Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Profilere triacylglycerid Indhold i Bat Integumentary Lipider ved præparativ tyndtlagskromatografi og MALDI-TOF-massespektrometri

Published: September 5, 2013 doi: 10.3791/50757
Automatic Translation
1, 2, 3
1Graduate Program of Environmental Science, Arkansas State University, 2Department of Biological Sciences, Arkansas State University, 3Arkansas Biosciences Institute and College of Agriculture and Technology, Arkansas State University

Summary

Mammalian integument indeholder opløsningsmiddel-ekstraherbare lipider, der kan give kemiske sammensætninger karakteristisk for de enkelte arter. Dette dokument viser en rutinemæssig fremgangsmåde til adskillelse brede lipidklasser isoleret fra integumentary væv ved anvendelse af tyndtlagskromatografi og bestemmelse af triacylglycerid profil ved matrix-assisteret laser desorption / ionisering time-of-flight massespektrometri.

Abstract

Pattedyrs integument omfatter talgkirtler, der udskiller et olieagtigt materiale på hudoverfladen. Talgproduktion er en del af det medfødte immunsystem, der er beskyttende mod patogene mikrober. Unormal talgproduktion og kemiske sammensætning er også et klinisk symptom på særlige hudsygdomme. Sebum indeholder en kompleks blanding af lipider, herunder triacylglycerider, som er artsspecifik. De brede kemiske egenskaber, som udvises af forskellige lipidklasser hindre den specifikke bestemmelse af sebum sammensætning. Analytiske teknikker til lipider kræver typisk kemiske derivatiseringer der er arbejdskrævende og øge prøveforberedelse omkostninger. Dette papir beskriver, hvordan man udtrække lipider fra pattedyr integument, separate brede lipidklasser ved tyndtlagskromatografi, og profilere triacylglycerid indhold ved hjælp af matrix-assisteret laser desorption / ionisering tid-of-flight massespektrometri. Denne robuste metode muliggør en direkte bestemmelseaf triacylglycerid profiler blandt arter og individer, og det let kan anvendes på enhver taksonomiske gruppe af pattedyr.

Introduction

Pattedyrs integumentary væv omfatter overhuden, keratinholdigt strukturer (f.eks hår og negle), og eksokrine kirtler. Sebaceous-type eksokrine kirtler er forbundet med hårsække, som er kollektivt benævnt hårtalgenheden 1.. Talgkirtlerne frigive en fedtet ekssudat på huden overflade kaldet sebum. Sebum består hovedsagelig af glycerolipider (f.eks triacylglycerider [TAG]), gratis fede acyler (FFA'ere), sterol / voksestere og squalen. Sebum kemiske sammensætning er artsspecifik 2. Ud over at være en del af det medfødte immunsystem og give antimikrobiel funktion 3, sebaceous lipider berøre vigtige fysiologiske processer, herunder fordampningsemissioner vandtab gennem huden 4, cellulær integritet og genregulering 5, og lægemiddelabsorptionen 6. Sebaceous lipidsammensætninger kan også tjene som markører for sygdomme. Altered nøgletal og mængder af sebaceous Broad lipidklasser er kliniske tegn på sygdomme, såsom acne vulgaris 7, skæl 8, seborrheic dermatitis 8, asteatosis 9, blandt andre 10. Epidermale og hår væv omfatter variable profiler, sterol og derivater, tags, FFA, ceramider, phospholipider og andre mindre lipid komponenter. Fordi integumentary lipider kan fungere i sygdom processer, bestemme forskelle i kemiske sammensætninger i TAG mellem raske og syge individer kan være nyttige for klinisk diagnose af sygdom.

Lipider er generelt defineret som vanduopløselige organiske forbindelser med enten polær eller ikke-polær-polære substituenter 11. Lipidstrukturer kan være lange carbonhydridkæder, oxygenerede alkaner (inklusive voksestere, FFA, alkoholer, ketoner og aldehyder), eller komplekse ringstrukturer såsom cholesterol 12. Der er otte store klasser af lipider baseret på struktur (FFA'ere, glycerolipids [GL] glycerophospholipider [GP], sphingolipider [SP], sterol lipider [ST], prenol lipider [PR], saccharolipids [SL] og polyketider [PK]), som udviser en bred vifte af kemiske egenskaber afhængigt af klasse 13. På grund af den store variation i de kemiske egenskaber af lipidklasser, ønskes direkte profilering uden forudgående derivatisering af lipid molekyler. En emergente fremgangsmåde lipid forskning er tyndtlagskromatografi (TLC) kombineret med matrix-assisteret laser desorption / ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) 14.

