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Immunology and Infection

मेजबान सेल शाही सेना संश्लेषण पर वायरल संक्रमण के प्रभाव को मापने के लिए क्लिक करें रसायन विज्ञान का प्रयोग

Published: August 9, 2013 doi: 10.3791/50809
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, Sealy Center for Vaccine Development, Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch

Summary

इस विधि दरार घाटी बुखार वायरस (RVFV) तनाव सांसद-12 के साथ संक्रमण के बाद मेजबान सेल प्रतिलेखन में परिवर्तन को मापने के लिए क्लिक करें रसायन विज्ञान के उपयोग का वर्णन करता है. परिणाम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से गुणात्मक कल्पना या प्रवाह के माध्यम से मात्रात्मक प्राप्त किया जा सकता है. इस विधि के अन्य वायरस के साथ प्रयोग के लिए अनुकूल है.

Abstract

कई आरएनए वायरस सेलुलर गढ़ नाकाम करने के लिए एक साधन के रूप में मेजबान सेल प्रतिलेखन बाधित करने की क्षमता विकसित किया है. इन वायरस के अध्ययन के लिए, संक्रमित कोशिकाओं में transcriptional गतिविधि को मापने का एक त्वरित और विश्वसनीय तरीका है इसलिए यह महत्वपूर्ण है. परंपरागत रूप से, प्रतिलेखन एच uridine ऐसे immunostaining के माध्यम से पता लगाने के द्वारा पीछा 5 bromouridine (ब्रू) के रूप में halogenated uridine analogs के autoradiography या जगमगाहट गिनती, या समावेश के माध्यम से पता लगाने के द्वारा पीछा 3 जैसे रेडियोधर्मी nucleosides का समावेश करके भी मापा गया है. ब्रू का पता लगाने के बोझिल हो सकता है और कम संवेदनशीलता से पीड़ित हो सकता है, जबकि रेडियोधर्मी आइसोटोप का उपयोग करते हैं, तथापि, विशेष उपकरणों की आवश्यकता है और प्रयोगशाला सेटिंग्स की संख्या में संभव नहीं है.

एक azide और एक alkyne से एक तांबे उत्प्रेरित triazole गठन शामिल है जो हाल ही में विकसित क्लिक करें रसायन विज्ञान,, अब एक तेजी से और highl प्रदान करता हैइन दो तरीकों के लिए वाई संवेदनशील वैकल्पिक. क्लिक रसायन शास्त्र नवजात आरएनए पहले एक फ्लोरोसेंट azide के साथ लेबल का पता लगाने के द्वारा पीछा uridine अनुरूप 5 ethynyluridine (ईयू) के समावेश द्वारा लेबल है जिसमें एक दो कदम प्रक्रिया है. ये azides दृश्य के लिए विकल्प की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुमति देता है, कई अलग fluorophores के रूप में उपलब्ध हैं.

इस प्रोटोकॉल तनाव सांसद -12 क्लिक करें रसायन विज्ञान का उपयोग कर दरार घाटी बुखार वायरस (RVFV) से संक्रमित कोशिकाओं में transcriptional दमन को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. समवर्ती, इन कोशिकाओं में वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति शास्त्रीय इंट्रासेल्युलर immunostaining के द्वारा निर्धारित किया जाता है. 8 विस्तार प्रवाह के माध्यम से ट्रांसक्रिप्शनल दमन यों के लिए एक विधि के माध्यम से 5 कदम है, जबकि 4 विस्तार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से ट्रांसक्रिप्शनल दमन कल्पना करने के लिए एक विधि के माध्यम से कदम 1. इस प्रोटोकॉल अन्य वायरस के साथ प्रयोग के लिए आसानी से अनुकूल है.

Introduction

परंपरागत रूप से, transcriptional गतिविधि रेडियोधर्मी (3 एच uridine) 1 या तो के समावेश के माध्यम से मापा या नवजात शाही सेना में (BRU) 2 nucleosides halogenated किया गया है. ये uridine एनालॉग, कोशिकाओं द्वारा उठाया न्यूक्लीओसाइड उबार मार्ग के माध्यम से uridine-triphosphate (UTP) में परिवर्तित किया, और बाद में नए संश्लेषित शाही सेना में शामिल किया. 3 एच uridine समय लेने वाली हो सकती है, जो autoradiography, या जगमगाहट से पता लगाया जा सकता है कर रहे हैं विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, जो गिनती. इसके अलावा, रेडियोधर्मी आइसोटोप का उपयोग उच्च रोकथाम जैव सुरक्षा प्रयोगशालाओं सहित, प्रयोगशाला सेटिंग्स की संख्या में व्यावहारिक नहीं हो सकता. ब्रू शाही सेना माध्यमिक संरचना एंटीबॉडी के बंधन के लिए एक steric बाधा हो सकता है के रूप में नाभिक या शाही सेना के आंशिक विकृतीकरण, के लिए एंटीबॉडी का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए कठोर permeabilization की आवश्यकता हो सकती है, जो विरोधी ब्रू एंटीबॉडी के साथ immunostaining के माध्यम से पता लगाया जा सकता है.

