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Chemistry

प्रारंभिक पतली परत क्रोमैटोग्राफी और MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा चमगादड़ कोल लिपिड में Triacylglyceride सामग्री रूपरेखा

Published: September 5, 2013 doi: 10.3791/50757
Automatic Translation
1, 2, 3
1Graduate Program of Environmental Science, Arkansas State University, 2Department of Biological Sciences, Arkansas State University, 3Arkansas Biosciences Institute and College of Agriculture and Technology, Arkansas State University

Summary

स्तनधारी आवरण व्यक्ति प्रजातियों के रासायनिक रचनाओं विशेषता प्रदान कर सकते हैं कि विलायक निष्कर्षण लिपिड होता है. इस कागज पतली परत क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कोल ऊतकों से अलग व्यापक लिपिड वर्गों को अलग करने और मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा triacylglyceride प्रोफाइल का निर्धारण करने के लिए एक नियमित विधि प्रस्तुत करता है.

Abstract

स्तनधारी आवरण त्वचा की सतह पर एक तेल सामग्री छिपाना कि वसामय ग्रंथियों शामिल है. Sebum उत्पादन रोगजनक रोगाणुओं के खिलाफ रक्षात्मक है कि सहज प्रतिरक्षा प्रणाली का हिस्सा है. असामान्य sebum उत्पादन और रासायनिक संरचना भी विशिष्ट त्वचा रोगों की एक नैदानिक ​​लक्षण हैं. Sebum प्रजाति विशेष है जो triacylglycerides, सहित लिपिड का एक जटिल मिश्रण होता है. विविध लिपिड वर्गों द्वारा प्रदर्शित व्यापक रासायनिक गुणों sebum रचना की विशिष्ट दृढ़ संकल्प बाधा. लिपिड के लिए विश्लेषणात्मक तकनीकों को आम तौर पर श्रम प्रधान और वृद्धि नमूना तैयार खर्च कर रहे हैं कि रासायनिक derivatizations की आवश्यकता होती है. इस कागज पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा स्तनधारी आवरण, अलग व्यापक लिपिड वर्गों से लिपिड निकालने, और मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग triacylglyceride सामग्री रूपरेखा कैसे करें. इस मजबूत विधि एक प्रत्यक्ष निर्धारण में सक्षम बनाता हैप्रजातियों और व्यक्तियों के बीच triacylglyceride प्रोफाइल के, और यह आसानी से स्तनधारियों के किसी भी वर्गीकरण समूह के लिए लागू किया जा सकता है.

Introduction

स्तनधारी कोल ऊतकों एपिडर्मिस, keratinous संरचनाओं (जैसे बालों और नाखूनों), और बहि: स्त्रावी शामिल हैं. वसामय प्रकार बहि: स्त्रावी सामूहिक pilosebaceous इकाई 1 के रूप में भेजा जाता है, जो बालों के रोम, के साथ जुड़े रहे हैं. वसामय ग्रंथियों sebum के रूप में भेजा त्वचा की सतह पर एक तेल पीब जारी. Sebum glycerolipids (जैसे triacylglycerides [टैग]), मुक्त फैटी acyls (FFAs), स्टेरोल / मोम एस्टर, और Squalene के बड़े पैमाने पर बना है. Sebum की रासायनिक संरचना प्रजाति विशेष के 2 है. सहज प्रतिरक्षा प्रणाली का हिस्सा होने और रोगाणुरोधी समारोह 3 प्रदान करने के अलावा, चिकना लिपिड त्वचा के माध्यम से 4 बाष्पीकरणीय पानी की कमी, सेलुलर अखंडता और जीन विनियमन 5, और नशीली दवाओं के अवशोषण 6 सहित महत्वपूर्ण शारीरिक प्रक्रियाओं को प्रभावित. वसामय लिपिड रचनाओं भी रोग मार्कर के रूप में सेवा कर सकते हैं. बदल अनुपात और चिकना बी की मात्रासड़क लिपिड कक्षाओं में इस तरह के अन्य लोगों से 10 के बीच में मुँहासे 7, रूसी 8, seborrheic जिल्द की सूजन 8, asteatosis 9, जैसे रोगों के नैदानिक ​​संकेत मिल रहे हैं. एपिडर्मल और बाल ऊतकों स्टेरोल और डेरिवेटिव, टैग, FFAs, ceramides, phospholipids, और अन्य छोटे लिपिड घटकों से युक्त चर के प्रोफाइल में शामिल हैं. कोल लिपिड, रोग प्रक्रियाओं में कार्य कर सकते हैं क्योंकि स्वस्थ और रोगग्रस्त व्यक्तियों के बीच टैग की रासायनिक रचनाओं में अंतर को निर्धारित करने की बीमारी के नैदानिक ​​निदान के लिए उपयोगी हो सकता है.

लिपिड आम तौर पर nonpolar या या तो nonpolar ध्रुवीय substituents 11 के साथ पानी में अघुलनशील कार्बनिक यौगिकों होने के रूप में परिभाषित कर रहे हैं. लिपिड संरचनाओं लंबे हाइड्रोकार्बन चेन, (मोम एस्टर, FFAs, एल्कोहल, ketones, और aldehydes सहित) ऑक्सीजन alkanes, या ऐसे कोलेस्ट्रॉल के रूप में 12 जटिल अंगूठी संरचनाओं हो सकता है. संरचना के आधार पर लिपिड के आठ प्रमुख वर्गों (FFAs, glycerolipi कर रहे हैंडी एस [gl], glycerophospholipids के आधार पर रासायनिक गुणों की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदर्शन जो [जीपी], sphingolipids [सपा], स्टेरोल लिपिड [एसटी], prenol लिपिड [पीआर], saccharolipids [SL], और polyketides [पी]), कक्षा 13. कारण लिपिड वर्गों के रासायनिक गुणों में व्यापक बदलाव के लिए, लिपिड अणु की पूर्व derivatization बिना प्रत्यक्ष रूपरेखा वांछित है. लिपिड अनुसंधान के क्षेत्र में एक आकस्मिक विधि मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption / आयनीकरण समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-TOF एमएस) 14 के साथ संयुक्त पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) है.