MALDI-TOF MS er udbredt i proteom forskning for at identificere proteiner, og knytte dem til specifikke aminosyresekvenser på grund af de meget præcise peptid ionmasse "fingeraftryk" genereret fra trypsin-fordøjede proteiner 15. MALDI-TOF MS kan også bruges til at profilere andre biomolekyler klasser, herunder lipider, såsom TAG 16-18. MALDI kræver brug af en matrix, typtisk en organisk forbindelse, der indeholder aromatiske og konjugerede dobbeltbinding strukturer. De matrixmolekyler tjener til forsigtigt at overføre energi af laseren med analytterne, fremmer protonoverførsel og frembringe enkeltvis ladede gasfase-ioner 19-21. Ioner udsættes for en høj spænding felt under højvakuum og accelereret i en TOF massespektrometer hvor ioner adskilles efterfølgende af forskelle i hastigheder, som er proportional med deres masse-til-ladningsforhold. Selv meget store biomolekyler kan ioniseret med lidt fragmentering, der producerer enkeltvis ladede molekylære ion arter for forenklet spektrum analyse. Evnen til at analysere lipid molekyler direkte uden forudgående derivatisering har fremmet klar vedtagelse af MALDI-TOF MS i lipidomic forskning 18.

Denne artikel præsenterer en rutinemæssig metode til at isolere og analysere integumentary lipider fra håret, sebaceous sekreter og plagiopatagium af det østlige røde bat (Lasiurus borealis). Dette bruges til at bestemme artskrydsede variationer i bat integumentary lipider at belyse sygdommen proces White-næse syndrom (WNS) 22. WNS er en svampesygdom flagermus og er forårsaget af de nyligt beskrevne psykrofile arter Geomyces destructans 23-25. WNS har kostet mere end 5 millioner nordamerikanske grotte flagermus og truer udryddelsen af sårbare flagermusarter med eventuelle økonomiske konsekvenser af milliarder af dollars i skader på landbruget 26,27. For at undersøge de trin i G. destructans infektion blev lipider ekstraheret fra hår-og fløj væv af østlige røde flagermus og opdelt i brede lipidklasser ved TLC at isolere TAG fraktion for efterfølgende analyse af MALDI-TOF MS. TAG indeholder korte acylkæder og er let afsløres ved MALDI-TOF MS med lidt matrix interferens.

Protocol

ADVARSEL: Få på forhånd alle nødvendige statslige og føderale tilladelser til håndtering, transport og opbevaring af flagermus. Godkendelser skal også fås hos din institutionel dyrepleje og brug udvalg, såvel som fra din institutionel biosikkerhed udvalg. Hvis levende flagermus (eller nervesystemet væv) skal håndteres, bør der håndterer dyr vaccineres for rabies. Flagermus, der anvendes i den aktuelle undersøgelse blev indsamlet fra Ozark St. Francis National Forest, AR, i løbet af sommeren 2010 i henhold til standardmetoder (Arkansas State University Institutional biosikkerhed Udvalg godkendelse # 135.349 til 1) 28.

1.. Tissue Behandling og Lipid Extraction

  1. Rengør alle instrumenter med methanol før og mellem væv samling fra forskellige individer. Trim hår (ca. 1,0 g) fra huden med en saks og sted i en 125 ml Erlenmeyerkolbe. Sample sebum fra fløj overflade ved at skrubbe huden med 4 - 6 vatkugler vædet med chloroform: Methanolopløsningsmiddel (C: M; 3:02 v / v), og placere disse i en separat kolbe.
  2. Uddrag væv med 10 ml C: M (2:1 v / v) indeholdende 0,5% butylhydroxytoluen (BHT) for at forhindre oxidation 29. Brug kun HPLC-kvalitet opløsningsmidler.
  3. Efter 2 timer tilsættes ca 0,5 g vandfrit sulfat til hver kolbe, bland kortvarigt, og indsamle opløsningsmidlet ved filtrering gennem filtrerpapir.
  4. Gentag trin 1.2 og 1.3 gange. Når med 1:1 C: M sekventielt med 1:02 C: M. Pool filtraterne sammen.
  5. Inddampes de samlede filtrater under en strøm af N2, fastlægge tørvægt og opløse lipid-rest i et 3:2 C: M (med 0,5% BHT) til en koncentration på 10 mg / ml. Store prøven i hætteglas ved -20 ° C. Det er generelt bedst at analysere prøver inden for en måned efter prøvetagning og minimere fryse-tø cykler.

