Summary
Däggdjurs integument innehåller lösningsmedels extraherbara lipider som kan ge kemisk kompositioner karakteristisk för enskilda arter. Detta dokument presenterar en rutinmetod för att separera breda klasser lipid som isolerats från Integumentary vävnader med användning av tunnskiktskromatografi och bestämma triacylglyceride profilen genom matrisassisterad laserdesorption / jonisering time-of-flight mass spectrometry.
Abstract
Däggdjurs integument innefattar talgkörtlar som utsöndrar ett oljigt material på hudytan. Talg produktionen är en del av det medfödda immunförsvaret som skyddar mot sjukdomsalstrande mikrober. Onormal talgproduktionen och kemiska sammansättning är också en kliniska symtom på vissa hudsjukdomar. Talg innehåller en komplex blandning av lipider, inklusive triacylglycerider, vilket är artspecifik. De allmänna kemiska egenskaper som uppvisas av olika lipidklasser hindra specifik bestämning av sebum kompositionen. Analysmetoder för lipider kräver normalt kemiska derivatiseringar som är arbetsintensiva och provberednings kostnaderna ökar. Detta dokument beskriver hur du extrahera lipider från däggdjur integument, separata breda lipidklasser genom tunnskiktskromatografi, och profilera de triacylglyceride innehållet med hjälp av matris-assisterad laser desorption / jonisering time-of-flight masspektrometri. Denna robusta metod möjliggör en direkt bestämningav de triacylglyceride profiler bland arter och individer, och det kan lätt tillämpas på alla taxonomisk grupp av däggdjur.
Introduction
Däggdjurs integumentary vävnader omfattar epidermis, keratinösa strukturer (t.ex. hår och naglar) och exokrina körtlar. Sebaceous-typ exokrina körtlar är associerade med hårsäckar, vilka kollektivt hänvisas till som pilosebaceous enheten 1. Talgkörtlar släpper en oljig exsudat på huden yta kallas talg. Talg består till stor del av glycerolipider (t.ex. triacylglycerider [taggar]), gratis feta acyler (FFAs), sterol / vax estrar, och skvalen. Talg kemiska sammansättning är artspecifik 2. Förutom att vara en del av det medfödda immunförsvaret och ger antimikrobiell funktion 3, sebaceous lipider påverka viktiga fysiologiska processer, inklusive evaporativ vattenförlust genom huden 4, cellulär integritet och genreglering 5, och läkemedelsabsorptionen 6. Sebaceous lipidkompositioner kan också fungera som sjukdomsmarkörer. Förändrade förhållanden och mängder av sebaceous bväg lipidklasser är kliniska tecken på sjukdomar som akne vulgaris 7, mjäll 8, seborroiskt eksem 8, asteatosis 9, bland annat 10. Epidermala och hår vävnader ingår variabla profiler som innehåller sterol och derivat, taggar, ffas, ceramider, fosfolipider och andra mindre lipid komponenter. Eftersom Integumentary lipider kan fungera i sjukdomsprocesser, bestämma skillnader i kemiska kompositioner av TAGs mellan friska och sjuka individer kan vara användbart för klinisk diagnos av sjukdom.
Lipider är i allmänhet definieras som vattenolösliga organiska föreningar med antingen icke-polär eller icke-polär-polära substituenter 11. Lipid strukturer kan vara långa kolvätekedjor, oxygenerade alkaner (inklusive vaxestrar, FFAs, alkoholer, ketoner och aldehyder), eller komplexa ringstrukturer såsom kolesterol 12. Det finns åtta stora klasser av lipider som bygger på strukturen (FFAs, glycerolipids [GL], glycerofosfolipider [GP], sfingolipider [SP], sterol lipider [ST], prenol lipider [PR], saccharolipids [SL] och polyketider [PK]), vilka uppvisar ett brett spektrum av kemiska egenskaper beroende på klass 13. På grund av den stora variationen i de kemiska egenskaperna hos lipid klasser, är direkt profilering utan derivatisering av lipidmolekyler önskas. En emergent metod lipidforskning är tunnskiktskromatografi (TLC) i kombination med matrisassisterad laserdesorption / jonisering time-of-flight-masspektrometri (MALDI-TOF MS) 14.
