Summary
이 방법은 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV) 변형 MP-12와 감염 후 숙주 세포의 전사의 변화를 측정하는 클릭 화학의 사용을 설명합니다. 결과는 형광 현미경을 통해 질적 시각 또는 유동 세포 계측법을 통해 정량적으로 얻을 수 있습니다. 이 방법은 다른 바이러스와 함께 사용하기위한 적응이다.
Abstract
많은 RNA 바이러스는 세포의 방어를 회피하는 수단으로 숙주 세포의 전사를 억제하는 능력을 진화했다. 이러한 바이러스의 연구에 감염된 세포에서 전사 활성을 측정하는 신속하고 신뢰할 수있는 방법을 가지고하는 것이 중요합니다. 전통적으로, 전사는 H-딘 같은 면역 염색을 통해 감지 한 다음 5 bromouridine (BRU) 등 할로겐 딘 유사체의 autoradiography를 또는 섬광 계수 또는 법인을 통해 탐지 다음과 같은 3 등 방사성 클레오의 내장으로도 측정되었습니다. BRU의 검출이 번거로울 수 있습니다 낮은 감도에서 고통 수도 있지만 방사성 동위 원소의 사용은, 그러나, 특수 장비가 필요하며 실험실 설정의 숫자에 적합하지 않습니다.
아 지드와 알킨에서 구리 촉매 트리아 졸의 형성을 포함 최근에 개발 클릭 화학은 이제 신속하고 highl를 제공합니다이 두 가지 방법에 대한 예 민감 대안입니다. 클릭 화학은 초기 RNA가 먼저 형광 지드와 라벨의 검출에 이어 딘 아날로그 5 ethynyluridine (EU)의 결합에 의해 표시되는 두 단계 프로세스입니다. 이러한 지드 시각화 옵션의 넓은 범위를 허용, 여러 가지 형광체로 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 긴장 MP-12 클릭 화학을 사용하여 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV)에 감염된 세포에서 전사 억제를 측정하는 방법을 설명합니다. 동시에,이 세포에 바이러스 성 단백질의 발현은 고전적인 세포 면역 염색에 의해 결정됩니다. 8 세부 유동 세포 계측법을 통해 전사 억제를 정량화하는 방법을 5 단계 동안, 4 세부 형광 현미경을 통해 전사 억제를 시각화하는 방법을 통해 1 단계를 반복합니다. 이 프로토콜은 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수있다.
Introduction
전통적으로 전사 활동은 방사성 (3 H-딘 1) 하나의 법인을 통해 측정 또는 초기 RNA로 (BRU) 2 클레오 할로겐되었습니다. 이 딘 유사체는 세포에 의해 촬영 클레오 회수 경로를 통해 딘 - 삼인산 (UTP)로 변환하고, 이후 새로 합성 된 RNA로 통합. 3 H-딘은 많은 시간이 소요될 수 있습니다 기록법, 또는 섬광에 의해 감지 될 수있다 전문 장비를 필요로하는 계산. 또한, 방사성 동위 원소의 사용은 높은 억제 생물 안전성 연구소 등의 실험실 설정의 숫자에 실용적이지 않을 수 있습니다. BRU는 RNA 이차 구조는 항체 바인딩에 대한 입체적 방해가 될 수도로 핵 또는 RNA의 부분적인 변성에 항체의 접근을 보장하기 위해 거친 permeabilization이 필요할 수 있습니다 안티 - BRU 항체로 면역 염색을 통해 감지 할 수 있습니다.