2. Lipid Separation ved præparativt tyndtlagskromatografi

  1. Forberede sig på forhånd solvent vasket 1,5 ml microcentrifuge rør ved at fylde med 3:02 C: M, skylning med acetone og lufttørring. Dette gøres for at fjerne blødgørere, som kan interferere med senere massespektrometrianalyse. Opbevar prøverør i en støvfri beholder og håndtere disse rør kun med handsker for at forhindre forurening af hud olier.
  2. Aktiver TLC-pladen ved første pre-udvikle det med 03:02 C: M. Føj nok opløsningsmiddel til TLC kammer til en dybde på 1 cm, og derefter placere pladen i kammeret (tæt med glaslåg), og lad opløsningsmidlet at køre helt til toppen af ​​pladen. Det tager omkring 45 minutter.
  3. Fjern pladen og tørre i et stinkskab, indtil opløsningsmidlet fordamper (ca. 15 min), og placer derefter i en ovn i mindst 10 minutter ved 120 ° C. Placer en blyant mærke på toppen af ​​pladen for at bevare orienteringen, når prøverne anvendes. Placer en lige blyant linje, 1,5 cm fra den nederste kant af pladen, for at markere baseline, hvor prøven og standarder vil blive placeret.
  4. Forbered TLC kammer ved at skære enstykke filtrerpapir stor nok til linje to korte vægge og én lang mur. Filtret papirforing ind i kammeret. Det vil helt våd, når opløsningsmiddel tilsættes til kammeret.
  5. Fremstilling af 100 ml af den mobile fase opløsningsmiddel, som er hexan: diethylether: eddikesyre (H: E: A; 80:20:2 v / v / v). Hæld opløsningsmiddel ind i kammeret for at give en dybde på omkring 1 cm. Dæk med glaslåg, ved hjælp af en siliconefedt forsegling langs den øverste kant af kammeret. Lad kammeret i ligevægt natten før brug.
  6. Påføre prøven manuelt på den forberedte plade med et kapillarrør eller pipette som en kontinuerlig stribe fra omkring 1,5 cm fra den ene kant til 1,5 cm til den anden kant. En automatiseret Prøveapplikatoren foretrækkes, da det vil indlæse prøven i en mere homogen streak. Brug de ydre baner af TLC-plade til at spotte omkring 20 ul blanding af sterol, FFA, tags, og sterolester standarder (brug på 10 mg / ml, kan fås færdiglavede blandinger).
  7. Placer indlæst TLC-plade iden ækvilibrerede kammeret tæt med låget, og udvikle pladen, indtil opløsningsmidlet løber til den øverste kant. Det tager omkring 45 minutter med den mobile fase beskrevet her. Tag pladen fra kammeret og lade det overskydende opløsningsmiddel fordampe fra pladen i et stinkskab i ca 1 min.
  8. Spray med 0,05% rhodamin 6G i 95% ethanol. Visualiser lipid bands under en lang bølgelængde ultraviolet lampe. Marker med en blyant Rf position for de fluorescerende bånd løst i prøven og standarder. Et fotografisk rekord kan tages på dette punkt.
  9. Identificer båndet svarende til TAG standard og fjerne den fra pladen ved at skrabe silica med en spatel på et stort stykke pergamyn vejer papir. Overfør silica til et 1,5 ml solvens-vaskede rør mikrocentrifuge.
  10. Tilsæt 1,0 ml 3:02 C: M opløsningsmiddel til prøverør soniker i 1 min pelletere silica ved centrifugering, og derefter overføre opløsningsmidlet til en ny forvejet rør. Gentag the forrige trin, pool Filtratet og fordampe opløsningsmidlet under en strøm af N2.
  11. Opbevar den tørrede rest indeholdende TAG under N2 i mørke ved 4 ° C, medens yderligere vævsprøver er adskilt ved TLC. Rhodamin 6G er til stede i prøver, men det er uopløseligt i hexan og fjernes under opløsning af prøven umiddelbart før MS-analyse.