MALDI-TOF-MS används flitigt i proteomic forskning för att identifiera proteiner och associera dem till specifika aminosyrasekvenser på grund av de mycket exakta peptid ion mass "fingeravtryck" som genereras från trypsin-digererade proteiner 15. MALDI-TOF-MS kan också användas för att profilera andra biomolekyler klasser, inklusive lipider såsom Triacylglyceroler 16-18. MALDI kräver användning av en matris, typtiskt en organisk förening som innehåller aromatiska och konjugerat dubbelbindningsstrukturer. Matris molekyler tjänar till att försiktigt överföra energin hos lasern till de analyter, främja protonöverföring, och producera enkelladdade gasfas joner 19-21. Joner kastas ett högspänningsfält under högvakuum och accelereras in i en TOF-massanalysator där jonerna separeras därefter genom skillnader i hastigheter som är proportionella mot deras mass-till-laddningsförhållanden. Även mycket stora biomolekyler kan joniseras med lite fragmentering, som producerar ensamma laddade molekylär jon arter för förenklad spektrumanalys. Förmågan att analysera lipidmolekyler direkt utan derivatisering har främjat redo antagande av MALDI-TOF MS i lipidomic forskning 18.
Denna uppsats presenterar en rutinmetod för att isolera och analysera integumentary lipider från håret, sebaceous sekret och plagiopatagium i östra röda bat (Lasiurus borealis). Detta används för att fastställa interspecifika variationer i bat integumentary lipider för att belysa sjukdomsprocess Vit-näsa syndrom (WNS) 22. WNS är en svampsjukdom på fladdermöss och orsakas av de nyligen beskrivna psykrofila arter Geomyces destructans 23-25. WNS har orsakat döden av över 5 miljoner nordamerikanska grotta fladdermöss och hotar utrotning av känsliga fladdermusarter, med potentiella ekonomiska konsekvenser av miljarder dollar i skador på jordbruket 26,27. För att undersöka stegen i G. destructans infektion, var lipider utvinns ur hår och ving vävnader i östra röda fladdermöss och separeras i breda lipidklasser med TLC att isolera TAG fraktionen för efterföljande analys av MALDI-TOF MS. Taggar innehåller korta acylkedjor och är lätt upptäcks av MALDI-TOF MS med liten matrisstörningar.
Protocol
VARNING: Skaffa i förväg alla nödvändiga statliga och federala tillstånd för hantering, transport och lagring av fladdermöss. Godkännanden ska även erhållas från din Institutional Animal Care och användning kommittén, liksom från institutionella biosäkerhet kommitté. Om levande fladdermöss (eller nervsystem vävnad) ska hanteras, bör vaccineras hanterar djur för rabies. Fladdermöss som används i den aktuella studien samlades in från Ozark St Francis National Forest, AR, under sommaren 2010 enligt standardmetoder (Arkansas State University s institutionella Biosäkerhetskommittén godkännande # 135.349 till 1) 28.
1. Tissue Behandling och Lipid Extraction
- Rengör alla instrument med metanol före och mellan vävnadssamling från olika individer. Trimma håret (ca 1,0 g) från huden med en sax och lägg i en 125 ml-Erlenmeyerkolv. Prov talg från vingytan genom att skrubba huden med 4-6 bomullstussar fuktade med kloroform: Metanol som lösningsmedel (C: M; 03:02 v / v), och placera dessa i en separat kolv.
- Extrahera vävnad med 10 ml av C: M (02:01 vol / vol) innehållande 0,5% butylerad hydroxitoluen (BHT) för att förhindra oxidation 29. Använd endast HPLC-kvalitet lösningsmedel.
- Efter 2 timmar, tillsätt ca 0,5 g vattenfritt sulfat till varje kolv, blanda en kort stund, och samla lösningsmedlet genom filtrering genom filterpapper.
- Upprepa steg 1,2 och 1,3 gånger. En gång med 01:01 C: M och sekventiellt med 01:02 C: M. Pool filtraten tillsammans.
