | C 51 H 94 O 6 | 825.7 |
| LnLnLa | C 51 H 86 O 6 | 817.6 |
| MMS, SLAP, PPM | C 49 H 94 O 6 | 801.7 |
| SLaPo, PPoM, PPMy | C (49) H 92 O 6 | 799.7 |
| PoPoM, OOCa | C 49 H 90 O 6 | 797.7 |
| MMP | C 47 H 90 O 6 | 773.7 |
| MMPo, OCAP | C 47 H 88 O6 | 771.7 |
| OCaPo | C 47 H 86 O 6 | 769.6 |
| MMM, PPCa, PMLa | C 45 H 86 O 6 | 745.6 |
| PoPCa, PoMLa | C 45 H 84 O 6 | 743.6 |
| PoPoCa | C 45 H 82 O 6 | 741.6 |
| LaLaP, MMLa, MCAP | C 43 H 82 O 6 | 717.6 |
| LaLaPo | C 43 H 80 O 6 | 715.6 |
| OO | C 39 H 72 O 5 | 643.5 |
| OL | C 39 H 70 O 5 | 641.5 |
| LL | C 39 H 68 O 5 | 639.5 |
| SP | C 37 H 72 O 5 | 619.5 |
| 영업 이익 | C 37 H 70 O 5 | 617.5 |
| LP | C 37 H 68 O 5 | 615.5 |
표 1. 지방산 조성, 원소 조성 및 triacylglycerides 및 디아 실 글리세 라이드의 sodiated 부가 물의 동위 원소 질량. Ln에이 = 리놀렌산 (18시 3분), L = 리놀레산 (18시 2분), O는 = 올레산 (18시 1분), S = 스테아르 산 (18시), P는 = 팔 미트 산 (16시), 포는 = 팔 미트 산 (16시 1분), M은 = 미리스트 산 (14시), 내 = myristoleic 산 (14시 1분) 라 = 우르 산 (12시), CA = 카 프릭 산 (10시).
그림 1. 디 에틸 에테르 : 아세트산 헥산 광범위한 지질 클래스 분리 박층 크로마토 그램(80:20:2 V / V / V)를 분리시켰다. 스테롤과 FFA 사이의 밴드는 표준에 의해 확인되지 않았습니다 만, 지방 알코올 또는 왁스 에스테르 수있다.
그림 2. sodiated 태그의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼의 확장 TAG 지역. - 동부 붉은 박쥐 (L. 보 리 얼리스) 날개 조직에서 (m / z 700 950) m / z 853.7 (KMS, PPL, PoPoS, 포포) 및 m에서 확인 봉우리 / z 879.7 (LOP, LnSP, LSPo가). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. 동부 붉은 박쥐 (L. 보 리 얼리스) 머리 조직에서 - sodiated 태그 (950 m / z 700)의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼의 확장 TAG 지역.m / z 905.8 (LOO, LLS) 및 m / z 907.8 (OOO, LnSS, LSO)에서 확인 봉우리. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. sodiated DAG 조각의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼 (m / z 530-730)의 DAG 지역. 동부 붉은 박쥐에서 (L. 보 리 얼리스) 날개 조직 m / z 643.5 (OO)과 m / z 615.5 (LP)에서 확인 봉우리 . 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
이 논문은 지질 분자의 시간이 소요되는 유도체 화하지 않고, 예비 TLC에 의해 포유 동물의 외피 분리 광범위한 지질 클래스를 분리 MALDI-TOF MS에 의해 TAG 프로파일을 결정하기위한 간단하고 강력한 방법을 제공합니다. MALDI-TOF MS와 태그의 품질의 스펙트럼을 생산하는 중요한 단계는 다음과 같습니다 최소한의 오염이나 산화를 가진 화합물 1) 성공적인 추출, 크로마토 그래피에 의한 2) 충분한 분리 및 격리하고, MALDI-TOF 3) 해상도와 질량 정확성을 MS.