3. TAG Analyse ved MALDI-TOF MS

  1. Forbered en frisk α-cyano-4-hydroxy-kanelsyre (CHCA) matrix-opløsning ved at opløse 10 mg CHCA i 1 ml opløsningsmiddel (49,5% ethanol, 49,5% acetonitril og 1% vandig 0,1% TFA).
  2. Forbered adrenocarticotropic hormon (ACTH, 18-39 klip, 2465,1989 Da) af instrumentet opløsning og følsomhed testning ved at blande 1 ml af ACTH (1 mg / ml) med 39,5 pi af 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) til opnåelse af en 10 pmol / pl stamopløsning. Dette kan opbevares ved -20 ° C til fremtidig brug.
  3. Forbered en frisk arbejder ACTH solution (1 pmol / pl), idet 1 ml af 10 pmol / gl stamopløsning blandes med 9 pi 0,1% TFA, og derefter blanding (1:1) med 10 ul af CHCA matrix opløsning til opnåelse af en 500 fmol / pi koncentration.
  4. Forbered TAG standarder på 10 mg / ml i 03:02 C: M for MALDI instrument kalibrering (f.eks tricaprin [470,361 Da] tricaprylin [554,455 Da] trilaurin [638,549 Da] tripalmitin [722,642 Da] tripalmitolein [800,689 Da] , trimyristin [806,736 Da], triolein [884,783 Da], tri-11-eicosenoin [968,877 Da] og trierucin [1052,971 Da]).
  5. Forbered triolein ved 10 mg / ml i 03:02 C: M for en ekstern lock-massekalibrering TAG standard.
  6. Opløses de lagrede TAG prøver i hexan til en opløsning 10 mg / ml.
  7. Forbered en 0,5 M (77.06 mg/1.0 ml) stamopløsning af 2,5-dihydroxybenzoesyre (DHB) med 90% methanol til brug som prøve og standard matrix. Også forberede en 1,0 M (2,0 g/50.0 ml) NaOH. Dæk glasset med DHB løsning ved hjælp af aluminium foi l at beskytte mod lys.
  8. Mix (i forvasket rør) 10,0 ul DHB matrix, 10,0 pi prøve eller standard, og 5,0 pi 1,0 M NaOH. Bland og kortvarigt centrifugeres røret til at bringe blandingen til bunden.
  9. Spot 1,0 ul standard, prøve og ACTH onto en MALDI rustfrit stål måltavle og sted i en ekssikkator indtil tør. Placer målpladen i instrumentet til dataopsamling.
  10. Udfør MALDI-TOF MS-analyser positiv reflectron mode. Tune og kalibrere instrumentet som beskrevet af instrumentets fabrikant ved hjælp af ACTH og TAG standardløsninger.
  11. Anskaf spektre for hver prøve spottet på måltavle (i overensstemmelse med instrumentets specifikationer parametre for dette arbejde var 5 Hz laser skudhastighed, ~ 100 skud per stedet at få et gennemsnit spektrum). Efter udjævning og fratrække baggrunden fra MALDI spektre proces iontoppe manuelt med online søgemaskine LIPID Maps (/ Tools / ms / glycerolipids_batch "target =" _blank "> www.lipidmaps.org / tools / ms / glycerolipids_batch).
  12. Kopiere og indsætte listen spektre på listen over prækursor-ioner og intensitet kassen. Begrænse søgningen til acyl sammensætning ønskes. Identificer TAG af masse / ladning (m / z)-forhold fra ioner til stede i spektret for hver prøve. Hvis fedtsyremethylestere (FAME) procenter er tilgængelige fra separat GC / MS-analyse, tilføje disse data for at opnå sandsynligheder for TAG stede.

INSTRUMENT: Den massespektrometer anvendes i denne undersøgelse er en Waters MALDI Micro MX (udstyret med en 337 nm 20 Hz N2 laser). Enhver producentens MALDI instrument med positiv reflectron-mode kapacitet kan anvendes. Generelle indstillinger anvendes, er puls spænding, 2.000 V reflectron, 5.200 V kilde, 15.000 V, med dataopsamling ved hjælp MassLynx software (ver. 4.0). Disse driftsbetingelser giver masse opløsning større end 12.000.

Representative Results

Ekstraktionen fremgangsmåde til isolering af totale lipider fra væv beskrevet af Folch 30 er en enkel procedure, som er indrettet her. Efter væv ekstraktion og fordampning af opløsningsmidlet, lipider ofte forekommer som en gullig film. Den gule farve sandsynligvis er fra proteinkontaminanter, som kan fjernes ved at udføre en væske-væske-ekstraktion. Denne ekstra prøve behandling er ikke nødvendig i denne procedure, fordi præparativ TLC adskiller TAG fraktion fra sådanne forureninger. Tilsætningen af ​​frisk vandfrit natriumsulfat på alle filtrerings-trin hjælper med at reducere vandforurening, der påvirker nøjagtige lipid vægt bestemmelser.

Mammalian integumentary lipid analyser ved præparativ TLC med H: E: A som den mobile fase vil normalt løse fire forskellige bands, der svarer til (startende fra oprindelse) steroler, FFA, koder og sterolestere / voksestere / squalen (Figur 1). Den lejlighed, når du bruger analytiskcal høj ydeevne (HK) TLC med H: E: En mobil fase, de sterolestere, voksagtige estere, og squalen vil adskille og fremstår som tre separate bånd. Under de betingelser, der anvendes i den foreliggende undersøgelse, er sterol / voksagtige estere ikke adskilt. Hvis disse bånd er af interesse, kan den mobile fase ændres til isooctan: diethylether (95:5 v / v) og HPTLC plade kan analyseres ved scanningsdensitometri. Andre faktorer kan forårsage dårlig separation. Disse er normalt fjernes ved at placere filteret papir i kammeret, anvender fedt til en tæt forsegling på låget, aekvilibrering af kammeret natten over, og holde rene TLC kamre, for at opnå en ensartet kvalitet TLC separationer og data.