- Indunsta de poolade filtraten under en ström av N2, bestämma torrvikten, och upplösa fett återstoden i 03:02 C: M (med 0,5% BHT) till en koncentration av 10 mg / ml. Butiks provet i glasflaskor vid -20 ° C. Det är i allmänhet bäst att analysera prover inom en månad efter provtagning och minimera frys-tö cykler.
2. Lipid Separation av tunna lager preparativ kromatografi
- Förbered i förväg lösningsmedelstvättad 1,5 ml microcentrifuge rör genom fyllning med 03:02 C: M, sköljdes med aceton och lufttorkning. Detta görs för att avlägsna mjukningsmedel som kan störa senare masspektrometrianalys. Förvara provrören i en dammfri behållare och hantera dessa rör endast med handskar för att förhindra kontaminering från hudfett.
- Aktivera TLC-plattan genom att först pre-utveckla den med 03:02 C: M. Tillsätt tillräckligt med lösningsmedel för TLC-kammare till ett djup av 1 cm, placera sedan plattan i kammaren (nära med glaslock), och lösningsmedlet får köras helt till toppen av plattan. Det tar ca 45 min.
- Avlägsna plattan och torka i ett dragskåp tills lösningsmedlet avdunstar (ca 15 min), placera sedan i ugn i minst 10 minuter vid 120 ° C. Placera en blyertsmarkering på toppen av plattan för att bibehålla orientering när samplen matas. Placera en rak penna linje, 1,5 cm från nedre kanten av plattan, för att markera baslinjen där provet och standarder kommer att placeras.
- Förbered TLC kammare genom att skära ettbit filterpapper tillräckligt stor för att linje två korta väggar och en lång mur. Placera filterpappersinsats in i kammaren. Den kommer helt våt när lösningsmedel tillsätts till kammaren.
- Bered 100 ml av den mobila fasen för lösningsmedlet, vilket är hexan: dietyleter: ättiksyra (H: E: A, 80:20:2 v / v / v). Häll lösningsmedel in i kammaren för att ge ett djup av ca 1 cm. Täck med glaslocket, med användning av ett silikonfett tätning längs den övre kanten av kammaren. Tillåt kammaren ekvilibrera över natten före användning.
- Applicera provet manuellt till den förbehandlade plattan med ett kapillärrör eller en pipett som en kontinuerlig rad från ca 1,5 cm från en kant till 1,5 cm till den andra kanten. En automatiserad provapplikatorn föredras eftersom det kommer att ladda provet i en mer homogen rad. Använd de yttre gränderna i TLC-plattan till platsen cirka 20 pl blandning av sterol, ffas, taggar och sterolester standarder (använd vid 10 mg / ml; premade blandningar kan erhållas).
- Placera den laddade TLC-plattan iden till jämvikt kammare, nära med locket, och utveckla plattan tills lösningsmedlet går till den övre kanten. Detta tar ca 45 min med den mobila fasen som beskrivs här. Avlägsna plattan från kammaren och låta överskottet lösningsmedlet avdunsta från plattan i ett dragskåp under ca 1 min.
- Spraya med 0,05% rodamin 6G i 95% etanol. Visualisera lipid band under lång våglängd ultraviolett lampa. Markera med en penna på Rf läge för de fluorescerande band lösas i provet och standarder. En fotografisk dokumentation kan tas vid denna punkt.
- Identifiera bandet motsvarande med TAG-standarden och ta bort den från plattan genom att skrapa av kiseldioxid med en spatel på en stor bit av pergamyn väger papper. Överför kiseldioxid till en 1,5 ml lösningsmedels tvättades mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 1,0 ml av 03:02 C: M lösningsmedel till provröret, sonikera under 1 min, pelle kiseldioxiden genom centrifugering, och sedan överföra lösningsmedlet in i ett nytt i förväg vägt rör. Upprepa the föregående steg, pool filtraten och indunsta lösningsmedlet under en ström av N2.
- Förvara den torkade återstoden innehållande TAGs under N2 i mörker vid 4 ° C under ytterligare vävnadsprover separeras med TLC. Rhodamine 6G är närvarande i proverna, men det är olösligt i hexan och avlägsnas under provupplösning omedelbart före MS-analys.