MALDI-TOF एमएस प्रोटीन की पहचान और कारण trypsin पचा प्रोटीन 15 से उत्पन्न बेहद सटीक पेप्टाइड आयन जन "उंगलियों के निशान" के लिए विशिष्ट एमिनो एसिड दृश्यों के लिए उन्हें सहयोगी प्रोटिओमिक अनुसंधान में बड़े पैमाने पर प्रयोग किया जाता है. MALDI-TOF एमएस भी इस तरह के टैग 16-18 के रूप में लिपिड सहित अन्य बायोमोलिक्यूल वर्गों, प्रोफाइल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. MALDI एक मैट्रिक्स, typ का उपयोग आवश्यक हैखुशबूदार और संयुग्मित डबल बांड संरचनाओं में शामिल है कि एक कार्बनिक यौगिक ically. मैट्रिक्स अणुओं धीरे, analytes के लिए लेजर की ऊर्जा हस्तांतरण प्रोटॉन हस्तांतरण को बढ़ावा देने, और अकेले आरोप लगाया गैस चरण आयनों 19-21 निर्माण करने के लिए काम करते हैं. आयनों उच्च वैक्यूम के तहत एक उच्च वोल्टेज क्षेत्र के अधीन और आयनों बाद में उनके बड़े पैमाने पर करने के लिए प्रभारी अनुपात के लिए आनुपातिक हैं कि वेग में मतभेद से अलग हो रहे हैं, जहां एक TOF जन विश्लेषक में त्वरित हैं. यहां तक ​​कि बहुत बड़ी biomolecules सरलीकृत स्पेक्ट्रम विश्लेषण के लिए अकेले आरोप लगाया आणविक आयन प्रजातियों के उत्पादन, थोड़ा विखंडन के साथ आयनित किया जा सकता है. पूर्व derivatization बिना सीधे लिपिड अणु का विश्लेषण करने की क्षमता lipidomic अनुसंधान 18 में MALDI-TOF एमएस के लिए तैयार गोद लेने को बढ़ावा दिया है.

इस पत्र बालों से कोल का लिपिड अलग करने और विश्लेषण करने के लिए एक नियमित विधि प्रस्तुत करता है, वसामय स्राव और पूर्वी लाल बल्लेबाजी की plagiopatagium (Lasiurus borealis). इस सफेद नाक सिंड्रोम (डब्ल्यूएनएस) 22 के रोग की प्रक्रिया को स्पष्ट करने के बल्ले कोल का लिपिड में एक जैसा विविधताओं निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. डब्ल्यूएनएस चमगादड़ की एक कवक रोग है और Geomyces 23-25 ​​destructans नव वर्णित psychrophilic प्रजातियों के कारण होता है. डब्ल्यूएनएस 5 लाख से अधिक उत्तर अमेरिकी गुफा चमगादड़ की मौत का कारण बना और कृषि उद्योग 26,27 को नुकसान में अरबों डॉलर के संभावित आर्थिक प्रभावों के साथ कमजोर बल्लेबाजी प्रजातियों के विलुप्त होने का खतरा हो गया है. जी में कदम जांच करने के लिए संक्रमण destructans, लिपिड पूर्वी लाल चमगादड़ के बाल और पंख ऊतकों से निकाले गए थे और MALDI-TOF एमएस द्वारा बाद के विश्लेषण के लिए टैग अंश को अलग करने के लिए टीएलसी द्वारा व्यापक लिपिड वर्गों में विभाजित किया. टैग कम एसाइल होते श्रृंखला और आसानी से थोड़ा मैट्रिक्स हस्तक्षेप साथ MALDI-TOF एमएस द्वारा पता चला रहे हैं.

Protocol

चेतावनी: अग्रिम में, हैंडलिंग, परिवहन, और चमगादड़ भंडारण के लिए सभी आवश्यक राज्य और संघीय परमिट प्राप्त. स्वीकृति अपने संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति, साथ ही अपने संस्थागत जैव सुरक्षा समिति से से भी प्राप्त किया जाना चाहिए. लाइव बल्ले (या तंत्रिका तंत्र के ऊतकों) संभाला जा रहे हैं, जानवर के संचालकों रेबीज के लिए टीका लगाया जाना चाहिए. वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल चमगादड़ मानक तरीकों (अर्कांसस राज्य विश्वविद्यालय के संस्थागत जैव सुरक्षा समिति की मंजूरी # 135349-1) 28 के अनुसार 2010 की गर्मियों के दौरान Ozark सेंट फ्रांसिस राष्ट्रीय वन, ए.आर., से एकत्र किए गए थे.