_content "> यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल हाल ही में RVFV तनाव सांसद -12 से संक्रमित कोशिकाओं में transcriptional गतिविधि को मापने के लिए रसायन शास्त्र 3 क्लिक विकसित की है. क्लिक करें रसायन विज्ञान के एक उच्च चयनात्मक और कुशल तांबे (आई) उत्प्रेरित एक alkyne और बीच cycloaddition प्रतिक्रिया पर निर्भर करता है इस्तेमाल 4,5 एक azide के आधा भाग. इस प्रोटोकॉल में, संक्रमित कोशिकाओं में नवजात आरएनए पहले uridine अनुरूप यूरोपीय संघ के समावेश के माध्यम से लेबल है. चरण में एक दूसरे, शामिल यूरोपीय संघ के एक फ्लोरोसेंट azide के साथ प्रतिक्रिया के माध्यम से पता चला है. इस विधि का मुख्य लाभ हैं (1) यह रेडियोधर्मी आइसोटोप के उपयोग की आवश्यकता नहीं है और (2) है कि यह कठोर permeabilization या शाही सेना के विकृतीकरण की आवश्यकता नहीं होती. अपर्याप्त द्वारा बाधा नहीं है कम से कम 50 दा, फ्लोरोसेंट azide के उपयोग की एक आणविक वजन के साथ एक वर्ग के साथ शाही सेना का पता लगाने के संयोजन जब permeabilization या शाही सेना माध्यमिक संरचना. इसके अलावा, शोधकर्ताओं प्राथमिक एंटीबॉडी की अपनी पसंद में सीमित नहीं हैंवायरल प्रोटीन के लिए राजनैतिक immunostaining के.

दो अलग अलग तरीकों इस प्रोटोकॉल में वर्णित हैं: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चरण 1-4), और प्रवाह cytometry (चरण 5-8) के माध्यम से प्रतिलेखन बढ़ाता के लिए एक माध्यम प्रतिलेखन दृश्यमान करने के लिए एक. इन दोनों पद्धतियों के एक सेल से सेल आधार पर transcriptional गतिविधि और वायरल संक्रमण के बीच एक संबंध के लिए अनुमति देता है वायरल प्रोटीन, के लिए एक intracellular immunostaining के साथ नवजात शाही सेना की लेबलिंग गठबंधन.

लेखकों सफलतापूर्वक प्रोटोकॉल RVFV तनाव सांसद -12 6, Toscana के वायरस (TOSV) 10 से संक्रमित विभिन्न सांसद -12 म्यूटेंट 7,8, 9, और कोशिकाओं से संक्रमित कोशिकाओं से संक्रमित कोशिकाओं में transcriptional गतिविधि का निर्धारण करने के लिए यहाँ वर्णित का इस्तेमाल किया है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से विभिन्न वायरस के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित और विशिष्ट वायरल या सेलुलर प्रोटीन की immunofluorescence धुंधला शामिल करने के लिए संशोधित करने की क्षमता है किया जा सकता है.

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Protocol

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा ट्रांसक्रिप्शन का विश्लेषण

1. सांसद -12 और यूरोपीय संघ के साथ लेबल नवजात शाही सेना के साथ कोशिकाओं को संक्रमित

  1. 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में रखें 12 मिमी दौर coverslips, अच्छी तरह से प्रति एक coverslip.

नोट: कोशिकाओं कुओं में रखने से पहले मुसीबत coverslips के लिए पालन, पाली एल lysine (मेगावाट ≥ 70,000) के साथ कोट है. इस उद्देश्य के लिए, 5 मिनट के लिए पाली एल lysine के एच 2 ओ में एक बाँझ 0.1 मिलीग्राम / एमएल समाधान में डूब coverslips. कम से कम 2 घंटे के लिए बाँझ एच 2 हे और हवा शुष्क साथ coverslips कुल्ला.

  1. Coverslips पर बीज 293 कोशिकाओं के लिए, अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर विकास मध्यम (DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त) में 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं जोड़ें. 37 पर एक humidified इनक्यूबेटर में सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 हे / एन
  2. 3 के संक्रमण की बहुलता (MOI) में सांसद -12 के साथ कोशिकाओं को संक्रमित. शामिल कम से कम दो असंक्रमित कुओं: दो कुओं में से एक असंक्रमित नियंत्रण के रूप में काम करेगा, अन्य ट्रांसक्रिप्शनल दमन के लिए एक नियंत्रण के रूप में 1.5 कदम पर actinomycin डी (ActD) के साथ इलाज किया जाएगा. मध्यम विकास निकालें और वायरस शेयर पतला तो कुल मात्रा प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा कि 200 मिलीलीटर है. 37 पर एक humidified इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.

नोट: इसके बजाय कोशिकाओं को संक्रमित करने में, कोशिकाओं को भी प्लास्मिड डीएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट या इन विट्रो में एक विशिष्ट वायरल प्रोटीन एन्कोडिंग शाही सेना संश्लेषित किया जा सकता है. इस उद्देश्य के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उपयुक्त रासायनिक अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ कोशिकाओं transfect और 16 घंटे बाद अभिकर्मक में 1.5 कदम आगे बढ़ना. यह शाही सेना लेबलिंग और निर्धारण से पहले अभिकर्मक शर्तों और ऊष्मायन समय का अनुकूलन करने की सलाह दी जाती है.

  1. Inoculum निकालें और अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर ताजा मध्यम विकास जोड़ें. 15 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
ove_content "> नोट:. एक और वायरस के साथ प्रयोग के लिए इस प्रोटोकॉल आदत डाल, तो यह शाही सेना लेबलिंग और निर्धारण के लिए इष्टतम समय बिंदु निर्धारित करने के लिए एक समय बेशक प्रयोग करने की सलाह दी जाती है कि इस समय संक्रमण बार कंपित कर रहे हैं ताकि कोर्स और सभी सेट अप नमूने, लेबल तय की, और एक ही समय में दाग जा सकता है.