3. TAG Analys genom MALDI-TOF MS
- Bered en färsk α-cyano-4-hydroxi-kanelsyra (CHCA) matrislösning genom upplösning av 10 mg CHCA i 1 ml vätska (49,5% etanol, 49,5% acetonitril och 1% vattenhaltig 0,1% TFA).
- Förbered adrenocarticotropic hormon (ACTH; 18-39 klipp, 2465,1989 Da) för instrument upplösning och känslighet testning genom blandning av 1 | il av ACTH (1 mg / ml) med 39,5 | il av 0,1% trifluorättiksyra (TFA) för erhållande av en 10 pmol / ^ il förrådslösning. Detta kan förvaras vid -20 ° C för framtida användning.
- Bered en färsk arbets ACTH solutjon (1 pmol / | il) genom att ta 1 | il av 10 pmol / pl stamlösning, blandning med 9 | il 0,1% TFA, och därefter blandning (1:1) med 10 | il av CHCA matrislösning för erhållande av en 500 fmol / il koncentration.
- Förbered TAG standarder på 10 mg / ml i 03:02 C: M för MALDI instrumentkalibrering (t.ex. trikaprin [470,361 Da], trikaprylin [554,455 Da], trilaurin [638,549 Da], tripalmitin [722,642 Da], tripalmitolein [800,689 Da] , trimyristin [806,736 Da], triolein [884,783 Da], tri-11-eicosenoin [968,877 Da], och trierucin [1052,971 Da]).
- Förbered triolein vid 10 mg / ml i 03:02 C: M för en extern spärrmasskalibrering TAG standard.
- Lös de lagrade TAG prover i hexan till en 10 mg / ml lösning.
- Bered en 0,5 M (77,06 mg/1.0 ml) stamlösning av 2,5-dihydroxibensoesyra (DHB) med 90% metanol för användning som prov-och standardmatrisen. Förbereder också en 1,0 Mkr (2,0 g/50.0 ml) lösning av NaOH. Täck röret med DHB lösning med hjälp av aluminium foi l att skydda mot ljus.
- Blanda (i förtvättade rör) 10,0 l DHB matris, 10,0 pl prov eller standard, och 5,0 l 1,0 M NaOH. Blanda och kort centrifugera röret för att bringa blandningen till botten.
- Spot 1.0 l av standard, prov, eller ACTH på en MALDI rostfritt stål måltavla och plats i en torkapparat tills torr. Placera måltavlan i instrumentet för datainsamling.
- Utför MALDI-TOF MS analyser i positiv reflektron läge. Tune och kalibrera instrumentet enligt beskrivning av instrumentets tillverkare med hjälp av ACTH och TAG standardlösningarna.
- Förvärva spektra för varje prov fläckig på måltavlan (i enlighet med instrumentspecifikationer, parametrar för detta arbete var 5 Hz laser eldhastighet, ~ 100 skott per plats för att få ett genomsnitt spektrum). Efter utjämning och subtrahera bakgrunden från MALDI spektra, process jon toppar manuellt med online-sökmotorn LIPID MAPS (/ Verktyg / ms / glycerolipids_batch "target =" _blank "> www.lipidmaps.org / verktyg / ms / glycerolipids_batch).
- Kopiera och klistra in listan spektra i listan av utgångsjoner och intensitet rutan. Begränsa sökningen till acyl sammansättning önskas. Identifiera Triacylglyceroler av massa / laddning (m / z)-förhållanden från joner närvarande i spektrumet för varje prov. Om fettsyrametylestrar (FAME) procenttal är tillgängliga från separat GC / MS-analys, lägga till dessa data för att erhålla sannolikheter för TAGs närvarande.
INSTRUMENT: Den masspektrometer som används i denna studie är en Waters MALDI Micro MX (utrustad med en 337 nm 20 Hz N 2 laser). Varje tillverkarens MALDI instrument med positivt reflektron läget kapacitet kan användas. Allmänna inställningar som används är pulsspänning, 2,000 V, reflektronen, 5200 V, källa, 15.000 V, med datainsamling med hjälp MassLynx programvara (ver. 4,0). Dessa driftsförhållanden ger massa upplösning högre än 12.000.