_content "> 여기에서 설명하는 프로토콜은 최근 RVFV 변형 MP-12에 감염된 세포에서 전사 활성을 측정하는 화학 3을 누릅니다 개발했다. 클릭 화학은 매우 선택적이 고 효율적인 구리 (I) 촉매 알킨 사이 사이클로 반응에 의존 활용 4,5 지드 부분은.이 프로토콜에 감염된 세포의 초기 RNA가 먼저 딘 아날로그 EU의 결합을 통해 표시되어 있습니다. 두 번째 단계에서는 통합 된 유럽 연합 (EU)이 형광 지드와 반응을 통해 검출된다.이 방법의 주요 장점은 있습니다 (1) 방사성 동위 원소의 사용을 필요로하지 않습니다 (2) 그 그것은 가혹한 permeabilization 또는 RNA의 변성을 필요로하지 않습니다. 부족에 의해 방해되지 않습니다 미만 50 다, 형광 지드의 액세스 분자량 클래스와 RNA의 검출을 결합 할 때 permeabilization 또는 RNA 이차 구조. 또한, 연구자들은 일차 항체의 자신의 선택에 국한되지 않습니다바이러스 성 단백질의 iCal 면역 염색.두 가지 방법이 프로토콜에 설명되어 있습니다 : 형광 현미경 (1-4 단계) 및 유동 세포 계측법 (5-8 단계)를 통해 전사를 정량화 하나를 통해 전사를 시각화 한. 두 방법 모두 셀 단위 기준으로 전사 활성과 바이러스 감염 사이의 상관 관계를 허용 바이러스 단백질에 대한 세포 면역 염색으로 초기 RNA의 라벨을 결합한다.
저자는 성공적 프로토콜 RVFV 변형 MP-12 6 토스카나 바이러스 (TOSV) 10에 감염된 다른 MP-12 돌연변이 7,8, 9, 세포와 감염된 세포에 감염된 세포에서 전사 활동을 결정하기 위해 여기에 설명 된 사용했습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 쉽게 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해 적응 특정 바이러스 또는 세포 단백질의 면역 형광 염색을 포함하도록 수정 될 가능성이있다 할 수 있습니다.
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Protocol
형광 현미경에 의한 전사 분석
1. MP-12와 EU 레이블을 초기 RNA와 세포를 감염
- 12 잘 조직 배양 플레이트에 장소는 12 mm 둥근 coverslips를 잘 당 하나의 coverslip을.
참고 : 세포가 우물에 배치하기 전에 문제의 coverslips을 준수, 폴리-L-라이신 (MW ≥ 70,000)와 코트가있는 경우. 이 목표로, 5 분 폴리-L-라이신의 H 2 O의 멸균 0.1 밀리그램 / ML 솔루션 잠수함의 coverslips. 최소한 2 시간 동안 멸균 H 2 O와 공기 건조에 coverslips를 씻어 내시오.
- coverslips는 위에 씨앗 293 세포에 잘 당 1 ML 성장 매체 (DMEM이 10 % 태아 소 혈청, 100 U / ML 페니실린 및 100 밀리그램 / ML 스트렙토 마이신을 포함)에 5 × 10 4 세포를 추가합니다. 37 가습 배양기에서 품어 ° C와 5 % CO 2 O / N.
- 3의 감염의 다중성 (모이)에서 MP-12와 세포를 감염. 포함 적어도 두 감염 우물 : 두 개의 우물 중 하나가 감염되지 않은 컨트롤과 같은 역할을하고, 다른 하나는 전사 억제를위한 제어와 같은 단계 1.5에서 actinomycin D (ACTD)로 처리됩니다. 성장 매체를 제거하고 바이러스 주식을 희석 그래서 전체 볼륨이 각각의 well에 추가 200 ML입니다. 37 가습 배양기에서 1 시간 동안 품어 ° C와 5 % CO 2.
주 : 대신에 세포를 감염 세포도 플라스미드 DNA로 형질 전환 또는 체외에서 특정 바이러스 성 단백질을 코딩 RNA를 합성 할 수있다. 이 목표로, 제조업체의 지침에 따라 해당 화학 물질의 transfection 시약으로 세포를 형질 16 시간 포스트 transfection을 1.5 단계로 진행합니다. 그것은 RNA 라벨 및 고정하기 전에 형질 전환 조건 및 배양 시간을 최적화하는 것이 좋습니다.
- 접종을 제거하고 잘 당 1 ML 신선한 성장 매체를 추가합니다. 15 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다.
- 15 시간 게시물 감염 (HPI)에서 1 mM의 유럽 연합 (EU)을 포함한 배지로 성장 매체를 교체하십시오. 모의 감염된 우물 하나에,도 5 ㎍ / ㎖의 ACTD를 추가합니다. ACTD는 DNA 의존 RNA 합성 억제로 이것은 전사 억제에 대한 제어 역할을합니다. 배양기에 세포를 반환합니다.
- 16 HPI에서 매체를 제거하고 1 ML PBS (KCl을 0.20 g / L, KH 2 PO 4 0.20 g / L, 염화나트륨 8.00 g / L, 나 2 HPO 4 1.15 g / L, 산도 7.4) 한 번 coverslips를 세척 잘 당. 물론 당 4 % 파라 포름 알데히드 1 ㎖ (PFA)를 추가하고 RT에서 30 분 동안 배양하여 세포를 고정합니다.
참고 : 4 % PFA 고정 솔루션을 준비하려면, ° C 가열 자석 교반기에서 60로 가열 150 ML H 2 O에 10g 파라 포름 알데히드를 분해. 1M NaOH를 500 μl를 추가하고 솔루션 명확해질 때까지 저어 계속합니다. 미립자를 제거하고 62.5 ML 인산 버퍼를 추가하는 필터 종이를 필터링 PFA 용액 (77 mM의의 NaH 2 PO 4, 287 MM 2 나 HPO 4, 산도 7.4). 250 ML의 총 볼륨에 H 2 O를 추가 할 수 있습니다. 단일 사용 분주에서 -20 ° C에서 동결.
- 물론 당 1 ML PBS로 한 번 씻으십시오. 더 배양 시간이 이후의 모든 세척 단계는 필요하지 않습니다. 2 단계로 바로 진행합니다.
참고 : 장시간이 단계에서 보관하면 RNA가 퇴화로 그것은 바로 클릭 반응을 진행하는 것이 중요합니다, 세포가 4시에 1 시간 동안 유지되는 경우 RNA 형광 신호의 손실은 이미 관찰 할 수 있습니다 ° C . 마찬가지로, 당 경우시간 경과 실험을 형성하면, 라벨 반드시 해결과 동시에 모든 샘플을 얼룩.
2. 레이블 RNA를 검출하는 반응을 누릅니다
- 1 ML PBS 0.2 % 트리톤 X-100을 첨가하여 세포를 Permeabilize. RT에서 10 분 동안 품어.
참고 : 단계에서 사용되는 모든 솔루션은 2.1-2.3는 핵산 무료로해야합니다.
- 물론 당 1 ML PBS로 3 회 세척한다.
- 습기 챔버로 12 - 웰 플레이트 및 전송에서의 coverslips를 제거합니다. 각 : 100 μL를 클릭 염색 용액 (100 mM의 아스 코르 빈산 100 MM 트리스 산도 8.5, 1 ㎜ CuSO 4, 20 μM 형광 지드 [617분의 590 nm의 여기 / 방출 최대]) - 50 각 coverslip을 커버. 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다.
참고 : 플라스틱 파라핀 필름 10 cm 직경과 습기 챔버, 선에게 세포 배양 또는 페트리 접시의 바닥을 조립. 디 에지의 내부를 줄젖은 종이 타월로 쉬. 플라스틱 파라핀 필름에 coverslips를 놓습니다.
참고 : coverslips를이 또는 프로토콜의 다른 단계에서 건조 않도록주의하십시오. 그것은이 습기 챔버에 배치 된 후에 바로 각 coverslip에에 얼룩 솔루션을 추가하는 것이 좋습니다.
참고 :이 단계 직전에 신선한 클릭 염색 솔루션을 준비합니다. 1.5 M 트리스 산도 8.5, 100 MM의 CuSO 4, 500 mM의 아스코르브 산의 주식 솔루션은 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 그러나 노란색되어 있다는 어떤 아스 코르 빈산 원액을 버린다.
참고 : 형광 현미경 필터와 일치하는 형광을 선택해야합니다.
- 신선한 12 웰 플레이트에 습기 챔버와 장소에서의 coverslips를 제거하고 잘 당 1 ML PBS로 3 회 세척한다.
참고 : 아무 드하는 경우바이러스 성 단백질의 방호가 필요한 coverslips를 마운트 될 수 있으며,이 단계 (3.3 단계로 진행) 후 군데.
3. 바이러스 성 단백질의 발현을 검출하는 면역
- 각각의 well에 차단 버퍼 1 ML (3 % (w / v)의 소에서 (BSA) 알부민 혈청 PBS)를 추가하고 어둠 속에서 실온에서 30 분간 배양한다.
- 습기 챔버에 12 - 웰 플레이트에서 전송 coverslips를 제거하고 50로 커버 - 버퍼 (1:500) 차단에 희석 일차 항체 100 μL (안티 RVFV 박사 RB Tesh에서 친절한 선물, UTMB). 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다.
참고 : 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해이 프로토콜을 채택 할 때, 먼저 일차 항체에 대한 최적의 희석을 결정합니다.
참고 : 또는,이 단계는 어둠 속에서 4 ° C에서 O / N를 수행 할 수 있습니다.
- 12 - 웰 플레이트에 다시 습기 챔버와 장소에서의 coverslips를 제거하고 세척세 1 ML PBS와 시간을 잘 당.
- 50와 습기 챔버 커버에 12 잘 곳 곳에서 coverslips를 제거 - 이차 항체 100 μL (항 - 마우스 IgG의 형광 염료 [여기 / 방출 최대 : 519분의 495 NM]을 결합) (1 버퍼를 차단에 희석 : 500). 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다.
참고 : 기본 항체를 인식하고 형광 현미경 필터와 일치 할 수있는 이차 항체를 선택해야합니다.
참고 : 원하는 경우, 200 NG / ML DAPI는 핵을 시각화하기 위해 차 항체 희석에 추가 할 수 있습니다.
- 다시 12 - 웰 플레이트에 습기 챔버와 장소에서의 coverslips를 제거하고 잘 당 1 ML PBS로 3 회 세척한다.
- 현미경 슬라이드에 Fluoromount-G 한 방울 (CA. 15 μL) 배치하여 coverslips를 장착합니다. H 2 O로 coverslip을 찍어, 일을 만져 초과 H 2 O를 제거Fluoromount-G의 드롭에 아래로 종이 타월, 장소 세포 측에 전자 쪽. 5 분 공기 건조.
참고 : 거꾸로 현미경 이미징 경우, Fluoromount-G 4에서 고화 할 수 있도록 ° 현미경 슬라이드 CO / N 또는 부착 coverslips를을 투명 매니큐어로 가장자리를 밀봉 있습니다.
참고 : 주까지에 대한 슬라이드를 즉시 군데 나 어두운 곳에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
4. 데이터의 취득
- 형광 현미경을 사용하여 이미지.
참고 : 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 적절한 형광을 선택해야합니다. 참고로, 다음은이 책에 표시된 이미지를 얻기 위해 사용되는 형광체 및 필터 세트입니다.
DAPI :
여기 필터 : BP 330-385
이색 거울 : DM 400
방출 필터 : LP 420
이색 거울 : DM 505
방출 필터 : LP 510
617분의 590의 여기 / 방출 최대 형광 :
여기 필터 : BP 545-580
이색 거울 : DM 600
방출 필터 : LP 610
유동 세포 계측법에 의해 전사 분석
5. MP-12와 EU 레이블을 초기 RNA와 세포를 감염
- 성장 배지 (DMEM이 10 % 태아 소 혈청, 100 U / ML 페니실린, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신을 포함) 6 - 잘 조직 배양 플레이트에 씨앗 293 세포를. 100 % confluency에 - 37 ° C와 5 % CO 2 세포가 80에 도달 할 때까지에 가습 배양기에서 배양한다.
- 모이 3시 MP-12와 세포를 감염. 적어도 두 개의 감염 우물과 같습니다 : 두 개의 우물 중 하나가 감염되지 않은 컨트롤로 제공됩니다, 다른 하나는 단계에서 ACTD으로 처리됩니다5.4. 성장 매체를 제거하고 전체 볼륨이 각각의 well에 첨가하도록 바이러스 주식을 희석하여 400 μL입니다. 37 가습 배양기에서 1 시간 동안 품어 ° C와 5 % CO 2.
- 접종을 제거하고 2 ㎖ 새로운 성장 매체를 잘 당 추가합니다. 12 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다.
참고 : 다른 바이러스와 함께 사용하기위한이 프로토콜을 적응 경우, 라벨 및 수확에 대한 최적의 시점을 결정하는 시간 코스 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 감염 시간은 엇갈리게하고 모든 샘플 수확, 표시, 동시에 염색 할 수 있도록이 시간 코스를 설정합니다.
- 12 HPI에서 0.5 mM의 유럽 연합 (EU)을 포함한 배지로 성장 매체를 교체하십시오. 모의 감염된 우물 하나에,도 5 ㎍ / ㎖의 ACTD를 추가합니다. ACTD는 DNA 의존 RNA 합성 억제로 이것은 전사 억제에 대한 제어 역할을합니다. 배양기에 세포를 반환합니다.
- 13 HPI에서 재치 번 세포를 씻으세포의 트립신에 의해 H PBS 및 수확. PBS가 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (PBS-EDTA)을 함유 수확 세포를 세 번 씻으십시오.
참고 :이 이후의 단계에서, 500보다 빠르게 세포를 원심 분리하지 마십시오 - 1,000 XG에 세포의 파손을 방지 할 수 있습니다. 1 세포를 원심 분리 - 침전 ~ 2 분.
참고 : 표면 면역 염색 대신 고무 경찰관 또는 일회용 세포 스크레이퍼를 사용하여 클릭 반응, 수확 따라 계획됩니다.
- RT에서 30 분 동안 4 % PFA과 부화 1 ㎖에 그들을 현탁하여 세포를 고정합니다. 4 % PFA를 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 1.6 단계를 참조하십시오.
- 물론 당 1 ML PBS-EDTA 한 번 씻으십시오. 6 단계로 바로 진행합니다.
참고 : 장시간이 단계에서 보관하면 RNA가 퇴화로 그것은 바로 클릭 반응을 진행하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 시간이 C를 수행하는 경우ourse를 실험은 동시에 모든 샘플에 레이블을 수정하고 얼룩해야합니다.
6. 레이블 RNA를 검출하는 반응을 누릅니다
- PBS 0.2 % 트리톤 X-100 0.5 ㎖에 현탁하여 세포를 Permeabilize. RT에서 10 분 동안 품어.
참고 : 단계에서 사용되는 모든 솔루션은 6.1-6.3는 핵산 무료로해야합니다.
참고 : 세포가이 단계에서 침전 제대로하지 않으면 5 분에 원심 분리 시간을 증가시킨다. 침전 동작은 한 번 세포는 FACS 버퍼 (단계 6.4)에서 일시 중지됩니다 향상됩니다.
- 1 ML PBS로 한 번 씻으십시오.
참고 :이 구리 2 + 이온을 클릭 반응에 필요한 킬레이트되므로이 단계에서 EDTA를 사용하지 마십시오.
- 200 μL를 클릭 염색 용액에 세포를 resuspend (100 MM 트리스 산도 8.5, 1 ㎜ CuSO 4, 형광 염료 [당일로 표시된 200 ㎚ 지드itation / 방출 최대 : 665분의 650 NM], 100 mM의 아스 코르 빈산). 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다.
참고 :이 단계 직전에 신선한 클릭 염색 솔루션을 준비합니다. 1.5 M 트리스 산도 8.5, 100 MM의 CuSO 4, 500 mM의 아스코르브 산의 주식 솔루션은 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 그러나 노란색되어 있다는 어떤 아스 코르 빈산 원액을 버린다.
참고 :이 단계에서 함께 세포 덩어리하면, 여러 번 위아래로 pipetting에 의해 resuspend을.
참고 : 흐름 cytometer에 의해 감지 할 수있는 형광을 선택해야합니다.
참고 : 또한 클릭 염색 절차에 노출되지 않습니다 감염된 세포의 하나의 샘플을 준비, 이러한 흐름 cytometer의 교정을 위해 필요합니다. 하나는 감염된 세포의 절반을 사용하거나 단계 5.2에서 잘 감염 추가적인 있습니다. 이 콘트롤 세포 단계 7.1에서 면역 염색 될 것입니다.
- FACS 버퍼 (PBS가 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 0.5 % (W / V) BSA를 포함)로 두 번 씻으십시오.
참고 : 바이러스 성 단백질에는 면역 염색이 요구하지 않으면, 세포를 분석 할 수있는 즉시 (8 단계로 진행).
7. 바이러스 성 단백질의 발현을 검출하는 면역
- 일차 항체 200 μL의 세포를 resuspend (안티 RVFV)는 FACS 버퍼 (1:10,000)에 희석과 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다.
참고 : 또는,이 단계는 어둠 속에서 4 ° C에서 O / N를 수행 할 수 있습니다.
참고 : 또한 클릭 염색 절차의 대상이되었지만 면역 염색되지 않습니다 감염되지 않은 세포의 하나의 샘플을 준비, 이러한 흐름 cytometer의 교정을 위해 필요합니다. 하나는 모의 감염된 세포의 절반을 사용하거나 추가 감염도에 포함5.2 단계.
참고 : 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해이 프로토콜을 채택 할 때, 먼저 일차 항체에 대한 최적의 희석을 결정합니다.
- FACS 버퍼에 두 번 세포를 씻으십시오.
- 이차 항체 200 μL의 세포를 resuspend (항 - 마우스 IgG의 형광 염료 [여기 / 방출 최대 : 519분의 495 NM]에 복합) FACS 버퍼 (1:1,000)로 희석하여 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양한다.
- FACS 버퍼에 한 번 세포를 씻으십시오.
참고 :이 시점에서, 세포가 어둠 속에서 4 ° C에서 O / N를 저장할 수 있습니다.
8. 데이터의 취득
- 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 500 ㎕의 FACS 버퍼 전송에 세포를 resuspend을하고 흐름 cytometer에를 사용하여 분석합니다. 기기를 보정하는 MP-12에 감염된 세포 (단지 아니요를 클릭 반응, 안티 RVFV 염색) 및 모의 감염된 세포를 (단지 반응을 클릭)를 사용합니다.
아니E : 악기에 의해 감지 될 수있다 적절한 형광을 선택해야합니다. 참고로, 다음은이 책에 표시된 데이터를 수집하는 데 사용되는 레이저 라인과 필터 세트입니다.
519분의 495의 여기 / 방출 스펙트럼 형광 :
레이저 : 488 nm의
필터 : 30분의 530
665분의 650의 여기 / 방출 스펙트럼 형광 :
레이저 : 640 nm의
필터 : 20분의 670
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Representative Results
RVFV의 NSS 단백질 (가족 Bunyaviridae, 속 Phlebovirus)는 11 두 가지 메커니즘을 통해 숙주 세포의 일반적인 전사를 억제 (I) 봉쇄에 의한 P62의 프로 테오 분해를 촉진하여 기저 전사 인자 TFIIH 11 (II)의 P44 소단위 TFIIH 6 소단위. MP-12 균주는 바이오 안전성 수준이 실험실에서 처리 될 수 있으며에 다른 야생 적용되는 미국의 선택 에이전트 규칙에서 제외되기 때문에 RVFV MP-12 백신 균주 13이 프로토콜에 설명 된 실험에 사용 된 RVFV 균주를 입력합니다. MP-12 균주의 NSS 단백질은 완전한 기능 및 호스트 전사 6를 억제 할 수있는 능력을 유지합니다. NSS 유전자 14의 69 %를 포괄 삭제를 운반하는 바이러스 rMP12 - C13type는, 숙주 세포의 전사를 억제하는 기능을 포함하여 모든 NSS 기능을 부족한 컨트롤 바이러스에 포함되어 있습니다.
그림 3A는 유동 세포 계측법에 의해 얻어진 정량적 데이터를 보여줍니다. 데이터를 X-축에 표시 방지 RVFV 염색에 대한 y 축에 해당 꾸몄다 초기 RNA에 EU 설립을위한 형광 신호 산포도로 표시됩니다. 상한의 문이 모의 감염된 세포의 대부분이 왼쪽 상단 사분면에 위치가되도록 설정 하였다 ACTD 치료 세포의 대부분은 왼쪽 하단 사분면에 위치하였으며, 감염된 세포의 대부분은 플롯의 오른쪽 절반에 위치했다 . 세포는 MP-12에 감염되었을 때, 전체 세포의 81.5 %, 또는 반대로 RVFV 양성 세포의 93 %가 감소 전사 활성을 나타내었다. 반면에 갔지N 세포가 rMP12 - C13type에 감염된 총 세포의 91.6 %, 또는 반대로 RVFV 양성 세포의 97 %, 모의 감염된 세포의 비교했다 전사 활성을 나타내었다. 그림 3b는 형태로 그림 3A와 동일한 데이터를 보여줍니다 EU 설립과 라벨 형광 RNA에 대한 히스토그램.