  1. 15 घंटे के बाद संक्रमण (HPI) में, 1 मिमी यूरोपीय संघ से युक्त मध्यम से मध्यम विकास की जगह. नकली संक्रमित कुओं में से एक के लिए, यह भी 5 ग्राम / एमएल ActD जोड़ें. ActD डीएनए पर निर्भर शाही सेना संश्लेषण को रोकता है, क्योंकि यह ट्रांसक्रिप्शनल दमन के लिए नियंत्रण के रूप में काम करेगा. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें.
  2. 16 HPI कम, मध्यम हटाने और 1 मिलीलीटर पीबीएस (KCl 0.20 ग्राम / एल, 2 के.एच. पीओ 4 0.20 ग्राम / एल, NaCl 8.00 छ / एल, ना 2 4 HPO 1.15 ग्राम / एल, 7.4 पीएच) के साथ एक बार coverslips धोने अच्छी तरह से प्रति. अच्छी तरह से प्रति 4% paraformaldehyde के 1 मिलीलीटर (पीएफए) जोड़ने और आरटी पर 30 मिनट के लिए incubating द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें.

नोट: 4% पीएफए ​​निर्धारण समाधान तैयार करने के लिए, डिग्री सेल्सियस गर्म चुंबकीय दोषी पर 60 पर गरम 150 मिलीलीटर एच 2 ओ में 10 ग्राम paraformaldehyde के भंग. 1 एम NaOH के 500 μl जोड़ें और समाधान स्पष्ट हो जाता है जब तक हलचल जारी है. कण को हटाने और 62.5 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर जोड़ने के लिए फिल्टर पेपर के माध्यम से फिल्टर पीएफए ​​समाधान (77 मिमी नाह 2 पीओ 4, 287 मिमी 2 ना 4 HPO, पीएच 7.4). 250 मिलीलीटर की कुल मात्रा को एच 2 हे जोड़ें. एकल उपयोग aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर करें.

  1. अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ एक बार धोएं. कोई ऊष्मायन समय इस और बाद के सभी धोने कदम के लिए आवश्यक है. चरण 2 के लिए तुरंत आगे बढ़ें.

नोट: समय की लंबी अवधि के लिए इस स्तर पर रखा अगर आरएनए घिनौना रूप में यह तुरंत क्लिक प्रतिक्रिया के साथ आगे बढ़ने के लिए महत्वपूर्ण है, कोशिकाओं 4 में 1 घंटे के लिए रखा जाता है तो शाही सेना प्रतिदीप्ति संकेत का नुकसान पहले से ही देखा जा सकता डिग्री सेल्सियस . इसी तरह, प्रति अगरएक समय बेशक प्रयोग गठन, लेबल के लिए निश्चित होना तय है, और एक ही समय में सभी नमूने दाग.

2. लेबल आरएनए का पता लगाने के लिए रिएक्शन क्लिक करें

  1. 1 मिलीलीटर पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100 जोड़कर कोशिकाओं Permeabilize. आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.

नोट: चरणों में प्रयोग किया जाता है सभी समाधान 2.1-2.3 nuclease मुफ्त करने की आवश्यकता है.

  1. अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ तीन बार धोएं.
  2. नम कक्ष में 12 अच्छी तरह से थाली और हस्तांतरण से coverslips निकालें. प्रत्येक: 100 μl क्लिक धुंधला समाधान (100 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड 100 मिमी Tris पीएच 8.5, 1 मिमी CuSO 4, 20 माइक्रोन फ्लोरोसेंट azide [590/617 एनएम उत्तेजना / उत्सर्जन अधिकतम]) - 50 के साथ प्रत्येक coverslip कवर. अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.

नोट: प्लास्टिक आयल फिल्म के साथ एक 10 सेमी व्यास के साथ नम कक्ष, लाइन एक सेल संस्कृति या पेट्री डिश के नीचे इकट्ठा करने के लिए. डी के किनारे के अंदर रेखानम कागज तौलिये के साथ श. प्लास्टिक आयल फिल्म पर coverslips रखें.

नोट: coverslips के इस या प्रोटोकॉल में किसी भी दूसरे चरण के दौरान सूखे से बाहर नहीं जाने के लिए सावधान रहें. यह नम कक्ष में रखा गया है सीधे के बाद प्रत्येक coverslip को धुंधला समाधान जोड़ने के लिए सबसे अच्छा है.

नोट: इस चरण के लिए तुरंत पहले ताजा क्लिक धुंधला समाधान तैयार है. 1.5 एम Tris 8.5 पीएच, 100 मिमी CuSO 4, और 500 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड का स्टॉक समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है हालांकि, पीला कर दिया गया है कि किसी भी एस्कॉर्बिक एसिड शेयर समाधान त्यागें.

नोट: आपके फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर फिल्टर मैच एक फ्लोरोफोरे का चयन करना सुनिश्चित करें.

  1. एक ताजा 12 अच्छी तरह से थाली में नम कक्ष और जगह से coverslips निकालें और अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ तीन बार धो लो.

नोट: कोई डे हैंवायरल प्रोटीन की tection, वांछित है coverslips रखा जा सकता है और इस चरण (3.3 कदम आगे बढ़ना) के बाद imaged.

3. वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए immunofluorescence

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से अवरुद्ध बफर के 1 मिलीलीटर (3% (w / v) गोजातीय में (बीएसए) albumin सीरम पीबीएस) जोड़ें और अंधेरे में आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  2. उमस भरे कक्ष में, 12 अच्छी तरह से थाली से हस्तांतरण coverslips निकालें और 50 के साथ कवर - बफर (1:500) अवरुद्ध में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 μl (विरोधी RVFV, डॉ. आरबी Tesh से एक तरह का उपहार, UTMB). अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.

नोट: एक अलग वायरस के साथ प्रयोग के लिए इस प्रोटोकॉल आदत डाल करते हैं, तो पहले अपनी प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने का निर्धारण.

नोट: वैकल्पिक रूप से, इस कदम के अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन किया जा सकता है.

  1. 12 अच्छी तरह से थाली में वापस नम कक्ष और जगह से coverslips निकालें और धोनेतीन 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ बार प्रति अच्छी तरह से.
  2. 50 के साथ नम कक्ष और कवर में 12 अच्छी तरह से जगह जगह से coverslips निकालें - माध्यमिक एंटीबॉडी के 100 μl (विरोधी माउस आईजीजी फ्लोरोसेंट डाई [/ उत्तेजना उत्सर्जन अधिकतम: 495/519 एनएम] संयुग्मित) (1 अवरुद्ध बफर में पतला: 500). अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.