이 논문은 TAG MS 프로파일을 얻기 위해 동부 붉은 박쥐의 plagiopatagium에서 중성 지질 부분을 추출하고 분리하여 방법을 보여줍니다. 본 연구는 박쥐 종 사용하는 동안 (포유 :보기 Chiroptera)이 방법은 모든 포유 동물 종의 외피 지질을 연구하기 위해 확장 할 수 있습니다. 박쥐 외피는 태그, 유리 지방산, squa의 낮은 금액으로, 주로 콜레스테롤 것을 특징으로렌 및 스테롤 / 왁스 에스테르. (- 인간의 7 % 만 26 - 1 박쥐의 62 %) 콜레스테롤이 더 큰 비율로 발생하는 동안 박쥐 피지의 지질 비율이 그 스쿠알렌에 인간과 다른 것은, (인간의 최대 16 % 반대) 낮은 양으로 존재하다 22 31. 28 %까지의 비율이 동부 붉은 박쥐의 머리에서 발견하는 동안 인간의 머리카락은 약 3 %의 태그가 포함되어 있습니다. 박쥐에서 지질 샘플의 추출은 다른 종과 유사하다. 이 연구에서, 용매에 담가 면봉은 피지를 제거하기 위해 사용되는 반면, 하나는 여러 번 외피의 표면에 용제를 함유하는 바이알 또는 샘플 튜브를 반전 할 수있다. 특수 테이프 제품은 표면 지질 32를 추출하는 대체 수단을 제공한다. 적절한 지질 추출의 중요한 부분은 피부 오일의 오염을 최소화하는 것입니다. 이것은 쉽게 모든 샘플 및 입고 검사 장갑 사이의 조직과기구를 닦고, 메탄올로 스퀴즈 병을 유지하고 모든 유리 식기를 분사하여 수행됩니다. 산화 오F는 불포화 acyls BHT의 추가를 통해 방지하고 불문 샘플에 저장된 온도의 사용되어야한다.
생체 분자 분석은 일반적으로 오염 물질의 관심의 개별 분자 크로마토 그래피 단계가 필요합니다. TLC는 가스 나 액체 크로마토 그래피에 대한 계측 요구 사항을 방지하고 견고하고 반복 가능한 결과를 달성하기 위해 덜 기술적 인 경험을 필요로이 방법에 사용됩니다. 또한 지질 수준에 따라 여러 가지 이동상은 통합 될 수있다. 또한, HPTLC 플레이트 및 주사 농도계의 사용은 정량적 결과를 얻기 위해 사용될 수있다. TLC 방법의 변화가 너무 많아서 여기에 모두 나열 할 수 있지만, 지질 TLC에 사용되는 몇 가지 일반적인 모바일 단계 클로로포름을 포함한다 : 비극성 지질 (28)의 분리를위한 에틸 에테르 : 메탄올 : 인지질 및 당지질 또는 이소옥탄의 분리를위한 물. E : 다른 지질 클래스, H에서 태그를 분리의 측면에서 너무lvent 시스템이 지속적으로 작동하고 비교 결과를 제공합니다.
TLC를 사용하는 또 다른 장점은 그 밴드 빠르게 분석 물질의 유도체 화 전에없이 MALDI-TOF MS를 이용하여 프로파일 링 될 수 있다는 것이다. 본 연구에서는 실리카 TLC 플레이트로부터 제거되고, 분석 물질은 용출 용매의 증발 및 흡착제를 분리하는 용매 및 이후 원심 분리에 초음파로부터 용출된다. 또한, 매트릭스 분석 밴드 TLC 플레이트에서 분리 한 다음 직접 MALDI-TOF MS (33)에 의해 분석에 직접 적용 할 수있다. MALDI-TOF MS에 의해 성공적으로 프로파일 링은 충분한 샘플 준비 및 튜닝 및 계측기를 교정와 운영자의 능력에 의존 않습니다. 악기는 그 분자 분자량 범위의 적절한을 다루는 표준을 매일 교정해야한다. 장비의 적절한 감도와 해상도 (예 : ≥ 10,000)도 confirme에해야ACTH 매일 거라고.