Repræsentative MALDI-TOF massespektre opnået for TAG isoleret fra den østlige røde bat er vist i figur 2 og 3.. Disse spektre indeholder TAG iontoppe i massen interval mellem m / z 850 til 910, hvilket er typisk for TAG isoleret fra ikke-akvatisk pattedyrsek. Tilsætning af 1,0 M NaOH fremmer enkeltvis opladet Na +-ioner, der er mere stabil end H +-ioner. Ud over stabilitet, fraværet af H + og K +-ioner øger nem spektrum analyse. M / z 850-910 ion toppe svarer til 16:00, 18:00, 18:01, og 18:02 FA dele er de dominerende acyl bestanddele i tags (tabel 1). Mulige FA-dele i TAG kan indledningsvis bestemmes af de samlede ion m / z til stede i MALDI-TOF MS-spektre, og forskelle mellem arter og individer udledes. Men hvis de specifikke forhold af acyl indhold er påkrævet, så MS / MS eller gaskromatografi (GC / MS) skal anvendes. Yderligere oplysninger om acyl nøgletal kan udledes ved at observere toppene i diacylglycerider område af spektret (figur 4). Diacylglycerider er fremstillet af TAG fragmentering i MALDI source og kan findes i m / z 590-650 region. TAG fragmentering kan forøges vedudelade tilsætning af 1,0 M NaOH 16. Eastern rød bat fløj væv er kendetegnet ved en dominerende top ved m / z 879,7 og hår væv med en dominerende top ved m / z 881,8 (figur 2 og 3). Toppe ved m / z 907,8, 879,7 og 855,7 (POP, posttjenester), er omtrent, selv i intensitet (~ 50%) i hår væv med toppe på 853,7 væsen ~ 40%.

Sammensætning Elemental sammensætning Målt masse
Na + Emneord Na + Emneord
SSO C 57 H 108 O 6 911,8
OOS, LSS C 57 H 106 O 6 909,8
OOO, LNS'er, LSO C 57 H104 O 6 907,8
Loo, LLS C 57 H 102 O 6 905,8
LLO, OOLn C 57 H 100 O 6 903,7
LLL C 57 H 98 O 6 901,7
LLLn C 57 H 96 O 6 899,7
LLnLn C 57 H 94 O 6 897,7
LnLnLn C 57 H 92 O 6 895,7
OSP C 55 H 104 O 6 883,8
LSP, OOP, Sopo C 55 H 102 O 6 881,8
LOP, LnSP, LSPo C 55 H 100 O 6 </ Td> 879,7
LLP, LNOP, Lopo C 55 H 98 O 6 877,7
LnLP, LLPo, LnOPo C 55 H 96 O 6 875,7
LnLnP, LnLPo C 55 H 94 O 6 873,7
LnLnPo C 55 H 92 O 6 871,7
PPS C 53 H 102 O 6 857,8
POP, posttjenester C 53 H 100 O 6 855,7
OOM, PPL, POPOS, Popo C 53 H 98 O 6 853,7
PPLN, ppol, PoPoO, MyOO C 53 H 96 O 6 851.7
LLM, Lnom C 53 H 94 6 849,7
PPP, SSLa C 51 H 98 O 6 829,7
PPPo, Osla C 51 H 96 O 6 827,7
PPoPo, PMyO C 51 H 94 O 6 825,7
LnLnLa C 51 H 86 O 6 817,6
MMS, SLAP PPM C 49 H 94 O 6 801,7
SLaPo, PPOM, PPMy C 49 H 92 O 6 799,7
PoPoM, OOCa C 49 H 90 O 6 797,7
MMP C 47 H 90 O 6 773,7
MMPo, OCaP C 47 H 88 O6 771,7
OCaPo C 47 H 86 O 6 769,6
MMM, PPCA, PMLa C 45 H 86 O 6 745,6
PoPCa, PoMLa C 45 H 84 O 6 743,6
PoPoCa C 45 H 82 O 6 741,6
LaLaP, MMLa, MCAP C 43 H 82 O 6 717,6
LaLaPo C 43 H 80 O 6 715,6
OO C 39 H 72 O 5 643,5
OL C 39 H 70 O 5 641,5
LL C 39 H 68 O 5 639,5
SP C 37 H 72 O 5 619,5
OP C 37 H 70 O 5 617,5
LP C 37 H 68 O 5 615,5

Tabel 1. Fedtsyresammensætningen, elementært sammensætning og isotopiske masse af sodiated addukter af triacylglycerider og diacylglycerider. Ln = linolensyre (18:03), L = linolsyre (18:02), O = oliesyre (18:01), S = stearinsyre (18:00), P = palmitinsyre (16:00), Po = palmitoleinsyre (16:01), M = myristinsyre (14:00), My = myristoleinsyre (14:01) La = laurinsyre syre (12:00), Ca = caprinsyre (10:00).