नोट: आपके प्राथमिक एंटीबॉडी पहचान और अपने फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर फिल्टर से मेल खाता है सकते हैं कि एक माध्यमिक एंटीबॉडी का चयन करना सुनिश्चित करें.

नोट: अगर वांछित, 200 एनजी / एमएल DAPI के नाभिक कल्पना करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के लिए जोड़ा जा सकता है.

  1. वापस 12 अच्छी तरह से थाली में नम कक्ष और जगह से coverslips निकालें और अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ तीन बार धो लो.
  2. एक खुर्दबीन स्लाइड पर Fluoromount जी की एक बूंद (सीए. 15 μl) रखकर coverslips के माउंट. एच 2 ओ में coverslip डुबकी, वें छूकर अतिरिक्त एच 2 ओ हटानेFluoromount जी के ड्रॉप में नीचे एक कागज तौलिया, और जगह सेल पक्ष के खिलाफ ई पक्ष. 5 मिनट के लिए शुष्क हवा.

नोट: एक औंधा माइक्रोस्कोप पर इमेजिंग, तो Fluoromount जी 4 में जमना करने की अनुमति ° खुर्दबीन स्लाइड पर सीओ / एन या प्रत्यय coverslips के पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ बढ़त सील द्वारा.

नोट: एक सप्ताह के लिए स्लाइड तुरंत imaged या अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.

4. डेटा का अधिग्रहण

  1. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि.

नोट: आपके माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कल्पना की जा सकती है, जो उचित fluorophores का चयन करना सुनिश्चित करें. संदर्भ के लिए, निम्नलिखित इस प्रकाशन में दिखाया छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल fluorophores और फिल्टर सेट कर रहे हैं.

DAPI:
उत्तेजना फिल्टर: बीपी 330-385
दो रंगवाला दर्पण: डीएम 400
उत्सर्जन फिल्टर: एल.पी. 420

उत्तेजना फिल्टर: बीपी 460-490
दो रंगवाला दर्पण: डीएम 505
उत्सर्जन फिल्टर: एल.पी. 510

590/617 के एक उत्तेजना / उत्सर्जन अधिकतम fluorophore:
उत्तेजना फिल्टर: बीपी 545-580
दो रंगवाला दर्पण: डीएम 600
उत्सर्जन फिल्टर: एल.पी. 610

प्रवाह cytometry द्वारा ट्रांसक्रिप्शन का विश्लेषण

5. सांसद -12 और यूरोपीय संघ के साथ लेबल नवजात शाही सेना के साथ कोशिकाओं को संक्रमित

  1. विकास मध्यम (DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 ग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त) में 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में बीज 293 कोशिकाओं. 100% confluency - 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 कोशिकाओं 80 पर पहुंच गया है जब तक एक humidified इनक्यूबेटर में सेते हैं.
  2. 3 के MOI में सांसद -12 के साथ कोशिकाओं को संक्रमित. कम से कम दो असंक्रमित कुओं में शामिल हैं: दो कुओं में से एक असंक्रमित नियंत्रण के रूप में काम करेगा, दूसरे चरण में ActD साथ इलाज किया जाएगा5.4. मध्यम विकास निकालें और कुल मात्रा प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा ताकि वायरस शेयर पतला 400 μl है. 37 पर एक humidified इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
  3. Inoculum निकालें और 2 मिलीलीटर ताजा मध्यम विकास के प्रति अच्छी तरह से जोड़ें. 12 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.

नोट: एक और वायरस के साथ प्रयोग के लिए इस प्रोटोकॉल आदत डाल, तो यह लेबलिंग और कटाई के लिए इष्टतम समय बिंदु निर्धारित करने के लिए एक समय बेशक प्रयोग करने की सलाह दी जाती है. संक्रमण बार कंपित कर रहे हैं और सभी नमूनों काटा, लेबल, और एक ही समय में दाग जा सकता है कि इस बार पाठ्यक्रम की स्थापना की.

  1. 12 HPI में 0.5 मिमी यूरोपीय संघ से युक्त मध्यम से मध्यम विकास की जगह. नकली संक्रमित कुओं में से एक के लिए, यह भी 5 ग्राम / एमएल ActD जोड़ें. ActD डीएनए पर निर्भर शाही सेना संश्लेषण को रोकता है, क्योंकि यह ट्रांसक्रिप्शनल दमन के लिए नियंत्रण के रूप में काम करेगा. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें.
  2. 13 HPI में, बुद्धि एक बार कोशिकाओं को धोनेकोशिकाओं के trypsinization द्वारा ज पीबीएस और फसल. पीबीएस 1 मिमी EDTA (पीबीएस EDTA) युक्त के साथ काटा कोशिकाओं तीन बार धोएं.

नोट: यह और बाद के चरणों के दौरान 500 से अधिक तेजी से कोशिकाओं अपकेंद्रित्र नहीं है - 1,000 XG सेल टूटना को रोकने के लिए. 1 के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र - तलछट के लिए 2 मिनट.

नोट: एक सतह immunostaining के बजाय एक रबर पुलिसकर्मी या डिस्पोजेबल सेल खुरचनी का उपयोग कर क्लिक करें प्रतिक्रिया, फसल का पालन की योजना बनाई है.

  1. आरटी पर 30 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​और सेते के 1 मिलीलीटर में उन्हें resuspending द्वारा कोशिकाओं को ठीक करें. 4% पीएफए ​​तैयार करने के बारे में निर्देश के लिए 1.6 कदम को देखें.
  2. अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर पीबीएस EDTA के साथ एक बार धोएं. 6 कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ें.