Representative Results
Extraktionen förfarande för isolering av total lipider från vävnad som beskrivits av Folch 30 är ett enkelt förfarande, som är anordnad här. Efter vävnad extraktion och lösningsmedel avdunstning, lipider verkar ofta som en gulaktig film. Den gula färgen mest sannolikt är från proteinföroreningar, som kan avlägsnas genom utförande av en vätske-vätske-extraktion. Behövs inte detta extra prov behandling i detta förfarande eftersom preparativ TLC separerar TAG fraktionen från sådana föroreningar. Tillägget av färska vattenfritt natriumsulfat i alla filtreringssteg bidrar till att minska vattenföroreningar som påverkar noggranna lipid viktbestämningar.
Mammalian integumentary lipid analyser med preparativ TLC med H: E: A som den mobila fasen kommer vanligtvis lösa fyra olika band motsvarande (från ursprunget) steroler, ffas, taggar och sterolestrar / vaxestrar / skvalen (Figur 1). Ibland när man använder analytiskacal högpresterande (HP) TLC med H: E: En mobil fas, sterolestrarna, vaxartad estrar, och skvalen kommer att separera och visas som tre separata band. Under de betingelser som användes i denna studie, är sterol / vaxartad estrar inte skiljas. Om dessa band är av intresse, kan kopplas den mobila fasen till isooktan: etyleter (95:5 v / v), och HPTLC plattan kan analyseras genom att skanna densitometri. Andra faktorer kan orsaka dålig separation. Dessa brukar elimineras genom att placera filterpapper i kammaren, ansöker fett för en tät förslutning på locket, jämvikt kammaren över natten, och hålla ren TLC kammare, för att erhålla jämn kvalitet TLC separationer och data.
Representative MALDI-TOF mass-spektra erhölls för Triacylglyceroler isolerade från Mellanöstern röd bat visas i figurerna 2 och 3. Dessa spektra innehåller TAG jon toppar i mass intervallet mellan m / z 850 till 910, vilket är typiskt för TAGs isolerats från icke-vatten-däggdjurer. Tillsatsen av 1,0 M NaOH främjar enkelt laddade Na ^-joner som är mer stabil än H +-joner. Förutom stabilitet, ökar avsaknad av H + och K +-joner enkel spektrumanalys. Den m / z 850-910 jon toppar motsvarar 16:00, 18:00, 18:01 och 18:02 FA-delar som är de dominerande acyl beståndsdelarna i taggar (tabell 1). Möjliga FA-grupper märkena kan initialt bestämmas genom total jon m / z närvarande i MALDI-TOF MS-spektra, och skillnader mellan arter och individer härledas. Men om de specifika förhållandena av acyl innehåll erfordras, då MS / MS eller gaskromatografi (GC / MS) måste användas. Ytterligare information om acyl-förhållanden kan härledas genom att observera toppar i diacylglycerides området av spektrumet (Figur 4). Diacylglycerides produceras av TAG fragmentering i MALDI källan och kan hittas på m / z 590-650 region. TAG fragmentering kan ökas genomutelämnande av tillsats av 1,0 M NaOH 16. Mellanöstern röd slagträ vinge vävnaden kännetecknas av en dominerande topp vid m / z 879,7 och hår vävnad med en dominant topp vid m / z 881,8 (figur 2 och 3 respektive). Toppar vid m / z 907,8, 879,7 och 855,7 (POP, PPOs) är ungefär även i intensitet (~ 50%) i håret vävnad med toppen vid 853,7 vara ~ 40%.