포유 동물의 외피의 표면에서 발견 피지의 지질 성분은 세균 / 곰팡이 병원균에 의해 식민지에 역할을 할 수 있습니다. 따라서 종 및 개인 간의 화학적 조성물의 기술은 인간 및 동물 질병의 프로세스에 대한 실마리를 제공 할 수있다. 질병과 건강한 사람 사이에 종자 간 차이가 임상 증상을 나타낼 수 있다는 질병 감지 및 진단에 도움. 미생물 성장을 억제하는 특정 화합물이 존재하는 경우 또한, 이러한 질환 치료 및 예방에 사용하기 위해 식별 될 수있다.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
지원은 실험 방법의 개발 기간 동안 스콧 Treece, Katelyn Arter, 제레미 Ragsdell, 토니 LaMark 제임스, 에이미 피셔, 한나 블레어, 그리고 샤이엔 GERDES에 의해 제공되었다. TLC 스캔 농도계에 대한 지원을 위해, 우리는 메디나 후에 연구소 (아칸소 생명 과학 연구소 루이스 H. 노포 - Olazabal)에 감사의 말씀을 전합니다. 아칸소 생명 과학 연구소에서 아칸소 자산 이니셔티브 P3 센터 (EPS-0701890) : MALDI-TOF MS는이 프로젝트에 사용되는은 NSF EPSCoR 해당, RII를 통해 제공되었다. 기금은 미국의 수산 동물 서비스 / 아칸소 주 야생 동물 그랜트, 국립 동굴 학 사회, 인디애나 주립 대학에서 북미 박쥐 연구 및 보존을위한 센터에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals, LLC | 101162 | www.mpbio.com |
| TLC Flexible Plates | Whatman | 4410-222 | www.whatman.com |
| ACTH | Sigma-Aldrich Chem. Co. | A8346-5X1VL | www.sigmaaldrich.com |
| Triolein | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 44895-U | |
| TLC Lipid Standard | TLC 18-1 | www.nu-chekprep.com | |
| MALDI TAG Standard | Nu-Check Prep., Inc. | NIH Code 53B | |
| MALDI TAG Standard | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 17810-1AMP-S | |
| Glass Vials with Teflon Cap | U.S. National Scientific Co. | B7800-2 | www.nationalscientific.com/ |
| DHB | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 50862-1G-F | |
| CHCA | Sigma-Aldrich Chem. Co. | C8982-10X10 mg | |
| Sebutape | CuDerm | S100 |
References
- Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland. Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).
- Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals. Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).
- Desbois, A. P., Smith, V. J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).
- Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird. Condor. 109 (1), 59-66 (2007).
- Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).
- Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo. European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).
- Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. Sebaceous gland lipids. Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).
- Ro, B. I., Dawson, T. L. The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff. Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).
- Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls. Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).
- Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today's pre-clinical data into tomorrow's daily clinical practice. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).
- Horton, H. R., Moran, L. A., et al. Principles of Biochemistry. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. (1993).
- Fahy, E., Subramaniam, S., et al. A comprehensive classification system for lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).
- Fahy, E., Subramaniam, S., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).
- Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state. Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).
- Savary, B. J., Vasu, P. Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols. Lorence, A. , 3rd, Humana Press. New York, NY. (2011).
- Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).
- Fuchs, B., Schiller, J. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics. European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).
- Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).
- Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
- Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).
- Knochenmuss, R. Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications. Cole, R. B. , 2nd, John Wiley and Sons. NJ. 149-262 (2010).
- Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption - ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI - TOF MS). Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).
- Blehert, D., Hicks, A. C., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen. Science. 323 (5911), 227-228 (2009).
- Gargas, A., Trest, M. T., et al. Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome. Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).
- Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome. Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).
- Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species. Science. 329 (5992), 679-682 (2010).
- Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. The economic importance of bats in agriculture. Science. 332 (6025), 41-42 (2011).
- Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research. Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).
- Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy. Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Nicolaides, N. Skin lipids: Their biochemical uniqueness. Science. 186 (4158), 19-24 (1974).
- Camera, E., Ludovici, M., et al. Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).
- Fuchs, B., Süß, R., et al. Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