नोट: समय की लंबी अवधि के लिए इस स्तर पर रखा अगर आरएनए घिनौना रूप में यह तुरंत क्लिक प्रतिक्रिया के साथ आगे बढ़ने के लिए महत्वपूर्ण है. इसी तरह, एक समय ग प्रदर्शन अगरourse प्रयोग, एक ही समय में सभी नमूने, लेबल ठीक करने और दाग कर लें.

6. लेबल आरएनए का पता लगाने के लिए रिएक्शन क्लिक करें

  1. पीबीएस में 0.2% ट्राइटन X-100 के 0.5 मिलीलीटर में resuspending द्वारा कोशिकाओं Permeabilize. आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.

नोट: चरणों में प्रयोग किया जाता है सभी समाधान 6.1-6.3 nuclease मुफ्त करने की आवश्यकता है.

नोट: कोशिकाओं के इस कदम के दौरान तलछट ठीक से नहीं करते हैं, तो 5 मिनट के लिए centrifugation के समय में वृद्धि. अवसादन व्यवहार एक बार कोशिकाओं FACS बफर (कदम 6.4) में निलंबित कर रहे हैं सुधार होगा.

  1. 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ एक बार धोएं.

नोट: इस घन 2 + आयनों क्लिक करें प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक नखरिन होगा इस कदम के रूप में EDTA का उपयोग न करें.

  1. 200 μl क्लिक धुंधला समाधान में Resuspend कोशिकाओं (100 मिमी Tris पीएच 8.5, 1 मिमी CuSO 4, फ्लोरोसेंट डाई [exc के साथ लेबल 200nm azideitation / उत्सर्जन अधिकतम: 650/665 एनएम], 100 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड). अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.

नोट: इस चरण के लिए तुरंत पहले ताजा क्लिक धुंधला समाधान तैयार है. 1.5 एम Tris 8.5 पीएच, 100 मिमी CuSO 4, और 500 मिमी एस्कॉर्बिक एसिड का स्टॉक समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है हालांकि, पीला कर दिया गया है कि किसी भी एस्कॉर्बिक एसिड शेयर समाधान त्यागें.

नोट: इस चरण के दौरान एक साथ कोशिकाओं पेड़ों का झुरमुट, तो कई बार ऊपर नीचे pipetting और द्वारा resuspend.

नोट: अपने प्रवाह cytometer से पता लगाया जा सकता है कि एक fluorophore का चयन करना सुनिश्चित करें.

नोट: इसके अलावा क्लिक धुंधला प्रक्रिया के अधीन नहीं हैं जो संक्रमित कोशिकाओं का एक नमूना तैयार करना, इन प्रवाह cytometer की जांच के लिए आवश्यक हो जाएगा. या तो संक्रमित कोशिकाओं के आधे का उपयोग करें या कदम 5.2 में अच्छी तरह से संक्रमित एक अतिरिक्त शामिल हैं. ये चोरtrol कोशिकाओं कदम 7.1 पर immunostained किया जाएगा.

  1. FACS बफर (पीबीएस 1 मिमी EDTA और 0.5% (w / v) BSA युक्त) के साथ दो बार धोएं.

नोट: वायरल प्रोटीन की कोई immunostaining के वांछित है, कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा सकता है तुरंत (8 कदम आगे बढ़ना).

7. वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए immunofluorescence

  1. प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 μl में Resuspend कोशिकाओं (विरोधी RVFV) FACS बफर (1:10,000) में पतला और अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.

नोट: वैकल्पिक रूप से, इस कदम के अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन किया जा सकता है.

नोट: इसके अलावा क्लिक धुंधला प्रक्रिया के अधीन थे लेकिन immunostained नहीं किया जाएगा जो असंक्रमित कोशिकाओं का एक नमूना तैयार करना, इन प्रवाह cytometer की जांच के लिए आवश्यक हो जाएगा. या तो नकली संक्रमित कोशिकाओं के प्रयोग आधे या एक अतिरिक्त असंक्रमित अच्छी तरह से में शामिल5.2 कदम.

नोट: एक अलग वायरस के साथ प्रयोग के लिए इस प्रोटोकॉल आदत डाल करते हैं, तो पहले अपनी प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने का निर्धारण.

  1. FACS बफर में कोशिकाओं को दो बार धोएं.
  2. माध्यमिक एंटीबॉडी के 200 μl में Resuspend कोशिकाओं (विरोधी माउस आईजीजी फ्लोरोसेंट डाई [/ उत्तेजना उत्सर्जन अधिकतम: 495/519 एनएम] संयुग्मित) FACS बफर (1:1,000) में पतला और अंधेरे में आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  3. FACS बफर में एक बार कोशिकाओं को धो लें.

नोट: इस बिंदु पर, कोशिकाओं को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन संग्रहित किया जा सकता है.

8. डेटा का अधिग्रहण

  1. 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूबों में 500 μl FACS बफर, स्थानांतरण में कोशिकाओं Resuspend और एक प्रवाह cytometer का उपयोग करने का विश्लेषण. साधन जांचना सांसद -12 संक्रमित कोशिकाओं (केवल कोई क्लिक करें प्रतिक्रिया, विरोधी RVFV धुंधला) और नकली संक्रमित कोशिकाओं (केवल प्रतिक्रिया क्लिक करें) का उपयोग करें.

नहींई: अपने साधन से पता लगाया जा सकता है, जो उचित fluorophores का चयन करना सुनिश्चित करें. संदर्भ के लिए, निम्नलिखित इस प्रकाशन में दिखाया गया डेटा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया लेजर लाइनों और फिल्टर सेट कर रहे हैं.