1. ऊतक उपचार और लिपिड निकालना

  1. पहले और विभिन्न व्यक्तियों से ऊतक संग्रह के बीच मेथनॉल के साथ सभी उपकरणों को साफ करें. एक 125 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में एक कैंची और जगह के साथ त्वचा से बाल (लगभग 1.0 ग्राम) ट्रिम. क्लोरोफॉर्म के साथ गीला 6 कपास गेंदों - 4 के साथ त्वचा scrubbing द्वारा विंग सतह से नमूना sebum: मेथनॉल विलायक (सी: एम, 03:02 वी / वी), और एक अलग कुप्पी में इन जगह है.
  2. सी के 10 एमएल के साथ ऊतक निकालें: एम (2:1 वी / वी) ऑक्सीकरण 29 को रोकने के लिए 0.5% butylated hydroxytoluene (BHT) युक्त. केवल HPLC गुणवत्ता विलायकों का उपयोग करें.
  3. 2 घंटा के बाद, प्रत्येक कुप्पी के बारे में 0.5 ग्राम निर्जल सल्फेट जोड़ने संक्षेप मिश्रण, और फिल्टर पेपर के माध्यम से छान कर विलायक इकट्ठा.
  4. दोहराएँ दो बार 1.2 और 1.3 कदम. एम.: एक बार के साथ 1:1 सी: 01:02 सी के साथ एम और क्रमिक रूप से पूल एक साथ filtrates.
  5. 2 एन की एक धारा के तहत जमा filtrates लुप्त हो जाना, सूखी वजन का निर्धारण, और 3:2 सी में लिपिड अवशेषों भंग: 10 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता मीटर (0.5% BHT के साथ). -20 डिग्री सेल्सियस पर कांच की शीशियों में स्टोर नमूना यह नमूना संग्रह के बाद एक महीने के भीतर नमूनों का विश्लेषण करने के लिए और फ्रीज पिघलना चक्र को कम करने के लिए आमतौर पर सबसे अच्छा है.

2. प्रारंभिक पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा लिपिड पृथक्करण

  1. अग्रिम विलायक धोया 1.5 मिलीलीटर microce में तैयार करें, एम एसीटोन के साथ rinsing, और हवा सुखाने: 03:02 सी के साथ भरने के द्वारा ntrifuge ट्यूबों. यह बाद में मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि plasticizers दूर करने के लिए किया जाता है. एक धूल से मुक्त कंटेनर में नमूना ट्यूब की दुकान है और त्वचा के तेल से प्रदूषण को रोकने के लिए केवल दस्ताने के साथ इन ट्यूबों को संभाल.
  2. एम.: पहली 03:02 सी के साथ यह पूर्व के विकास के द्वारा टीएलसी थाली सक्रिय , 1 सेमी की गहराई तक टीएलसी चैम्बर के लिए पर्याप्त विलायक जोड़ें तो (करीब ग्लास ढक्कन के साथ) के चैम्बर में थाली प्लेस और विलायक प्लेट के ऊपर से पूरी तरह से चलाने के लिए अनुमति देते हैं. इस बारे में 45 मिनट लगते हैं.
  3. विलायक उड (लगभग 15 मिनट) तक एक धूआं हुड में थाली और सूखी निकालें, तो 120 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 10 मिनट के लिए एक ओवन में जगह नमूने लागू कर रहे हैं जब ओरिएंटेशन को बनाए रखने के लिए थाली के शीर्ष पर एक पेंसिल मार्क रखें. नमूना और मानकों रखा जाएगा जहां आधारभूत चिह्नित करने के लिए, 1.5 सेमी प्लेट के नीचे किनारे से, एक सीधे पेंसिल लाइन जगह.
  4. एक काटने से टीएलसी कक्ष तैयारदो छोटी दीवारों लाइन काफी बड़े और एक लंबी दीवार फिल्टर पेपर का टुकड़ा. चेंबर में फिल्टर पेपर लाइनर रखें. यह विलायक चैम्बर के लिए पूरी तरह से गीला जोड़ा जाता होगा.
  5. Diethyl ईथर: एसिटिक एसिड हेक्सेन है जो विलायक मोबाइल चरण की 100 मिलीलीटर की तैयारी (एच: ई: एक, 80:20:2 वी / वी / वी). के बारे में 1 सेमी की गहराई देने के लिए चेंबर में विलायक डालो. चैंबर के शीर्ष बढ़त के साथ एक सिलिकॉन तेल सील का उपयोग कर, ग्लास ढक्कन के साथ कवर. कक्ष का उपयोग करने से पहले रात भर संतुलित करने की अनुमति दें.
  6. अन्य बढ़त को 1.5 सेमी करने के लिए एक किनारे से के बारे में 1.5 सेमी से एक सतत लकीर के रूप में एक केशिका ट्यूब या विंदुक के साथ तैयार की थाली के लिए मैन्युअल नमूना लागू करें. यह एक अधिक समरूप लकीर में नमूना लोड होगा क्योंकि एक स्वचालित नमूना applicator पसंद किया जाता है. लगभग 20 μl स्टेरोल का मिश्रण, FFAs, टैग, और स्टेरोल एस्टर मानकों हाजिर करने के लिए टीएलसी थाली के बाहरी गलियों का उपयोग करें (10 मिलीग्राम पर उपयोग / एमएल, premade मिश्रण प्राप्त किया जा सकता है).
  7. में लोड टीएलसी थाली प्लेसequilibrated ढक्कन के साथ करीब चैम्बर,, और प्लेट का विकास विलायक जब तक ऊपरी किनारे तक चलता है. यह यहाँ वर्णित मोबाइल चरण के साथ के बारे में 45 मिनट लगते हैं. चैम्बर से थाली निकालें और अतिरिक्त विलायक के बारे में 1 मिनट के लिए एक धूआं हुड में थाली से लुप्त हो जाना करने की अनुमति.
  8. 95% इथेनॉल में 0.05% rhodamine 6G के साथ स्प्रे. एक लंबे तरंगदैर्ध्य पराबैंगनी दीपक के नीचे लिपिड बैंड कल्पना. एक पेंसिल के साथ मार्क नमूना और मानकों में हल फ्लोरोसेंट बैंड के लिए आर एफ स्थिति. एक फोटो रिकॉर्ड इस बिंदु पर ले जाया जा सकता है.
  9. टैग मानक के साथ संगत बैंड को पहचानें और glassine कागज का वजन का एक बड़ा टुकड़ा पर एक रंग के साथ सिलिका बंद scraping द्वारा थाली से हटा दें. एक 1.5 मिलीलीटर विलायक धोया microcentrifuge ट्यूब सिलिका स्थानांतरण.
  10. 03:02 सी के 1.0 मिलीलीटर जोड़ें: एम विलायक नमूना ट्यूब, 1 मिनट के लिए sonicate, centrifugation द्वारा सिलिका गोली, और फिर एक नया पूर्व तौला ट्यूब में विलायक हस्तांतरण. दोहराएँ वेंई पिछले चरण, filtrates पूल, और 2 एन की एक धारा के तहत विलायक लुप्त हो जाना.
  11. अतिरिक्त ऊतक के नमूने टीएलसी से अलग हो रहे हैं, जबकि 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 2 एन पहले टैग युक्त सूखे अवशेषों स्टोर. Rhodamine 6G के नमूने में मौजूद है, लेकिन यह हेक्सेन में अघुलनशील है और तुरंत एमएस विश्लेषण से पहले नमूना विघटन के दौरान हटा दिया जाता है.

3. MALDI-TOF एमएस द्वारा टैग विश्लेषण

  1. विलायक 1 मिलीलीटर (49.5% इथेनॉल, 49.5% acetonitrile, और 1% जलीय 0.1% TFA) में 10 मिलीग्राम CHCA भंग करके एक ताजा α-cyano-4-हाइड्रोक्सी cinnamic एसिड (CHCA) मैट्रिक्स समाधान तैयार करें.
  2. एक 10 pmol / μl प्राप्त करने के लिए 0.1% trifluoroacetic एसिड (TFA) के 39.5 μl के साथ ACTH (1 मिलीग्राम / एमएल) की 1 μl मिश्रण से साधन संकल्प और संवेदनशीलता के परीक्षण के लिए; adrenocarticotropic हार्मोन (18-39 क्लिप, 2465.1989 दा ACTH) तैयार करें शेयर समाधान. यह भविष्य में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  3. एक ताजा काम कर एसीटीएच solut की तैयारी, 10 pmol / μl शेयर समाधान के 1 μl लेने 9 μl 0.1% TFA के साथ मिश्रण है, और फिर एक 500 fmol प्राप्त करने के लिए CHCA मैट्रिक्स समाधान के 10 μl के साथ (1:1) के मिश्रण से आयन (1 pmol / μl) / μl एकाग्रता.
  4. 03:02 सी में 10 मिलीग्राम / एमएल में टैग मानकों तैयार: MALDI साधन अंशांकन के लिए एम (जैसे tricaprin [470.361 दा], tricaprylin [554.455 दा], [638.549 दा] trilaurin [722.642 दा] tripalmitin, [800.689 दा] tripalmitolein ,, [806.736 दा] trimyristin [884.783 दा], त्रि-11-eicosenoin [968.877 दा] triolein, और trierucin [1052.971 दा]).
  5. एक बाहरी ताला जन अंशांकन टैग मानक के लिए एम: 3:02 सी में 10 मिलीग्राम / एमएल पर triolein तैयार करें.
  6. एक 10 मिलीग्राम / एमएल समाधान करने के लिए हेक्सेन में संग्रहीत टैग नमूने भंग.
  7. एक 0.5 एम (77.06 mg/1.0 मिलीलीटर) नमूना और मानक मैट्रिक्स के रूप में इस्तेमाल के लिए 90% मेथनॉल के साथ 2,5-dihydroxybenzoic एसिड (DHB) के शेयर समाधान तैयार करें. इसके अलावा NaOH के एक 1.0 एम (2.0 g/50.0 एमएल) समाधान तैयार करें. एल्यूमीनियम फोई का उपयोग DHB समाधान के साथ ट्यूब आवरण प्रकाश से बचाने के लिए एल.
  8. मिक्स (पूर्व धोया ट्यूबों में) 10.0 μl DHB मैट्रिक्स, 10.0 μl नमूना या मानक, और 5.0 μl 1.0 एम NaOH. मिक्स और संक्षेप में नीचे करने के लिए मिश्रण लाने के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र.
  9. स्पॉट सूखा जब तक एक desiccator में एक MALDI स्टेनलेस स्टील लक्ष्य प्लेट और जगह पर मानक, नमूना, या ACTH के 1.0 μl. डाटा अधिग्रहण के लिए साधन में लक्ष्य प्लेट रखें.
  10. प्रदर्शन करना MALDI-TOF एमएस सकारात्मक reflectron मोड में विश्लेषण करती है. धुन और ACTH और टैग मानक समाधान का उपयोग कर साधन के निर्माता के रूप में वर्णित साधन जांचना.
  11. लक्ष्य प्लेट पर देखा प्रत्येक नमूने के लिए स्पेक्ट्रा मोल (यंत्र विनिर्देशों के साथ संगत है, इस काम के लिए मानकों 5 हर्ट्ज लेजर फायरिंग दर औसतन स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए हाजिर प्रति ~ 100 शॉट्स थे). MALDI स्पेक्ट्रा से पृष्ठभूमि चौरसाई और घटाने के बाद ऑनलाइन खोज इंजन लिपिड एमएपीएस (साथ मैन्युअल प्रक्रिया आयन चोटियों/ उपकरण / एमएस / glycerolipids_batch "लक्ष्य =" _blank "> www.lipidmaps.org / उपकरण / एमएस / glycerolipids_batch).
  12. अग्रदूत आयनों और तीव्रता बॉक्स की सूची में सूची स्पेक्ट्रा कॉपी और पेस्ट करें. वांछित एसाइल रचना के लिए खोज को सीमित. जन / प्रभारी प्रत्येक नमूने के लिए स्पेक्ट्रम में मौजूद आयनों से (मी / z) अनुपात द्वारा टैग को पहचानें. फैटी एसिड मिथाइल एस्टर (प्रसिद्धि) प्रतिशत अलग जीसी / एमएस विश्लेषण से उपलब्ध हैं, तो वर्तमान टैग की संभावनाओं को प्राप्त करने के लिए इन आंकड़ों का जोड़.

साधन: इस अध्ययन में इस्तेमाल मास स्पेक्ट्रोमीटर (एक 337 एनएम 20 हर्ट्ज एन 2 लेजर के साथ सुसज्जित) एक वाटर्स MALDI माइक्रो एमएक्स है. सकारात्मक reflectron मोड क्षमता के साथ किसी भी निर्माता की MALDI साधन इस्तेमाल किया जा सकता है. Reflectron, 5200 वि; इस्तेमाल किया सामान्य सेटिंग्स पल्स वोल्टेज, 2,000 वि हैं स्रोत, 15000 वी, MassLynx सॉफ्टवेयर (ver. 4.0) का उपयोग कर डेटा अधिग्रहण के साथ. इन ऑपरेटिंग शर्तों के 12,000 से अधिक सामूहिक संकल्प प्रदान करते हैं.

Representative Results

FOLCH 30 से वर्णित ऊतक से कुल लिपिड के लिए अलग निष्कर्षण विधि यहाँ अनुकूलित है जो एक सरल प्रक्रिया है. ऊतक निष्कर्षण और विलायक वाष्पीकरण के बाद, लिपिड अक्सर एक पीले फिल्म के रूप में दिखाई देते हैं. पीले रंग सबसे अधिक संभावना एक तरल तरल निष्कर्षण प्रदर्शन से हटाया जा सकता है जो प्रोटीन contaminants, से है. प्रारंभिक टीएलसी ऐसे contaminants से टैग अंश को अलग करती है क्योंकि यह अतिरिक्त नमूना प्रसंस्करण इस प्रक्रिया में की जरूरत नहीं है. सभी फ़िल्टरिंग चरणों में ताजा निर्जल सोडियम सल्फेट के अलावा सही लिपिड वजन निर्धारण को प्रभावित करता है कि पानी के प्रदूषण को कम करने में मदद करता है.

स्तनधारी कोल का लिपिड एच के साथ प्रारंभिक टीएलसी द्वारा विश्लेषण करती है: ई: मोबाइल चरण के रूप में एक आम तौर पर sterols, FFAs, टैग, और स्टेरोल एस्टर / मोम एस्टर / Squalene (चित्रा 1) (मूल से शुरू) के लिए इसी चार अलग बैंड का समाधान होगा. इस अवसर पर analyti का उपयोग करते समयई: एच के साथ सीएएल उच्च प्रदर्शन (एचपी) टीएलसी एक मोबाइल चरण, स्टेरोल एस्टर, मोमी एस्टर, और Squalene अलग और तीन अलग बैंड के रूप में दिखाई देगा. वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल शर्तों के तहत, स्टेरोल / मोमी एस्टर अलग नहीं हैं. एथिल ईथर (95:5 वी / वी), और HPTLC थाली densitometry स्कैनिंग से विश्लेषण किया जा सकता है: इन बैंड रुचि के हैं, तो मोबाइल चरण isooctane के लिए बंद किया जा सकता है. अन्य कारकों गरीब जुदाई का कारण बन सकता है. ये आम तौर पर लगातार गुणवत्ता टीएलसी विभाजन और डेटा प्राप्त करने के लिए, कक्ष में फिल्टर पेपर रखकर ढक्कन पर एक तंग सील के लिए तेल लागू करने, रात भर कक्ष equilibrating, और स्वच्छ टीएलसी कक्षों रखने के द्वारा समाप्त हो जाते हैं.

पूर्वी लाल बल्ले से अलग टैग के लिए प्राप्त प्रतिनिधि MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रा आंकड़े 2 और 3 में दिखाया गया. गैर जलीय स्तनपायी से अलग टैग के लिए खास है जो 910, - ये स्पेक्ट्रा मी / z 850 के बीच बड़े पैमाने पर रेंज में टैग आयन चोटियों होतेएस. 1.0 एम NaOH के अलावा अकेले एच + आयनों की तुलना में अधिक स्थिर हैं कि ना + आयनों का आरोप बढ़ावा देता है. स्थिरता के अलावा, एच + और ​​कश्मीर + आयनों के अभाव स्पेक्ट्रम विश्लेषण में आसानी बढ़ जाती है. मी / z 850-910 आयन चोटियों 16:00, 18:00, 18:01 के अनुरूप है, और 18:02 एफए moieties टैग में प्रमुख एसाइल घटक (टेबल 1) किया जा रहा है. टैग की संभावित एफए moieties शुरू में कुल आयन मी / z MALDI-TOF एमएस स्पेक्ट्रा में मौजूद है, और deduced प्रजातियों और व्यक्तियों के बीच मतभेद के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. एसाइल सामग्री के विशिष्ट अनुपात आवश्यक हैं हालांकि, अगर, तो एमएस / एमएस या गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी / एमएस) का उपयोग किया जाना चाहिए. एसाइल अनुपात पर अधिक जानकारी स्पेक्ट्रम की diacylglycerides क्षेत्र (चित्रा 4) में चोटियों को देख कर deduced किया जा सकता है. Diacylglycerides MALDI स्रोत में टैग विखंडन से उत्पन्न होते हैं और एम / Z 590 में पाया जा सकता है - 650 क्षेत्र. टैग विखंडन से बढ़ाया जा सकता है1.0 एम NaOH 16 के अलावा छोड़ते हुए. पूर्वी लाल बल्ला पंख ऊतक मी / z 881.8 (क्रमशः चित्रा 2 और 3) में एक प्रमुख शिखर के साथ एम / Z 879.7 और बाल ऊतक में एक प्रमुख शिखर की विशेषता है. मी / z 907.8, 879.7, और 855.7 (पीओपी, पीपीओ) पर चोटियों 853.7 जा रहा है ~ 40% पर चोटी के साथ बाल ऊतक में (~ 50%) तीव्रता में भी लगभग हैं.

रचना मौलिक रचना मनाया मास
ना + टैग ना + टैग
एसएसओ सी 57 एच 108 हे 6 911.8
OOS, LSS सी 57 एच 106 हे 6 909.8
Ooo, LnSS, LSO सी 57 एच104 हे 6 907.8
लू, LLS सी 57 एच 102 हे 6 905.8
ल्लो, OOLn सी 57 एच 100 हे 6 903.7
एल एल एल सी 57 एच 98 हे 6 901.7
LLLn सी 57 एच 96 हे 6 899.7
LLnLn सी 57 एच 94 हे 6 897.7
LnLnLn सी 57 एच 92 हे 6 895.7
ओएसपी सी 55 एच 104 हे 6 883.8
एलएसपी, OOP, Sopo सी 55 एच 102 हे 6 881.8
कलम, LnSP, LSPo सी 55 एच 100 हे 6 </ P> 879.7
एलएलपी, LnOP, Lopo सी 55 एच 98 हे 6 877.7
LnLP, LLPo, LnOPo सी 55 एच 96 हे 6 875.7
LnLnP, LnLPo सी 55 एच 94 हे 6 873.7
LnLnPo सी 55 एच 92 हे 6 871.7
पीपीएस सी 53 एच 102 हे 6 857.8
पॉप, पीपीओ सी 53 एच 100 हे 6 855.7
OOM, पीपीएल, PoPoS, Popo सी 53 एच 98 हे 6 853.7
PPLN, PPoL, PoPoO, MyOO सी 53 एच 96 हे 6 851.7
एलएलएम, LnOM सी 53 एच 94 6 849.7
पीपीपी, SSLa सी 51 एच 98 हे 6 829.7
PPPo, OSLa सी 51 एच 96 हे 6 827.7
PPoPo, PMyO सी 51 एच 94 हे 6 825.7
LnLnLa सी 51 एच 86 हे 6 817.6
एमएमएस, थप्पड़, पीपीएम सी 49 एच 94 हे 6 801.7
SLaPo, PPoM, PPMy सी 49 एच 92 हे 6 799.7
PoPoM, OOCa सी 49 एच 90 हे 6 797.7
एमएमपी सी 47 एच 90 हे 6 773.7
MMPo, OCAP सी 47 एच 88 हे6 771.7
OCaPo सी 47 एच 86 हे 6 769.6
एम एम एम, PPCa, पीएमएलए सी 45 एच 86 हे 6 745.6
PoPCa, PoMLa सी 45 एच 84 हे 6 743.6
PoPoCa सी 45 एच 82 हे 6 741.6
LaLaP, MMLa, MCAP सी 43 एच 82 हे 6 717.6
LaLaPo सी 43 एच 80 हे 6 715.6
ऊ सी 39 एच 72 हे 5 643.5
राजभाषा सी 39 एच 70 हे 5 641.5
डालूँगा सी 39 एच 68 हे 5 639.5
सपा सी 37 एच 72 हे 5 619.5
ओपी सी 37 एच 70 हे 5 617.5
एल.पी. सी 37 एच 68 हे 5 615.5

तालिका 1. फैटी एसिड संरचना, मौलिक रचना, और triacylglycerides और diacylglycerides की sodiated adducts के समस्थानिक जन. एल.एन. = लिनोलेनिक एसिड (18:3), एल = लिनोलेनिक एसिड (18:02), हे = ओलिक एसिड (18:01), एस = Stearic एसिड (18:00), पी = palmitic एसिड (16:00), पो = palmitoleic एसिड (16:1), एम = Myristic एसिड (14:00), मेरा = myristoleic एसिड (14:01) ला = lauric एसिड (12:00), सीए = Capric एसिड (10:00).

चित्रा 1
चित्रा 1. Diethyl ईथर: एसिटिक एसिड हेक्सेन द्वारा व्यापक लिपिड वर्ग जुदाई की पतली परत वर्णलेख(80:20:2 वी / वी / वी) मोबाइल चरण के रूप में. स्टेरोल और एफएफए के बीच बैंड एक मानक द्वारा की पहचान नहीं की गई थी, लेकिन एक फैटी अल्कोहल या मोम diester हो सकता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. Sodiated टैग की MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रम की विस्तारित टैग क्षेत्र. - पूर्वी लाल बल्ला (एल बोरेलिस) विंग ऊतक से (एम / Z 700 950) M / Z 853.7 (OOM, पीपीएल, PoPoS, Popo) और एम में पहचान की चोटियों / Z 879.7 (कलम, LnSP, LSPo). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. पूर्वी लाल बल्ला (एल बोरेलिस) बाल ऊतक से - sodiated टैग (950 मी / z 700) की MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रम की विस्तारित टैग क्षेत्र.मी / z 905.8 (लू, LLS) और एम / Z 907.8 (Ooo, LnSS, LSO) में पहचान की चोटियों. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. Sodiated डेग टुकड़े की MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रम (मी / z 530-730) के डेग क्षेत्र. पूर्वी लाल बल्ले से (एल बोरेलिस) विंग ऊतक मी / z 643.5 (ऊ) और एम / Z 615.5 (एलपी) की पहचान की चोटियों . बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

इस पत्र में लिपिड अणु का समय लेने वाली derivatization बिना, प्रारंभिक टीएलसी द्वारा स्तनधारी आवरण से अलग व्यापक लिपिड वर्गों को अलग करने और MALDI-TOF एमएस द्वारा टैग प्रोफाइल को निर्धारित करने के लिए एक सरल और मजबूत विधि प्रस्तुत करता है. MALDI-TOF एमएस के साथ टैग की गुणवत्ता स्पेक्ट्रा के उत्पादन में महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: न्यूनतम संदूषण या ऑक्सीकरण साथ मिश्रित की 1) सफल निकासी, क्रोमैटोग्राफी द्वारा 2) पर्याप्त जुदाई और अलगाव, और MALDI-TOF द्वारा 3) उच्च संकल्प और जन सटीकता एमएस.

इस पत्र टैग एमएस प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए पूर्वी लाल बल्लेबाजी की plagiopatagium से तटस्थ लिपिड अंश निकालने और अलग से विधि को दर्शाता है. वर्तमान अध्ययन एक बल्ला प्रजातियों का इस्तेमाल किया जबकि (स्तनीयजन्तु: Chiroptera) इन तरीकों से किसी भी स्तनधारी प्रजातियों में से कोल का लिपिड अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. चमगादड़ आवरण टैग, FFAs, squa की कम मात्रा के साथ मुख्य रूप से कोलेस्ट्रॉल जा रहा है की विशेषता हैlene, और स्टेरोल / मोम एस्टर. (- मानव में 7% लेकिन 26 - 1 के बल्ले में 62%) कोलेस्ट्रॉल बड़ा अनुपात में होता है, whilst चमगादड़ में sebum लिपिड अनुपात कि Squalene में मनुष्य से अलग, (मानव में करने के लिए 16% करने के लिए विरोध के रूप में) कम मात्रा में मौजूद है 22 , 31. 28% तक अनुपात पूर्वी लाल बल्ले बालों में पाया जाता है, जबकि मानव बाल के बारे में 3% टैग होते हैं. बल्ले से लिपिड नमूनों की निकासी के अन्य प्रजातियों के लिए इसी तरह की है. इस अध्ययन में विलायक में भिगो कपास गेंदों sebum को दूर करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, एक भी आवरण से अधिक बार की सतह पर विलायक युक्त शीशी या नमूना ट्यूब पलटना कर सकते हैं. विशेष टेप उत्पादों को भी सतह लिपिड 32 निकालने के लिए वैकल्पिक साधन उपलब्ध कराते हैं. एक उचित लिपिड निकासी का एक महत्वपूर्ण हिस्सा त्वचा तेल से प्रदूषण को कम करने के लिए है. यह आसानी से सभी नमूनों और पहने हुए परीक्षा दस्ताने के बीच एक ऊतक के साथ बर्तन पोंछते, मेथनॉल के साथ एक निचोड़ बोतल रखने और सभी कांच के बने पदार्थ और बर्तन छिड़काव द्वारा पूरा किया है. ऑक्सीकरण ओच पॉलीअनसेचुरेटेड acyls BHT के अलावा के माध्यम से रोका जाता है, और यह परवाह किए बिना नमूनों में जमा हो जाती है तापमान का उपयोग किया जाना चाहिए.

बायोमोलिक्यूल विश्लेषण आमतौर पर contaminants से ब्याज की अलग अणुओं को एक chromatographic कदम की आवश्यकता है. टीएलसी गैस या तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए उपकरण आवश्यकताओं से बचा जाता है और मजबूत और repeatable परिणाम प्राप्त करने के लिए कम तकनीकी अनुभव की आवश्यकता है जो इस विधि में प्रयोग किया जाता है. ब्याज की लिपिड वर्ग पर निर्भर करता है, कई अलग अलग मोबाइल चरणों शामिल किया जा सकता है. इसके अलावा, HPTLC प्लेटें और स्कैनिंग densitometry का उपयोग मात्रात्मक परिणाम हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. टीएलसी तरीकों के रूपांतरों यहाँ भी सूची में कई हैं, लिपिड टीएलसी में प्रयुक्त कुछ आम मोबाइल चरणों क्लोरोफॉर्म शामिल हैं: गैर ध्रुवीय लिपिड 28 के विभाजन के लिए एथिल ईथर: मेथनॉल: phospholipids और glycolipids या isooctane के विभाजन के लिए पानी. ई: अन्य लिपिड वर्गों, एच से टैग को अलग करने के मामले में एक तोlvent प्रणाली लगातार काम करता है और तुलनीय परिणाम प्रदान करता है.

टीएलसी उपयोग करने के लिए एक और लाभ यह ब्याज की बैंड तेजी analytes की पूर्व derivatization बिना MALDI-TOF एमएस का उपयोग profiled किया जा सकता है. इस अध्ययन में सिलिका टीएलसी थाली से हटा दिया जाता है, और analyte Eluting विलायक के पी लेनेवाला और वाष्पीकरण अलग करने के लिए एक विलायक और बाद centrifugation में sonication द्वारा इसे से eluted है. वैकल्पिक रूप से, मैट्रिक्स analyte बैंड टीएलसी प्लेटों पर अलग किया और फिर सीधे MALDI-TOF एमएस 33 से विश्लेषण पर सीधे लागू किया जा सकता है. MALDI-TOF एमएस से सफल रूपरेखा पर्याप्त नमूना तैयार करने और ट्यूनिंग और साधन औजार के साथ ऑपरेटर की दक्षता पर निर्भर करता है. साधन ब्याज के अणुओं के लिए आणविक वजन सीमा के उचित कवर मानकों के साथ दैनिक calibrated किया जाना चाहिए. उपकरण का उपयुक्त संवेदनशीलता और संकल्प (जैसे ≥ 10,000) भी confirme किया जाना चाहिएACTH के साथ दैनिक होगी.

स्तनधारी झिल्ली की सतह पर पाया चिकना लिपिड घटक जीवाणु / कवक रोगजनकों द्वारा उपनिवेशन में एक भूमिका निभा सकते हैं. इसलिए प्रजातियों और व्यक्तियों के बीच रासायनिक संरचना का ज्ञान मानव और वन्य जीवन रोगों की प्रक्रियाओं के बारे में सुराग दे सकता है. रोगग्रस्त और स्वस्थ व्यक्तियों के बीच intraspecific मतभेद नैदानिक ​​लक्षण प्रतिनिधित्व कर सकते हैं कि इस बीमारी का पता लगाने और निदान में सहायता. माइक्रोबियल विकास को बाधित कि विशिष्ट यौगिकों मौजूद हैं इसके अलावा, अगर, इन रोग के उपचार और रोकथाम के लिए उपयोग में पहचाना जा सकता है.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

सहायता प्रयोगशाला तरीकों के विकास के दौरान स्कॉट Treece, Katelyn Arter, जेरेमी Ragsdell, टोनी LaMark जेम्स, एमी फिशर, हन्ना ब्लेयर, और Cheyenne Gerdes द्वारा प्रदान किया गया. टीएलसी स्कैनिंग densitometry के साथ सहायता के लिए, हम मदीना-बोलिवर प्रयोगशाला (अरकंसास बायोसाइंसेज संस्थान लुइस एच. Nopo-Olazabal) को धन्यवाद देना चाहूंगा. अरकंसास बायोसाइंसेज संस्थान में अरकंसास एसेट पहल पी 3 केंद्र (ईपीएस-0701890): MALDI-TOF एमएस इस परियोजना के लिए प्रयोग किया जाता है NSF EPSCoR, RII के माध्यम से प्रदान किया गया. अनुदान एक अमेरिकी मत्स्य और वन्य जीव सेवा / अर्कांसस राज्य वन्यजीव अनुदान, राष्ट्रीय Speleological सोसायटी, और इंडियाना राज्य विश्वविद्यालय में उत्तर अमेरिकी चमगादड़ अनुसंधान और संरक्षण के लिए केंद्र द्वारा प्रदान की गई थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Butylated Hydroxytoluene MP Biomedicals, LLC 101162 www.mpbio.com
TLC Flexible Plates Whatman 4410-222 www.whatman.com
ACTH Sigma-Aldrich Chem. Co. A8346-5X1VL www.sigmaaldrich.com
Triolein Sigma-Aldrich Chem. Co. 44895-U  
TLC Lipid Standard TLC 18-1 www.nu-chekprep.com
MALDI TAG Standard Nu-Check Prep., Inc. NIH Code 53B  
MALDI TAG Standard Sigma-Aldrich Chem. Co. 17810-1AMP-S  
Glass Vials with Teflon Cap U.S. National Scientific Co. B7800-2 www.nationalscientific.com/
DHB Sigma-Aldrich Chem. Co. 50862-1G-F  
CHCA Sigma-Aldrich Chem. Co. C8982-10X10 mg  
Sebutape CuDerm S100  

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रसायन विज्ञान अंक 79 आण्विक जीवविज्ञान जैव रसायन जेनेटिक्स एनाटॉमी फिजियोलॉजी Eukaryota जीवाणु संक्रमण और Mycoses रोग की स्थिति लक्षण और लक्षण निदान जीवन विज्ञान (सामान्य) Triacylglyceride Plagiopatagium कोल चिकना ग्रंथि सफेद नाक सिंड्रोम मैट्रिक्स की मदद से Laser-desorption/Ionization समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री पतली परत क्रोमैटोग्राफी पशु मॉडल
प्रारंभिक पतली परत क्रोमैटोग्राफी और MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा चमगादड़ कोल लिपिड में Triacylglyceride सामग्री रूपरेखा
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Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, doi:10.3791/50757 (2013).

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