| Komposition | Elemental sammansättning | Observerad massa |
| Na + Etiketter | Na + Etiketter | |
| SSO | C 57 H 108 O 6 | 911,8 |
| OOS, LSS | C 57 H 106 O 6 | 909,8 |
| OOO, LnSS, LSO | C 57 H104 O 6 | 907,8 |
| LOO, LLS | C 57 H 102 O 6 | 905,8 |
| LLO, OOLn | C 57 H 100 O 6 | 903,7 |
| LLL | C 57 H 98 O 6 | 901,7 |
| LLLn | C 57 H 96 O 6 | 899,7 |
| LLnLn | C 57 H 94 O 6 | 897,7 |
| LnLnLn | C 57 H 92 O 6 | 895,7 |
| OSP | C 55 H 104 O 6 | 883,8 |
| LSP, OOP, Sopó | C 55 H 102 O 6 | 881,8 |
| LOP, LnSP, LSPo | C 55 H 100 O 6 </ Td> | 879,7 |
| LLP, LNOP, Lopo | C 55 H 98 O 6 | 877,7 |
| LNLP, LLPo, LnOPo | C 55 H 96 O 6 | 875,7 |
| LnLnP, LnLPo | C 55 H 94 O 6 | 873,7 |
| LnLnPo | C 55 H 92 O 6 | 871,7 |
| PPS | C 53 H 102 O 6 | 857,8 |
| POP, offentliga postoperatörer | C 53 H 100 O 6 | 855,7 |
| OOM, PPL, PoPoS, Popo | C 53 H 98 O 6 | 853,7 |
| PPLN, ppol, PoPoO, myoo | C 53 H 96 O 6 | 851,7 |
| LLM, LnOM | C 53 H 94 6 | 849,7 |
| PPP, SSLa | C 51 H 98 O 6 | 829,7 |
| PPPo, Osla | C 51 H 96 O 6 | 827,7 |
| PPoPo, PMyO | C 51 H 94 O 6 | 825,7 |
| LnLnLa | C 51 H 86 O 6 | 817,6 |
| MMS, smäll, PPM | C 49 H 94 O 6 | 801,7 |
| SLaPo, PPOM, PPMy | C 49 H 92 O 6 | 799,7 |
| PoPoM, OOCa | C 49 H 90 O 6 | 797,7 |
| MMP | C 47 H 90 O 6 | 773,7 |
| MMPo, OCaP | C 47 H 88 O6 | 771,7 |
| OCaPo | C 47 H 86 O 6 | 769,6 |
| MMM, PPCa, PMLA | C 45 H 86 O 6 | 745,6 |
| PoPCa, PoMLa | C 45 H 84 O 6 | 743,6 |
| PoPoCa | C 45 H 82 O 6 | 741,6 |
| LaLaP, MMLa, MCAP | C 43 H 82 O 6 | 717,6 |
| LaLaPo | C 43 H 80 O 6 | 715,6 |
| OO | C 39 H 72 O 5 | 643,5 |
| OL | C 39 H 70 O 5 | 641,5 |
| LL | C 39 H 68 O 5 | 639,5 |
| SP | C 37 H 72 O 5 | 619,5 |
| OP | C 37 H 70 O 5 | 617,5 |
| LP | C 37 H 68 O 5 | 615,5 |
Tabell 1. Fettsyrasammansättning, elementär sammansättning, och isotop massa sodiated addukter av triacylglycerider och diacylglycerides. Ln = linolensyra (18:03), L = linolsyra (18:2), O = oljesyra (18:01), S = stearinsyra (18:00), P = palmitinsyra (16:00), Po = palmitoleinsyra (16:01), M = myristinsyra (14:00), Min = myristoleinsyra (14:01) La: Laurin syra (12:00), Ca = kaprinsyra (10:00).
Figur 1. Tunnskikts kromatogram av bred lipidklass separation genom hexan: dietyleter: ättiksyra(80:20:2 vol / vol / vol) som rörlig fas. Bandet mellan sterol och FFA inte identifierades av en standard, men kan vara en fettalkohol eller vax diester.
Figur 2. Utökad TAG regionen MALDI-TOF mass spektrum av sodiated taggar. (M / z 700 till 950) från östra röd fladdermus (L. borealis) vingvävnaden Peaks identifierats vid m / z 853,7 (OOM, PPL, PoPoS, popo) och m / z 879,7 (LOP, LnSP, LSPo). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Expanderad TAG regionen MALDI-TOF-masspektrum av sodiated taggar (m / z 700 till 950) från Mellanöstern röd fladdermus (L. borealis) hår vävnad.Peaks identifierats vid m / z 905,8 (LOO, LLS) och m / z 907,8 (OOO, LnSS, LSO). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. DAG regionen MALDI-TOF-masspektrum av sodiated DAG-fragment (m / z 530 till 730). Från Mellanöstern röd fladdermus (L. borealis) vingvävnaden Peaks identifierade vid m / z 643,5 (OO) och m / z 615,5 (LP) . Klicka här för att visa en större bild .
Discussion
Denna uppsats presenterar en enkel och robust metod för att separera breda klasser lipid isolerade från däggdjurs integument med preparativ TLC och bestämma TAG profiler genom MALDI-TOF MS, utan tidsödande derivatisering av lipidmolekyler. De kritiska steg i produktion av kvalitets spektra av Triacylglyceroler med MALDI-TOF MS inkluderar: 1) Framgångsrika extrahering av föreningen med minimal nedsmutsning eller oxidation, 2) Tillräcklig separation och isolering genom kromatografi, och 3) Hög upplösning och mass noggrannhet med MALDI-TOF MS.
Detta dokument visar metoden genom att extrahera och separera neutrala lipidfraktion från plagiopatagium i östra röda bat att få TAG MS-profiler. Även om föreliggande studie använde en fladdermus arter (Mammalia: Chiroptera) Dessa metoder kan utökas för att studera Integumentary lipiderna i vilken däggdjursart som helst. Bat integument kännetecknas av att vara övervägande kolesterol, med mindre mängder TAGs, ffas, squaLene och sterol / vaxestrar. Talg lipid i fladdermöss skiljer sig från människor i det skvalen finns i små mängder (i motsats till upp till 16% hos människa), medan kolesterol sker i större förhållanden (1-7% hos människor, men 26-62% av fladdermöss) 22 , 31. Mänskliga hår innehåller ca 3% TAGs, medan förhållanden upp till 28% finns i östra röd fladdermus hår. Utvinningen av lipid prover från fladdermöss är liknande för andra arter. Även i denna studie bomullstussar indränkta i lösningsmedel används för att avlägsna sebum, kan man också invertera en flaska eller provrör innehållande lösningsmedlet på ytan av integument flera gånger. Specialiserade bandprodukter ger också alternativa sätt att utvinna yt lipider 32. En kritisk del av en ordentlig lipidextraktion är att minimera föroreningar från hudfett. Detta ordnar du enkelt genom att hålla en sprutflaska med metanol och spraya alla glas och bestick, torka redskap med en vävnad mellan alla prover och bär undersökningshandskar. Oxidation of fleromättade acyler förhindras genom tillsats av BHT, och det bör användas oavsett temperatur prover förvaras vid.
Biomolecule analys kräver vanligtvis ett kromatografiskt steg för att separera molekyler av intresse från föroreningar. TLC användes i denna metod, vilket undviker instrumenterings krav för gas-eller vätskekromatografi och kräver mindre teknisk erfarenhet för att uppnå stabila och repeterbara resultat. Beroende på lipid klassen av intresse, kan många olika mobila faser införlivas. Vidare kan användning av HPTLC-plattor och scanning densitometri användas för att åstadkomma kvantitativa resultat. Även om variationerna av TLC-metoder är för många för att räkna upp här, några vanliga mobila faser som användes i lipid TLC inkluderar kloroform: metanol: vatten för separation av fosfolipider och glykolipider eller isooktan: etyleter för separation av icke-polära lipider 28. När det gäller att separera taggar från andra lipid klasser, H: E: A sålvent systemet fungerar konsekvent och ger jämförbara resultat.
En annan fördel för att använda TLC är att band av intresse kan snabbt profileras med hjälp av MALDI-TOF MS utan derivatisering av analyterna. I denna studie kiseldioxiden avlägsnas från TLC-plattan, och analyten elueras från det genom ultraljudsbehandling i ett lösningsmedel och efterföljande centrifugering för att separera adsorbenten och indunstning av elueringsmedlet. Alternativt kan matrisen appliceras direkt på analyt band separerades på TLC-plattor och analyserades sedan direkt med MALDI-TOF-MS-33. Framgångsrik profilering av MALDI-TOF MS förlitar sig på tillräcklig provberedning och operatörens skicklighet med avstämning och kalibrering av instrumentet. Instrumentet bör kalibreras dagligen med standarder för viktområde lämpliga molekyl för molekyler av intresse. Den lämplig känslighet och upplösning (t.ex. ≥ 10000) av produkter bör också confirmed dagligen med ACTH.
Sebaceous lipidbeståndsdelarna som finns på ytan av däggdjurs integument kan spela en roll i koloniseringen av bakterier / svamp patogener. Därför är kunskap om den kemiska sammansättningen mellan arter och individer kan ge ledtrådar om processer av människor och djur sjukdomar. Intraspecifika skillnader mellan sjuka och friska individer kan representera kliniska tecken som stöd i upptäckt och diagnos sjukdom. Dessutom, om specifika föreningar som hämmar mikrobiell tillväxt är närvarande, dessa kan identifieras för användning vid behandling och förebyggande av sjukdomar.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Stöd gavs av Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell, Tony Lamark James, Amy Fischer, Hannah Blair, och Cheyenne Gerdes under utvecklingen av laboratoriemetoder. Vi vill tacka Medina-Bolivar Laboratory (Luis H. Nopo-Olazabal, Arkansas Biosciences Institute) för hjälp med TLC-scanning densitometri. MALDI-TOF MS används för detta projekt lämnades genom NSF EPSCoR, RII: Arkansas ASSET Initiative P3 Center (EPS-0.701.890) i Arkansas Biosciences Institute. Finansieringen kom från en amerikansk fiske och Wildlife Service / Arkansas State Wildlife Grant, National speleologiska Society, och Centrum för nordamerikanska Bat forskning och bevarande vid Indiana State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals, LLC | 101162 | www.mpbio.com |
| TLC Flexible Plates | Whatman | 4410-222 | www.whatman.com |
| ACTH | Sigma-Aldrich Chem. Co. | A8346-5X1VL | www.sigmaaldrich.com |
| Triolein | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 44895-U | |
| TLC Lipid Standard | TLC 18-1 | www.nu-chekprep.com | |
| MALDI TAG Standard | Nu-Check Prep., Inc. | NIH Code 53B | |
| MALDI TAG Standard | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 17810-1AMP-S | |
| Glass Vials with Teflon Cap | U.S. National Scientific Co. | B7800-2 | www.nationalscientific.com/ |
| DHB | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 50862-1G-F | |
| CHCA | Sigma-Aldrich Chem. Co. | C8982-10X10 mg | |
| Sebutape | CuDerm | S100 |
References
- Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland. Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).
- Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals. Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).
- Desbois, A. P., Smith, V. J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).
- Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird. Condor. 109 (1), 59-66 (2007).
- Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).
- Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo. European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).
- Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. Sebaceous gland lipids. Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).
- Ro, B. I., Dawson, T. L. The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff. Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).
- Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls. Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).
- Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today's pre-clinical data into tomorrow's daily clinical practice. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).
- Horton, H. R., Moran, L. A., et al. Principles of Biochemistry. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. (1993).
- Fahy, E., Subramaniam, S., et al. A comprehensive classification system for lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).
- Fahy, E., Subramaniam, S., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).
- Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state. Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).
- Savary, B. J., Vasu, P. Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols. Lorence, A. , 3rd, Humana Press. New York, NY. (2011).
- Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).
- Fuchs, B., Schiller, J. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics. European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).
- Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).
- Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
- Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).
- Knochenmuss, R. Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications. Cole, R. B. , 2nd, John Wiley and Sons. NJ. 149-262 (2010).
- Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption - ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI - TOF MS). Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).
- Blehert, D., Hicks, A. C., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen. Science. 323 (5911), 227-228 (2009).
- Gargas, A., Trest, M. T., et al. Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome. Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).
- Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome. Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).
- Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species. Science. 329 (5992), 679-682 (2010).
- Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. The economic importance of bats in agriculture. Science. 332 (6025), 41-42 (2011).
- Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research. Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).
- Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy. Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Nicolaides, N. Skin lipids: Their biochemical uniqueness. Science. 186 (4158), 19-24 (1974).
- Camera, E., Ludovici, M., et al. Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).
- Fuchs, B., Süß, R., et al. Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