495/519 के एक उत्तेजना / उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के साथ fluorophore:
लेजर: 488 एनएम
फिल्टर: 530/30

650/665 के एक उत्तेजना / उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के साथ fluorophore:
लेजर: 640 एनएम
फिल्टर: 670/20

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Representative Results

RVFV के एनएसएस के प्रोटीन (परिवार Bunyaviridae, जीनस Phlebovirus) 11 दो अलग तंत्र के माध्यम से मेजबान सेल सामान्य प्रतिलेखन रोकता है: (i) sequestering द्वारा p62 के proteasomal गिरावट को बढ़ावा देने के द्वारा बेसल प्रतिलेखन कारक TFIIH 11 और (ii) के P44 सबयूनिट TFIIH 6 की सबयूनिट. सांसद -12 तनाव एक जैव सुरक्षा स्तर 2 प्रयोगशाला में नियंत्रित किया जा सकता है और अन्य जंगली लागू होता है, जो अमेरिका में चुनिंदा एजेंट नियम से बाहर रखा गया है क्योंकि RVFV सांसद 12 टीका तनाव 13 इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है RVFV उपभेदों लिखें. सांसद 12 तनाव की एनएसएस प्रोटीन पूरी तरह कार्यात्मक है और मेजबान प्रतिलेखन 6 को दबाने की क्षमता रखता है. एनएसएस जीन 14 से 69% को शामिल विलोपन किया जाता है जो वायरस rMP12-C13type, मेजबान सेल प्रतिलेखन को दबाने की क्षमता सहित सभी एनएसएस कार्यों, कमी नियंत्रण वायरस के रूप में शामिल किया गया है.

चित्रा 1 प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत छवियों से पता चलता है. नकली संक्रमित कोशिकाओं में (आंकड़े 1a-1 माह), नाभिक दिखाई चल प्रतिलेखन के कारण लाल उज्ज्वल. कोशिकाओं केवल तत्काल निर्धारण द्वारा पीछा 1 घंटा, के लिए यूरोपीय संघ के साथ चिह्नित किया गया है, के बाद से सबसे RNAs के नाभिक में रहते हैं. इसके विपरीत, कोशिकाओं औषधीय प्रतिलेखन (आंकड़े 1e-1) को बाधित करने ActD के साथ इलाज किया गया है, जब नाभिक लाल प्रतिदीप्ति स्पष्ट रूप से कम है. कोशिकाओं सांसद -12 (आंकड़े 1n-1q), लेकिन नहीं एनएसएस विलोपन उत्परिवर्ती rMP12-C13type (आंकड़े 1i-1) के साथ से संक्रमित हैं जब यह प्रतिदीप्ति इसी तरह कम हो जाता है. चित्रा 2 भी कोशिकाओं यहाँ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत छवियों से पता चलता है, लेकिन जीवित वायरस के बजाय संक्रमण के इन विट्रो में संश्लेषित mRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है. कोशिकाओं mRNA एन्कोडिंग GFP (आंकड़े 2g-2i), ट्रांस में कोई परिवर्तन नहीं के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे जबcriptional गतिविधि untransfected कोशिकाओं (आंकड़े 2a-2c) की तुलना में, के रूप में नाभिक में लाल प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना, पता लगाया जा सकता है. में RVFV विषैलापन कारक एनएसएस (आंकड़े 2k-2) परिणाम mRNA एन्कोडिंग के साथ ही अभिकर्मक लाल प्रतिदीप्ति कमी हुई.

चित्रा 3A प्रवाह cytometry द्वारा प्राप्त मात्रात्मक डेटा को दर्शाया गया है. डेटा एक्स अक्ष पर प्लॉट विरोधी RVFV धुंधला के लिए y-अक्ष पर और उस साजिश रची नवजात शाही सेना में यूरोपीय संघ के समावेश के लिए फ्लोरोसेंट संकेत के साथ स्कैटर भूखंडों के रूप में प्रतिनिधित्व किया है. चतुर्थ भाग द्वार नकली संक्रमित कोशिकाओं के बहुमत के ऊपरी बाएँ चक्र में स्थित था कि इतना तय किए गए थे, ActD इलाज किया कोशिकाओं के बहुमत के निचले बाएँ चक्र में स्थित था, और संक्रमित कोशिकाओं के बहुमत साजिश के ठीक आधे में स्थित था . कोशिकाओं सांसद -12 से संक्रमित थे, कुल कोशिकाओं का 81.5%, या विरोधी RVFV सकारात्मक कोशिकाओं के 93%, कम transcriptional गतिविधि देखी गई. इसके विपरीत, wheएन कोशिकाओं rMP12-C13type से संक्रमित थे, कुल कोशिकाओं का 91.6%, या विरोधी RVFV सकारात्मक कोशिकाओं के 97%, नकली संक्रमित कोशिकाओं के बराबर था जो transcriptional गतिविधि देखी गई. चित्रा 3B रूप में चित्रा 3 ए के रूप में एक ही डेटा को दर्शाया गया है यूरोपीय संघ के समावेश के साथ लेबलिंग प्रतिदीप्ति शाही सेना के लिए एक हिस्टोग्राम की.

चित्रा 1
चित्रा 1. सांसद -12 और rMP12-C13type. 293 कोशिकाओं से संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी संक्रमित या सांसद 12 या एनएसएस विलोपन उत्परिवर्ती आरएमपी-12-C13type या तो से संक्रमित नकली थे. 15 और 16 HPI बीच, कोशिकाओं 1 मिमी यूरोपीय संघ के साथ लेबल रहे थे. ट्रांसक्रिप्शनल दमन के लिए एक नियंत्रण के रूप में, नकली संक्रमित कोशिकाओं 5 मिलीग्राम / एमएल यूरोपीय संघ के उपचार के साथ समवर्ती ActD साथ इलाज किया गया. नाभिक DAPI धुंधला (नीला), वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति विरोधी RVFV एंटीबॉडी (हरा) के साथ धुंधला हो जाना द्वारा कल्पना है, और शाही सेना के माध्यम से कल्पना कर रहे हैं कल्पना है(लाल): फ्लोरोसेंट डाई (590/617 एनएम उत्तेजना / उत्सर्जन अधिकतम) के साथ लेबल azide के साथ शामिल यूरोपीय संघ का पता लगाने के द्वारा घ.

चित्रा 2
चित्रा 2. कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 293 कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट नकली थे. GFP या सांसद 12 एनएसएस के लिए या तो इन विट्रो संश्लेषित शाही सेना के साथ ट्रांसफ़ेक्ट, या शाही सेना GFP या सांसद 12 एनएसएस या तो के लिए कोडिंग संश्लेषित में इन विट्रो साथ ट्रांसफ़ेक्ट. 15 और 16 घंटा posttransfection बीच, कोशिकाओं 1 मिमी यूरोपीय संघ के साथ लेबल रहे थे. ट्रांसक्रिप्शनल दमन के लिए एक नियंत्रण के रूप में, नकली ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं 5 मिलीग्राम / एमएल यूरोपीय संघ के उपचार के साथ समवर्ती ActD साथ इलाज किया गया. GFP की अभिव्यक्ति एक विरोधी GFP एंटीबॉडी (सैनिक) के साथ धुंधला हो जाना द्वारा कल्पना है, एनएसएस की अभिव्यक्ति फ्लोरोसेंट डाई (/ उत्तेजना उत्सर्जन को संयुग्मित विरोधी माउस आईजीजी द्वारा पीछा (वायुसेना, किमी) विरोधी RVFV एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना द्वारा कल्पना है maximuमी: 590/617 एनएम) (लाल): 495/519 एनएम) (हरा), और शाही सेना फ्लोरोसेंट डाई (/ उत्तेजना उत्सर्जन अधिकतम के साथ लेबल azide के साथ शामिल यूरोपीय संघ का पता लगाने के द्वारा कल्पना है.

चित्रा 3
चित्रा 3. सांसद 12 या rMP12-C13type से संक्रमित कोशिकाओं की (ए) प्रवाह cytometric विश्लेषण. कोशिकाओं को संक्रमित, या सांसद 12 या rMP12-C13type या तो से संक्रमित नकली थे. 12 और 13 HPI बीच, कोशिकाओं 0.5 मिमी यूरोपीय संघ के साथ लेबल रहे थे. ट्रांसक्रिप्शनल दमन के लिए एक नियंत्रण के रूप में, नकली ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं यूरोपीय संघ के उपचार के साथ समवर्ती ActD 5 ग्राम / मिलीलीटर के साथ इलाज किया गया. (विरोधी RVFV) और आरएनए azide के साथ शामिल यूरोपीय संघ का पता लगाने के द्वारा कल्पना है: वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति फ्लोरोसेंट डाई (495/519 एनएम उत्तेजना / उत्सर्जन अधिकतम) के साथ लेबल एक माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा विरोधी RVFV एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना द्वारा कल्पना है (आरएनए): फ्लोरोसेंट डाई (650/665 एनएम उत्तेजना / उत्सर्जन अधिकतम) के साथ लेबल. उसएक एक तितर बितर साजिश के रूप में प्रतिनिधित्व किया है. (बी) एक ही डेटा का प्रतिनिधित्व एक हिस्टोग्राम के रूप में एक में दिखाया गया है. यूरोपीय संघ के समावेश के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता एक्स अक्ष पर प्लॉट किए जाते है, कोशिकाओं की गिनती y-अक्ष पर प्लॉट किए जाते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

प्रदान की प्रोटोकॉल नवजात शाही सेना में uridine अनुरूप यूरोपीय संघ के समावेश के माध्यम से मेजबान सेल प्रतिलेखन पर वायरल संक्रमण के प्रभाव को मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. यह तेजी से संवेदनशील है, और यह रेडियोधर्मी आइसोटोप के उपयोग पर निर्भर नहीं करता है: इस विधि पिछले तरीकों पर कई फायदे हैं. इसके अलावा, विधि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या अनिवार्य रूप से एक ही अभिकर्मकों का उपयोग कर प्रवाह के माध्यम से मात्रात्मक डेटा के माध्यम से गुणात्मक डेटा उपज के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. वायरल एंटीजन के लिए immunofluorescence धुंधला के साथ संयुक्त, इस विधि भी शोधकर्ता असंक्रमित कोशिकाओं से संक्रमित अंतर करने के लिए अनुमति देता है.

यह मेजबान टेप, 3 एच uridine या ब्रू समावेश पर निर्भर अन्य तरीकों के साथ साझा किया जाता है जो एक दोष यह है कि लेबल के रूप में इस विधि को भी उसी दर पर नए संश्लेषित विषाणु आरएनए लेबल यह नोट करना महत्वपूर्ण है. RVFV सांसद 12 संक्रमण के मामले में कम से कम, फिर भी, हमने पाया है कि एमोअब तक का मेजबान टेप के unt के वायरल टेप की राशि outweighs, और इस प्रकार इस परख द्वारा मापा कुल शाही सेना पर वायरल शाही सेना का प्रभाव नगण्य है. एक और वायरस के साथ प्रयोग के लिए इस प्रोटोकॉल आदत डाल, शोधकर्ताओं ActD साथ संक्रमित कोशिकाओं के इलाज के माध्यम से, उनके स्थानीयकरण के माध्यम से या तो वायरल टेप की पहचान करना चाहते हैं, या फ्लोरोसेंट में स्वस्थानी संकरण (मछली) 15 है, हालांकि हो सकता है. वायरस ऐसे सांसद के रूप में 12 कोशिका द्रव्य में replicates, तो वायरल शाही सेना आसानी से अभी भी ज्यादातर लेबलिंग के 1 घंटे बाद नाभिक में निहित है जो सेलुलर शाही सेना से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. संक्रमित कोशिकाओं को भी वायरल शाही सेना संश्लेषण अप्रभावित छोड़ने जबकि मेजबान सेल प्रतिलेखन को दबाने के लिए ActD के साथ इलाज किया जा सकता है. डबल असहाय डीएनए 16 के लिए बाध्य है और इसलिए द्वारा ActD कार्यों केवल डीएनए निर्भर प्रतिलेखन रोकता है लेकिन वायरल शाही सेना पर निर्भर शाही सेना पीसीआर पर कोई प्रभाव नहीं है.

इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते हैं, तो इसे से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैयूरोपीय संघ के लेबल शाही सेना के रूप में permeabilization और क्लिक लेबलिंग प्रतिक्रिया के बीच न्युक्लिअसिज़, साथ संदूषण RNases 3 से गिरावट के प्रति संवेदनशील बना हुआ है. इसके अलावा, शोधकर्ताओं निर्धारण के बीच लंबे समय तक ऊष्मायन बार के रूप में, क्लिक लेबलिंग प्रतिक्रिया के लिए तुरंत आगे बढ़ना है और डिग्री सेल्सियस, आरएनए प्रतिदीप्ति संकेत का नुकसान में परिणाम अंततः शाही सेना की गिरावट के लिए नेतृत्व और भी 4 बजे, प्रतिक्रिया लेबलिंग क्लिक करना चाहिए. समय पाठ्यक्रम प्रयोगों प्रदर्शन जब यह विशेष चिंता का विषय है, शोधकर्ताओं ने सभी कक्षों, लेबल तय की, और एक ही समय में दाग जा सकता है ताकि उनके प्रयोगों डिजाइन चाहिए. सौभाग्य से, आरएनए प्रतिदीप्ति संकेत क्लिक लेबलिंग प्रतिक्रिया के बाद स्थिर बनी हुई है, इसलिए प्रोटोकॉल आसानी से इस कदम के बाद बंद कर दिया जा सकता है.

अंत में, शोधकर्ताओं कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव (सीपीई) नकारात्मक किसी भी विशिष्ट ट्रांसक्रिप्शनल दमन के अभाव में भी सेलुलर शाही सेना संश्लेषण को प्रभावित करता है कई वायरस के कारण होता है कि मन में रखने की जरूरत है. यहकोशिकाओं को अभी भी सक्षम हैं जब एक समय के बाद संक्रमण पर transcriptional गतिविधि को मापने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है. एक उत्परिवर्ती वायरस ऐसे आरएमपी-12-C13type (आंकड़े 1 और 3) के रूप में प्रतिलेखन, दबाने की क्षमता का अभाव है जो उपलब्ध है, तो इस प्रतिलेखन मापने के लिए इष्टतम समय बिंदु निर्धारित करने में एक महान उपकरण हो सकता है.

प्रयोगों की एक बड़ी संख्या की योजना बना, शोधकर्ताओं जिससे एक माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए आवश्यकता को नष्ट करने और वायरल एंटीजन का पता लगाने के लिए आवश्यक समय को कम करने, एक fluorochrome 17 के साथ उनकी प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रत्यक्ष लेबलिंग पर विचार करना चाहते हो सकता है.

सारांश में, इस प्रोटोकॉल मेजबान सेल प्रतिलेखन पर वायरल संक्रमण के प्रभाव को मापने के लिए एक तेजी से और विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है. यह आसानी से विभिन्न वायरस के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित और विशिष्ट वायरल या सेलुलर प्रोटीन के लिए immunostainings शामिल करने के लिए संशोधित करने की क्षमता है किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम माउस पॉलीक्लोनल विरोधी RVFV सीरमरोधी और प्रवाह के साथ मदद के लिए UTMB फ्लो कोर सुविधा के एम. ग्रिफिन प्रदान करने के लिए आरबी Tesh धन्यवाद. इस काम UTMB.OL पर जेम्स डब्ल्यू McLaughlin फैलोशिप कोष समर्थित किया गया था द्वारा समर्थित UTMB.BK में टीके के विकास के लिए Sealy केंद्र से पश्चिमी क्षेत्रीय उत्कृष्टता के केंद्र, एनआईएच अनुदान R01 AI08764301, और धन के माध्यम से 5 U54 AI057156 द्वारा समर्थित किया गया एक मौरिस आर Hilleman अर्ली स्टेज कैरियर अन्वेषक पुरस्कार से.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-ethynyl-uridine Berry Associates PY 7563 dissolve in DMSO for 100 mM stock
12-mm round coverslips Fisherbrand 12-545-82
5 ml polystyrene tubes BD Biosciences 352058
Actinomycin D (ActD) Sigma 9415 dissolve in DMSO for 10 mM stock
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Invitrogen A-11029
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz sc-2323
CuSO4 Sigma C-8027 dissolve in H2O for 100 mM stock
DAPI Sigma D-9542 dissolve in H2O for 5 mg/ml stock
DMEM Invitrogen 11965092
FBS Invitrogen 16000044
fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) Invitrogen A10270
fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) Invitrogen A10277
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
L-ascorbic acid Sigma A-5960 dissolve in H2O for 500 mM
paper filter VWRbrand 28333-087
paraformaldehyde Sigma 158127
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000) Sigma P1274
Triton X-100 Sigma T-8787
Trizma base Sigma T-1503 dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5
Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056
Fluorescence Microscope e.g. Olympus IX71
Flow Cytometer e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa

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References

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Kalveram, B., Lihoradova, O., Indran, S. V., Head, J. A., Ikegami, T. Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis. J. Vis. Exp. (78), e50809, doi:10.3791/50809 (2013).

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