Figur 1
Figur 1. Tyndtlags kromatogram bred lipid class separation af hexan: diethylether: eddikesyre(80:20:2 v / v / v) som den mobile fase. Båndet mellem sterol-og FFA ikke blev identificeret ved en standard, men kan være en fedtalkohol eller voks diester.

Figur 2
Figur 2. Udvidet TAG region MALDI-TOF massespektrum af sodiated TAG. (M / z 700 til 950) fra Eastern rød bat (L. borealis) fløj væv Peaks identificeret ved m / z 853,7 (OOM, PPL, POPOS, Popo) og m / z 879,7 (LOP, LnSP, LSPo). Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. Udvidet TAG region MALDI-TOF massespektrum af sodiated tags (m / z 700 til 950) fra Eastern rød bat (L. borealis) hår væv.Peaks identificeret ved m / z 905,8 (loo, LLS) og m / z 907,8 (OOO, LNS'er, LSO). Klik her for at se større figur .

Figur 4
Figur 4.. DAG regionen MALDI-TOF massespektrum af sodiated DAG-fragmenter (m / z 530 til 730). Fra østlige rødt bat (L. borealis) fløj væv Peaks identificeret ved m / z 643,5 (OO) og m / z 615,5 (LP) . Klik her for at se større figur .

Discussion

Denne artikel præsenterer en enkel og robust metode til adskillelse brede lipidklasser isoleret fra pattedyr integument ved præparativ TLC og bestemme TAG profiler ved MALDI-TOF MS, uden tidskrævende derivatisering af lipid molekyler. De kritiske trin i at producere kvalitet spektre af TAG med MALDI-TOF MS omfatter: 1) Vellykket udvinding af forbindelsen med minimal forurening eller oxidation, 2) Tilstrækkelig adskillelse og isolation ved kromatografi, og 3) Høj opløsning og masse nøjagtighed ved MALDI-TOF MS.

Dette papir demonstrerer metoden ved at udtrække og adskillelse af den neutrale lipidfraktion fra plagiopatagium i den østlige røde bat til at opnå TAG MS Profiler. Mens denne undersøgelse brugte en flagermusarter (Mammalia: CHIROPTERA) disse metoder kan udvides til at studere integumentary lipider eventuelle pattedyrarter. Bat integument er karakteriseret ved at være overvejende kolesterol, med lavere mængder af TAG, FFAs, squaLene og sterol / voksestere. Sebum lipidforhold i flagermus afviger fra mennesker i at squalen er til stede i små mængder (i modsætning til op til 16% i mennesker), mens kolesterol forekommer i større forhold (1 - 7% i mennesker, men 26 til 62% i hunde) 22 31. Menneskelige hår indeholder omkring 3% TAG, mens nøgletal op til 28% er fundet i det østlige rødt bat hår. Udvindingen af ​​lipid prøver fra flagermus er den samme for andre arter. Selv i denne undersøgelse vatkugler dyppet i opløsningsmiddel anvendes til at fjerne sebum, kan man også vendes et hætteglas eller en prøverør indeholdende opløsningsmiddel på overfladen af ​​integument flere gange. Specialiserede tape produkter også giver alternative muligheder for at udtrække overflade lipider 32.. En kritisk del af en ordentlig lipidekstraktion er at minimere forurening fra hud olier. Dette opnås let ved at holde et squeeze flaske med methanol og sprøjtning alle glas og køkkenredskaber, aftørring redskaber med en serviet mellem alle prøver og iført undersøgelse handsker. Oxidation of polyumættede acylgrupper forhindres ved tilsætning af BHT, og det bør anvendes uanset temperaturen prøver opbevares ved.

Biomolekyler analyse kræver normalt en kromatografisk skridt til at adskille molekyler af interesse fra forureninger. TLC anvendes i denne fremgangsmåde, som undgår instrumentering krav til gas-eller væskekromatografi og kræver mindre teknisk erfaring for at opnå solide og reproducerbare resultater. Afhængigt af lipid klasse af interesse, kan mange forskellige mobile faser inkorporeres. Endvidere kan brugen af ​​HPTLC plader og scanningsdensitometri anvendes til at opnå kvantitative resultater. Mens variationer af TLC metoder er for talrige til at nævne her, nogle fælles mobile faser, der anvendes i lipid TLC omfatter chloroform: methanol: vand til separation af phospholipider og glycolipider eller isooctan: ethylether til adskillelse af ikke-polære lipider 28. Med hensyn til at adskille tags fra andre lipidklasser, H: E: A sålvent system fungerer konsekvent og giver sammenlignelige resultater.