그림 1. MP-12 rMP12 - C13type. 293 세포에 감염된 세포의 형광 현미경은 감염된 또는 MP - 12 NSS 삭제 돌연변이 RMP-12-C13type 중 하나에 감염된 모의 하였다. 15 16 HPI 사이에, 세포는 1 ㎜ EU로 표시 하였다. 전사 억제를위한 컨트롤로, 모의 감염된 세포는 5 밀리그램 / ML은 EU 처리와 동시에 ACTD로 치료했다. 핵 DAPI의 얼룩 (파란색), 바이러스 성 단백질의 발현을 방지 RVFV 항체 (녹색)로 염색하여 시각화하고, RNA를 시각화하는 시각화입니다(적색) : 형광 염료 (617분의 590 nm의 여기 / 방출 최대)로 표시된 지드와 통합 된 EU의 감지에 의해 개발.
그림 2. 세포의 형광 현미경은 293 세포가 형질 전환 된 모의 하였다. GFP 또는 MP-12 NSS 하나를위한 체외 합성 RNA로 형질 전환 또는 RNA는 GFP 또는 MP-12 NSS 하나에 대한 코딩 합성 체외 형질 전환. 15, 16 시간의 posttransfection 사이 세포는 1 ㎜ EU로 표시 하였다. 전사 억제를위한 컨트롤로, 모의 형질 세포는 5 밀리그램 / ML은 EU 처리와 동시에 ACTD로 치료했다. GFP의 발현을 방지 GFP 항체 (GI)로 염색하여 시각화, NSS의 표현 형광 염료 (여기 / 방출에 대한 복합 항 - 마우스 IgG의 다음 (AF, km) 항 RVFV 항체 염색 시각화 maximuM : 617분의 590 nm의) (적색) : 519분의 495 nm의) (녹색), 그리고 RNA는 형광 염료 (여기 / 방출 최대 표시 지드와 통합 된 EU의 감지에 의해 시각입니다.
그림 3. MP-12 rMP12 - C13type에 감염된 세포의 (A) 유세포 분석. 세포는 감염, 또는 MP-12 rMP12 - C13type 중 하나에 감염된 모의 하였다. 12, 13 HPI 사이 세포는 0.5 mM의 유럽 연합 (EU)으로 표시 하였다. 전사 억제를위한 컨트롤로, 모의 형질 세포는 EU 처리와 동시에 ACTD 5 ㎍ / ㎖ 처리 하였다. (안티 RVFV)와 RNA는 아 지드와 통합 된 EU의 감지에 의해 시각화 : 바이러스 단백질의 발현은 형광 염료 (519분의 495 nm의 여기 / 방출 최대)로 레이블 차 항체 이어 안티 RVFV 항체 염색 시각화 (RNA) : 형광 염료 (665분의 650 nm의 여기 / 방출 최대)으로 표시. DAT이 산점도로 표시됩니다. (B) 동일한 데이터의 표현은 히스토그램에 표시. EU 설립을위한 형광 강도는 X-축에 표시되고, 세포 수는 Y 축에 표시됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
제공되는 프로토콜은 초기 RNA에 딘 아날로그 EU의 결합을 통해 숙주 세포의 전사에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 방법을 설명합니다. 그것은 빠르고, 민감하고, 방사성 동위 원소의 사용에 의존하지 않는이 방법은 이전 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 또한,이 방법은 형광 현미경이나 본질적으로 같은 시약을 사용하여 유동 세포 계측법을 통해 정량적 데이터를 질적 데이터를 산출하기 위해 적용 할 수 있습니다. 바이러스 성 항원에 대한 면역 형광 염색과 결합 될 때,이 방법은 연구자가 감염되지 않은 세포에서 감염 차별화 할 수 있습니다.
그것은 호스트 성적 증명서, 3 H-딘 또는 부순 법인에 의존하는 다른 방법으로 공유되는 단점을 레이블로이 방법은 또한 동일한 속도로 새롭게 합성 된 바이러스의 RNA 레이블을주의하는 것이 중요합니다. RVFV MP-12 감염의 경우 적어도 그러나, 우리는 발견 한 AMO지금까지 호스트 성적 UNT는 바이러스 사본의 양을 능가하고, 따라서이 분석에 의해 측정 된 총 RNA에 바이러스 RNA의 영향은 무시할 수있다. 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해이 프로토콜을 채택 할 때, 연구진은 ACTD에 감염된 세포의 치료를 통해 자신의 현지화를 통해 하나 바이러스의 성적을 확인하고자하는, 또는 형광등에 원위치 하이브리드 화 (물고기) 15 불구 있습니다. 바이러스와 같은 MP-12과 같은 세포질에서 복제 경우, 바이러스의 RNA가 쉽게 여전히 대부분의 라벨 1 시간 후 핵에 포함되어있는 세포의 RNA에서 구별 할 수 있습니다. 감염된 세포는 바이러스 성 RNA 합성이 영향을받지 떠나는 동안 숙주 세포의 전사를 억제하는 ACTD으로 처리 할 수 있습니다. 이중 나선 DNA 16에 바인딩하고 있으므로하여 ACTD 기능은 DNA 의존적 전사를 억제하지만, 바이러스의 RNA 의존 RNA 중합 효소에 영향을주지 않습니다.
이 프로토콜을 수행 할 때, 그것을 방지하는 것이 중요합니다EU라는 RNA로 permeabilization 및 클릭 라벨링 반응 사이의 핵산과 오염 RNases에 의하여 분해에 민감 남아있다. 또한, 연구진은 고정 간의 장기간 배양 시간으로 클릭 라벨 반응 즉시 진행하고 ° C가 RNA 형광 신호의 손실 궁극적으로 RNA의 저하로 이어질 심지어 4에서 반응 라벨을 클릭합니다. 시간 코스 실험을 수행 할 때 특별한 관심입니다 연구진은 모든 세포가 레이블이 해결과 동시에 염색 할 수 있도록 자신의 실험을 설계해야합니다. 다행히, RNA 형광 신호는 클릭 라벨링 반응 후 안정적으로 유지되므로 프로토콜은 쉽게이 단계 이후에 중지 할 수 있습니다.
마지막으로, 연구진은 세포 변성 효과 (CPE)가 부정적으로 특정 전사 억제의 부재에도 세포의 RNA 합성에 영향을 미치는 많은 바이러스에 의한 것을 명심해야합니다. 그것세포는 여전히 가능한 경우 시간 후 감염에 전사 활동을 측정하는 것이 중요하다. 돌연변이 바이러스 등의 RMP-12-C13type (그림 1 및 3)과 같은 전사를 억제 할 수있는 능력을 결여 한 사용할 수있는 경우,이 전사를 측정하기위한 최적의 시점을 결정하는 훌륭한 도구가 될 수 있습니다.
수많은 실험을 계획 할 때, 연구자하여 이차 항체에 대한 필요성을 제거하고 바이러스 항원의 검출에 필요한 시간을 줄이고, 형광 17 자신의 일차 항체를 직접 라벨을 고려할 수 있습니다.
요약하면,이 프로토콜은 숙주 세포의 전사에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 신속하고 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 그것은 쉽게 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해 적응 특정 바이러스 또는 세포 단백질에 대한 immunostainings을 포함하도록 수정 될 가능성이있다 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 마우스 클론 항 RVFV 항혈청 및 유동 세포 계측법에 대한 도움말 UTMB 유동 세포 계측법 핵심 시설의 M. 그리핀을 제공하는 RB Tesh 감사합니다. 이 작품은 UTMB.OL에서 제임스 W. McLaughlin이 원정대 기금 지원에 의해 지원되었다 UTMB.BK에서 백신 개발을위한 실리 센터에서 서부 지역 우수 센터, NIH 보조금 R01 AI08764301 및 자금 5 ~ U54 AI057156에 의해 지원되었다 모리스 R. Hilleman 초기 경력 조사자 포상 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
References
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