En anden fordel for at bruge TLC er, at bands af interesse hurtigt kan profileres ved hjælp af MALDI-TOF MS uden forudgående derivatisering af analytter. I denne undersøgelse silica fjernes fra TLC-pladen, og analytten elueret fra det ved sonikering i et opløsningsmiddel og efterfølgende centrifugering for at adskille adsorbenten og afdampning af elueringsopløsningsmidlet. Alternativt kan der anvendes matrix direkte på analyt bånd adskilt på TLC-plader og derefter analyseret direkte ved MALDI-TOF-MS 33. Vellykket profilering ved MALDI-TOF MS er afhængig af tilstrækkelig prøveforberedelse og operatørens færdigheder med tuning og kalibrering af instrumentet. Instrumentet bør kalibreres dagligt med standarder, der dækker molekylvægtinterval hensigtsmæssigt for molekyler af interesse. Den passende følsomhed og opløsning (fx ≥ 10.000) af udstyret bør også confirmed dagligt med ACTH.

Sebaceous lipidbestanddele findes på overfladen af ​​pattedyr integument kan spille en rolle i kolonisering af bakterielle / svampepatogener. Derfor kendskab til den kemiske sammensætning blandt arter og individer kan give fingerpeg om processer menneskelige og dyreliv sygdomme. Intraspecifikke forskelle blandt syge og raske personer kan repræsentere kliniske tegn, at støtte i påvisning og diagnosticering sygdom. Desuden, hvis specifikke forbindelser, som inhiberer mikrobiel vækst er til stede, kan disse identificeres til anvendelse i behandling og forebyggelse af sygdomme.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Assistance blev leveret af Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell, Tony Lamark James, Amy Fischer, Hannah Blair, og Cheyenne Gerdes under udviklingen af ​​laboratoriemetoder. Vi vil gerne takke Medina-Bolivar Laboratory (Luis H. NOPO-Olazabal, Arkansas Biosciences Institute) for at få hjælp med TLC scanningsdensitometri. MALDI-TOF MS bruges til dette projekt blev givet gennem NSF EPSCoR, RII: Arkansas ASSET Initiative P3 Center (EPS 0.701.890) i Arkansas Biosciences Institute. Finansieringen blev leveret af en amerikansk Fiskeri og Wildlife Service / Arkansas State Wildlife Grant, National speleologiske Society og The Center for nordamerikanske Bat forskning og bevaring på Indiana State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Butylated Hydroxytoluene MP Biomedicals, LLC 101162 www.mpbio.com
TLC Flexible Plates Whatman 4410-222 www.whatman.com
ACTH Sigma-Aldrich Chem. Co. A8346-5X1VL www.sigmaaldrich.com
Triolein Sigma-Aldrich Chem. Co. 44895-U  
TLC Lipid Standard TLC 18-1 www.nu-chekprep.com
MALDI TAG Standard Nu-Check Prep., Inc. NIH Code 53B  
MALDI TAG Standard Sigma-Aldrich Chem. Co. 17810-1AMP-S  
Glass Vials with Teflon Cap U.S. National Scientific Co. B7800-2 www.nationalscientific.com/
DHB Sigma-Aldrich Chem. Co. 50862-1G-F  
CHCA Sigma-Aldrich Chem. Co. C8982-10X10 mg  
Sebutape CuDerm S100  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pappas, A., Anthonavage, M., Gordon, J. S. Metabolic fate and selective utilization of major FAs in human sebaceous gland. Journal of Investigative Dermatology. 118 (1), 164-171 (2002).
  2. Nicolaides, N., Hwei, H. C., Rice, G. R. The skin surface lipids of man compared with those of eighteen species of animals. Journal of Investigative Dermatology. 51 (2), 83-89 (1968).
  3. Desbois, A. P., Smith, V. J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (6), 1629-1642 (2010).
  4. Munoz-Garcia, A., Williams, J. B. Cutaneous water loss and lipids of the stratum corneum in Dusky Antbirds, a lowland tropical bird. Condor. 109 (1), 59-66 (2007).
  5. Catala, A. The function of very long chain polyunsaturated fatty acids in the pineal gland. Biochimica et Biophysica Acta. 1801, 95-99 (2010).
  6. Stahl, J., Niedorf, F., Kietzmann, M. Characterization of epidermal lipid composition and skin morphology of animal skin ex vivo. European Journal of Pharmacology. 72 (2), 310-316 (2009).
  7. Picardo, M., Ottaviani, M., Camera, E., Mastrofrancesco, A. Sebaceous gland lipids. Dermato-Endocrinology. 1 (2), 68-71 (2009).
  8. Ro, B. I., Dawson, T. L. The role of sebaceous gland activity and scalp microfloral metabolism in the etiology of seborrheic dermatitis and dandruff. Journal of Investigative Dermatology. 10, 194-197 (2005).
  9. Davoudi, S. M., Sadr, B., et al. Comparative study of skin sebum and elasticity level in patients with sulfur mustard-induced dermatitis and healthy controls. Skin Research and Technology. 16 (2), 237-242 (2010).
  10. Zampeli, V. A., Makrantonaki, E., Tzellos, T., Zouboulis, C. C. New pharmaceutical concepts for sebaceous gland diseases: implementing today's pre-clinical data into tomorrow's daily clinical practice. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (10), 1898-1913 (2012).
  11. Horton, H. R., Moran, L. A., et al. Principles of Biochemistry. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. (1993).
  12. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. A comprehensive classification system for lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 107 (5), 337-364 (2005).
  13. Fahy, E., Subramaniam, S., et al. Update of the LIPID MAPS comprehensive classification system for lipids. Journal of Lipid Research. 50 (5), S9-S14 (2009).
  14. Fuchs, B., Süß, R., Nimptsch, A., Schiller, J. MALDI-TOF-MS directly combined with TLC: A review of the current state. Chromotagraphia. 69, S95-S105 (2009).
  15. Savary, B. J., Vasu, P. Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols. Lorence, A. , 3rd, Humana Press. New York, NY. (2011).
  16. Gidden, J., Liyanage, R., Durham, B., Lay, J. O. Reducing fragmentation observed in the matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of triacylglycerols in vegetable oils. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 1951-1957 (2007).
  17. Fuchs, B., Schiller, J. Application of MALDI-TOF mass spectrometry in lipidomics. European Journal of Lipid Science and Technology. 111 (1), 83-98 (2009).
  18. Fuchs, B., Sϋβ, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49 (4), 450-475 (2010).
  19. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  20. Hillenkamp, F., Karas, M., Holtkamp, D., Klusener, P. Energy deposition in ultraviolet laser desorption mass spectrometry of biomolecules. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 69 (3), 265-276 (1986).
  21. Knochenmuss, R. Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Practicalities, and Biological Applications. Cole, R. B. , 2nd, John Wiley and Sons. NJ. 149-262 (2010).
  22. Pannkuk, E. L., Gilmore, D., Savary, B. J., Risch, T. S. Triacylglyceride (TAG) profiles of integumentary lipids isolated from three bat species determined by matrix-assisted laser desorption - ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI - TOF MS). Canadian Journal of Zoology. 90 (9), 1117-1127 (2012).
  23. Blehert, D., Hicks, A. C., et al. Bat white-nose syndrome: An emerging fungal pathogen. Science. 323 (5911), 227-228 (2009).
  24. Gargas, A., Trest, M. T., et al. Geomyces destructans sp. nov. associated with bat white-nose syndrome. Mycotaxon. 108, 147-154 (2009).
  25. Lorch, J. M., Meteyer, C. U., et al. Experimental infection of bats with Geomyces destructans causes white-nose syndrome. Nature. 480 (7377), 376-378 (2011).
  26. Frick, W. F., Pollock, J. F., et al. An emerging disease causes regional population collapse of a common North American bat species. Science. 329 (5992), 679-682 (2010).
  27. Boyles, J. G., Cryan, P. M., McCracken, G. F., Kunz, T. H. The economic importance of bats in agriculture. Science. 332 (6025), 41-42 (2011).
  28. Sikes, R. S., Gannon, W. L., et al. Guidelines of the American Society of Mammalogists on the use of wild mammals in research. Journal of Mammalogy. 92 (1), 235-253 (2011).
  29. Law, S., Wertz, P. W., Swartzendruber, D. C., Squier, C. A. Regional variation in content, composition, and organization of porcine epithelial barrier lipids revealed by thin layer chromatography and transmission electron microscopy. Archives of Oral Biology. 40 (12), 1085-1091 (1995).
  30. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  31. Nicolaides, N. Skin lipids: Their biochemical uniqueness. Science. 186 (4158), 19-24 (1974).
  32. Camera, E., Ludovici, M., et al. Comprehensive analysis of the major lipid classes in sebum by rapid resolution high-performance liquid chromatography and electrospray mass spectrometry. Journal of Lipid Research. 51, 3377-3388 (2011).
  33. Fuchs, B., Süß, R., et al. Lipid analysis by thin-layer chromatography- A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).

Tags

Kemi molekylærbiologi biokemi genetik anatomi fysiologi Eukaryota bakterielle infektioner og Mycoses patologiske tilstande Tegn og symptomer diagnose Life Sciences (General) triacylglycerid Plagiopatagium integument sebaceous kirtel White-næse syndrom Matrix-Assisted Laser-desorption/Ionization Time-of-Flight massespektrometri tyndtlagskromatografi dyremodel
Profilere triacylglycerid Indhold i Bat Integumentary Lipider ved præparativ tyndtlagskromatografi og MALDI-TOF-massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pannkuk, E. L., Risch, T. S.,… More

Pannkuk, E. L., Risch, T. S., Savary, B. J. Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (79), e50757, doi:10.3791/50757 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter