Summary
この方法は、リフトバレー熱ウイルス（RVFV）MP-12株による感染の後、宿主細胞転写の変化を測定するためにクリックケミストリーの使用を記載している。結果は、蛍光顕微鏡を介して、定性的に可視化またはフローサイトメトリーを介して定量的に得ることができる。この方法は、他のウイルスとの使用に適合可能である。
Abstract
多くのRNAウイルスは、細胞の防御を回避する手段として、宿主細胞の転写を阻害する能力を進化させてきた。これらのウイルスの研究のために、感染細胞において転写活性を測定する迅速かつ信頼できる方法を有することが重要である。伝統的に、転写はH-ウリジンは、このような免疫を介して検出が続き、5 -ブロモウリジン（BRU）などのハロゲン化ウリジン類似体のオートラジオグラフィーまたはシンチレーション計数、または組み込みを介した検出が続く3などの放射性ヌクレオシドの取り込みのいずれかにより測定された。 BRUの検出が煩雑になることができ、低感度に苦しむかもしれない放射性同位体の使用は、しかしながら、特殊な装置を必要とし、実験室の設定の数には不可能である。
アジドとアルキンから銅触媒トリアゾール形成を含む最近開発されたクリックケミストリーは、今では迅速かつhighlを提供していますこれら2つの方法にyを敏感代わる。クリックケミストリーは、新生RNAは、第1の蛍光アジドとの標識の検出に続いてアナログウリジン-5 - ethynyluridine（EU）の取り込みにより標識された2段階プロセスである。これらのアジドは可視化のためのオプションの広い範囲を可能にする、いくつかの異なる蛍光体として利用可能です。
このプロトコルは、クリックケミストリーを用いたリフトバレー熱ウイルス（RVFV）株MP-12に感染した細胞内で転写抑制を測定する方法を説明しています。同時に、これらの細胞におけるウイルスタンパク質の発現は、古典的な細胞内の免疫染色によって決定される。 4詳細手順1〜8詳細を通して、フローサイトメトリーを介した転写抑制を定量化する方法を、手順5ながら、蛍光顕微鏡を介した転写抑制を可視化する方法。このプロトコルは、他のウイルスとの使用に容易に適応可能である。
Introduction
伝統的に、転写活性は、放射性（3 H-ウリジン）1のいずれかの取り込みを介して測定または新生RNAに（BRU）2ヌクレオシドハロゲン化されています。これらウリジン類似体は、細胞に取り込まヌクレオシドサルベージ経路を介しウリジン三リン酸（UTP）に変換され、続いて新たに合成されたRNAに組み込ま。3 H-ウリジンは、時間がかかることがオートラジオグラフィー、またはシンチレーションによって検出することができているカウント、特殊な装置を必要とします。さらに、放射性同位元素の使用が高い封じ込めバイオ研究所を含め、実験室の設定の数には実用的ではないかもしれない。 BRUは、RNA二次構造は、抗体結合のための立体障害かもしれないとして、RNAの核または部分変性に対する抗体のアクセスを確保するため厳しい透過処理が必要になる場合があります抗BRU抗体による免疫染色で検出することができます。
_content ">ここで記述されたプロトコルは、最近RVFV株MP-12に感染した細胞内で転写活性を測定する化学3をクリックして開発した。クリックケミストリーは非常に選択的かつ効率的な銅（I）触媒によるアルキンとの間の付加環化反応に依存して利用4,5アジド部分は、このプロトコルでは、感染細胞における新生RNAは、第ウリジンアナログEUの取り込みを介して標識される。第二 工程では、取り込まれたEU、蛍光アジドとの反応により検出される。この方法の主な利点はそれは放射性同位元素の使用を必要とせず、それはRNAの過酷な透過又は変性を必要としないこと。50μm未満Daの分子量と（2）、蛍光アジドのアクセスが不十分なことによって妨げられない（1）ということである透過またはRNAの二次構造。クラスにRNAの検出を組み合わせた場合また、研究者は一次抗体の彼らの選択に限定されるものではないウイルスタンパク質の免疫染色のiCal。蛍光顕微鏡（ステップ1-4）を介して転写を可視化するための一つであり、フローサイトメトリー（ステップ5-8）を介して転写を定量化するためのいずれかの2つの異なる方法は、このプロトコルに記載されている。どちらの方法でも、セル単位で転写活性とウイルス感染との間の相関を可能にするウイルスタンパク質に対する免疫細胞内で新生RNAの標識を結合する。
著者らは、正常プロトコルがRVFV株MP-12 6、トスカーナウイルス（TOSV）10に感染した別のMP-12変異体7,8、9、及び細胞に感染した細胞に感染した細胞において転写活性を決定するために、ここで説明に使用した。ここで説明するプロトコルは、簡単に異なるウイルスの使用に適合し、特定のウイルス又は細胞タンパク質の免疫蛍光染色を含むように修正される可能性を有することができる。
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Protocol
蛍光顕微鏡法による転写の分析
1。 EUとのMP-12とラベル新生RNAと細胞に感染
- 12ウェル組織培養プレート中に場所が12mmの円形カバーガラス、ウェルごとにカバースリップ。
注：細胞がウェル内に配置する前に、トラブルカバーガラスに付着し、ポリ-L-リジン（MW≥70,000）とコートを持っている場合。この目的のために、5分間のポリ-L-リジンのH 2 O中の無菌の0.1 mg / mlの溶液中で水没カバースリップ。少なくとも2時間のための無菌H 2 Oと空気乾燥でカバーグラスをすすぐ。
- カバースリップ上にシード293細胞を、ウェルあたり、1mlの増殖培地（DMEM、10％ウシ胎児血清、100 U / mlのペニシリン、100 mg / mlのストレプトマイシンを含む）中で5×10 4細胞を加える。 37℃加湿インキュベーター内でインキュベート℃、5％CO 2 O / N
- 3の感染多重度（MOI）でMP-12で細胞を感染させる。うちの少なくとも2つを含む感染していない井戸：2つのウェルのいずれかが感染していない対照となる、もう一方は転写抑制のための制御としてステップ1.5でアクチノマイシンD（ACTD）で処理されます。増殖培地を取り外し、各ウェルに加え総量が200ミリリットルになるように、ウイルスストックを希釈。 ℃、5％CO 2、37℃加湿インキュベーター中で1時間インキュベートする。
注：代わりに細胞を感染から、細胞はまた、プラスミドDNAでトランスフェクト又はインビトロで特定のウイルスタンパク質をコードするRNAを合成することができる。この目的のために、適切な化学トランスフェクション試薬とトランスフェ細胞は、製造元の指示に従って、16時間後にトランスフェクションで1.5に進みます。それは、RNAラベリングと固定前にトランスフェクション条件とインキュベーション時間を最適化することをお勧めします。
- 接種を外し、ウェルあたり1ミリリットル新鮮な増殖培地を追加します。 15時間37℃でインキュベートする。
- 15時間感染後（HPI）では、1 mMのEUを含む培地で増殖培地を交換してください。モック感染井戸のいずれかに、また5μgの/ミリリットルACTDを追加します。 ACTDはDNA依存性RNA合成を阻害するので、これは、転写抑制のためのコントロールとして機能します。インキュベーターにセルを返します。
- 16 hpiの時、培地を除去し、1mlのPBS（KClを0.20グラム/ L、KH 2 PO 4 0.20グラム/ L、NaClを8.00グラム/ LのNa 2 HPO 4 1.15グラム/ L、pH7.4）で一回カバースリップを洗うウェルあたり。ウェルあたり4％パラホルムアルデヒド（PFA）を1ml添加し、RTで30分間インキュベートして細胞を固定する。
注意：4％PFA固定液を調製するために、°Cに加熱マグネチックスターラーで60まで加熱し150ミリリットルH 2 O中に10グラムパラホルムアルデヒドを溶解する。 1MのNaOHを500μlを加え、溶液が透明になるまで攪拌し続ける。粒子を除去し、62.5ミリリットルリン酸緩衝液（77 mMののNaH 2 PO 4、287 mMのの Na 2 HPO 4、pHは7.4）を追加するろ紙を通してフィルタPFAソリューション。 250ミリリットルの総容積にH 2 Oを追加します。シングルユースのアリコートで-20℃で凍結。
- ウェルあたり1mlのPBSで一回洗浄します。いいえインキュベーション時間は、この後続のすべての洗浄ステップは必要ありません。ステップ2にすぐに進みます。
注：長期間で、この段階で維持する場合RNAは退化ように、それは、すぐにクリック反応を進めることが重要である細胞を、4℃で1時間保持している場合はRNA蛍光信号の損失は、すでに観察することができる°C 。同様に、当たりの場合経時実験を形成する、ラベルに必ず修正し、同時にすべてのサンプルを染色。
2。標識RNAを検出する反応をクリック
- 1mlのPBS中の0.2％トリトンX-100を加えることによって、細胞を透過性。室温で10分間インキュベートする。
注：ステップ2.1から2.3で使用されるすべてのソリューションは、ヌクレアーゼフリーのようにする必要があります。
- ウェルあたり1mlのPBSで三回洗浄する。
- 湿度の高い室に12ウェルプレートと転送からカバースリップを削除します。各：100μlのクリック染色液（100mMのアスコルビン酸100mMトリスpHは8.5、1 mMののCuSO 4、20μM蛍光アジ[617分の590 nmの励起/発光最大]） - 50で各カバースリップをカバーしています。暗闇の中で室温で1時間インキュベートする。
注：湿潤チャンバーを組み立てるために、プラスチック製パラフィンフィルムで10センチ径のライン細胞培養やペトリ皿の底を。ジの端部の内側に並ぶ湿らせたペーパータオルでSH。プラスチックパラフィンフィルム上にカバースリップを置きます。
注意：カバーガラスは、プロトコルでは、このまたは他の任意のステップの間に乾燥させないように注意してください。それは湿気のあるチャンバ内に配置された後に直接各カバースリップに染色液を追加することをお勧めします。
注意：このステップの直前に新鮮クリック染色液を準備します。 1.5 MトリスpH8.5の100mMののCuSO 4、及び500mMのアスコルビン酸のストック溶液を4℃で保存することができるしかし、黄色になって、任意のアスコルビン酸原液を捨てる。
注意：お使いの蛍光顕微鏡のフィルターに一致する蛍光体を選択してください。
- 新鮮な12ウェルプレートに湿潤チャンバーと場所からカバーガラスを外し、ウェルあたり1mlのPBSで3回洗浄する。
注意：なしデ場合ウイルスタンパク質の護は、望まれているカバースリップをマウントすることができ、このステップ（3.3に進みます）の後に結像する。
3。ウイルスタンパク質の発現を検出する免疫蛍光
- 各ウェルにブロッキング緩衝液1ml（3％（w / v）のウシにおける血清アルブミン（BSA）をPBS）を加え、暗所で室温で30分間インキュベートする。
- 湿度の高い室に、12ウェルプレートから転送をカバースリップを外し、50でカバー - バッファー（1:500）をブロックで希釈した一次抗体を100μl（抗RVFV博士RBテッシュからの親切な贈り物、UTMB）。暗闇の中で室温で1時間インキュベートする。
注意：別のウイルスを使用するため、このプロトコルを適応する場合は、最初にあなたの一次抗体の最適な希釈を決定します。
注：あるいは、このステップは暗所で4℃でO / Nを行うことができる。
- 12ウェルプレートに戻って湿潤チャンバーと場所からカバーガラスを取り外し、洗うウェルあたり1mlのPBSで3回。
- 50と湿度の高い室とカバーに12ウェル場所、場所からカバースリップを削除 - 二次抗体を100μl（抗マウスIgG蛍光色素[励起/発光最大値：519分の495 nmの]に抱合）（1ブロッキング緩衝液で希釈した： 500）。暗闇の中で室温で1時間インキュベートする。
注意：あなたの一次抗体を認識し、あなたの蛍光顕微鏡のフィルターに一致することができる二次抗体を選択してください。
注：必要に応じて、200 ngの/ mlのDAPIが核を可視化する二次抗体の希釈液に添加することができる。
- バック12ウェルプレートに湿潤チャンバーと場所からカバーガラスを外し、ウェルあたり1mlのPBSで3回洗浄する。
- 顕微鏡スライド上にFluoromount™を-Gの1滴（ 約 15μL）を配置することにより、カバースリップをマウントします。 H 2 Oにカバースリップを浸し、目に触れることによって過剰H 2 Oを除去Fluoromount™を-Gのドロップダウンにペーパータオル、と場所細胞側に対してE側。 5分間空気乾燥した。
注：倒立顕微鏡でイメージングする場合、Fluoromount™を-G 4で固化することができます°CO / Nや接辞カバースリップ顕微鏡スライドに透明マニキュアでエッジを密封することによって。
注：最大1週間のためにスライドがすぐにイメージしたり、暗闇の中で4℃で保存することができます。
4。データの取得
- 蛍光顕微鏡を用いた画像。
注：ご使用の顕微鏡を用いて可視化することができ、適切な蛍光プローブを選択してください。参考までに、以下は、本書に示されている画像を取得するために使用される蛍光団とフィルターセットです。
DAPI：
励起フィルター：BP 330から385
二色鏡：DM 400
発光フィルター：LP 420
二色鏡：DM 505
発光フィルター：LP 510
617分の590の励起/発光最大蛍光団：
励起フィルター：BP 545から580
二色鏡：DM 600
発光フィルター：LP 610
フローサイトメトリーによる転写の分析
5。 EUとのMP-12とラベル新生RNAと細胞に感染
- 増殖培地（DMEM、10％ウシ胎児血清、100 U / mlのペニシリン、100μg/mlの/ mlのストレプトマイシンを含む）中の6ウェル組織培養プレートに293細胞をシード。 100％コンフルエント- 37℃、5％CO 2の細胞が80に達するまでの加湿インキュベーター中でインキュベートする。
- MOI 3でMP-12で細胞を感染させる。少なくとも二つの感染していない井戸を含める：2つのウェルの一つは、他のステップでACTDで処理されますが、感染していないコントロールとして機能します5.4。増殖培地を取り出し、総容積は、各ウェルに添加するようにウイルスストックを希釈する400μlのです。 ℃、5％CO 2、37℃加湿インキュベーター中で1時間インキュベートする。
- 接種を外し、ウェル当たり2ミリリットル新鮮な増殖培地を追加します。 12時間37℃でインキュベートする。
注：別のウイルスを使用するために、このプロトコルを適合させる場合は、ラベル付けと収穫するための最適な時点を決定するために経時変化実験を実行することが望ましい。感染時間がずれていると、すべてのサンプルを採取し、標識し、同時に染色することができるように、この時間経過を設定する。
- 12 HPIでは、0.5mMのEUを含む培地で増殖培地を交換してください。モック感染井戸のいずれかに、また5μgの/ミリリットルACTDを追加します。 ACTDはDNA依存性RNA合成を阻害するので、これは、転写抑制のためのコントロールとして機能します。インキュベーターにセルを返します。
- 13 HPIでは、ウィット一度細胞を洗浄細胞のトリプシン処理によって時間PBSと収穫。 PBSで1mMのEDTA（PBS-EDTA）を含むと回収した細胞を3回洗浄する。
注意：本製品と後続のステップの間に、500よりも速く、細胞を遠心分離しないでください- 1,000 XGをセルの破損を防ぐために。 1細胞を遠心分離 - 堆積物〜2分。
注意：表面の免疫染色がクリック反応後に計画されている場合は、代わりにゴム警官や使い捨てセルスクレーパーを使って収穫。
- 室温で30分間、4％PFAとインキュベート1mlに、それらを再懸濁することにより細胞を固定。 4％PFAを準備する方法については、1.6の手順を参照してください。
- ウェルあたり1mlのPBS-EDTAで一回洗ってください。ステップ6に進んですぐに。
注意：長時間のため、この段階で守ればRNAが退化としてそれは、すぐにクリック反応を進めることが重要です。同様に、時間cを実行した場合ourse実験では、ラベルに必ず、同時にすべてのサンプルを修正して染色。
6。標識RNAを検出する反応をクリック
- PBS中の0.2％トリトンX-100 0.5mlに再懸濁することにより、細胞を透過性。室温で10分間インキュベートする。
注：ステップ6.1から6.3で使用されるすべてのソリューションは、ヌクレアーゼフリーのようにする必要があります。
注：細胞はこのステップ中沈渣正しくない場合は、5分まで遠心時間を増やします。沈降挙動は一度細胞はFACSバッファー（ステップ6.4）に懸濁している改善されます。
- 1mlのPBSで一回洗浄します。
注：これはクリック反応のために必要なのCu 2 +イオンをキレート化しますように、このステップでEDTAを使用しないでください。
- 200μlのクリック染色液に再懸濁した細胞（100mMトリスpHは8.5、1 mMののCuSO 4、蛍光色素[EXCで標識された200nmのアジitation /発光極大：665分の650 nm]と、100mMのアスコルビン酸）。暗闇の中で室温で1時間インキュベートする。
注意：このステップの直前に新鮮クリック染色液を準備します。 1.5 MトリスpH8.5の100mMののCuSO 4、及び500mMのアスコルビン酸のストック溶液を4℃で保存することができるしかし、黄色になって、任意のアスコルビン酸原液を捨てる。
注：このステップの間に一緒に細胞の塊であれば、上下に数回ピペッティングして再懸濁します。
注意：お使いのフローサイトメトリーによって検出することができる蛍光体を選択してください。
注：以下もクリック染色手順に供されていない感染細胞のいずれかの試料を調製し、これらはフローサイトメータの校正に必要とされる。どちら感染細胞の半分を使用するか、ステップ5.2でうまく感染追加が含まれています。これらの詐欺制御の細胞は、ステップ7.1で免疫染色されます。
- FACS緩衝液（PBS 1mMのEDTAおよび0.5％（w / v）のBSAを含む）で2回洗浄する。
注：ウイルスタンパク質のno免疫染色が望まれていない場合、細胞は（ステップ8に進み）、直ちに分析することができる。
7。ウイルスタンパク質の発現を検出する免疫蛍光
- 再懸濁し、FACSバッファー（1:10,000）で希釈した一次抗体を200μlで細胞（抗RVFV）と暗所で室温で1時間インキュベートする。
注：あるいは、このステップは暗所で4℃でO / Nを行うことができる。
注：またクリック染色手順に供したが、免疫染色されず、これらはフローサイトメーターのキャリブレーションのために必要とされる非感染細胞の一つのサンプルを準備します。モック感染細胞の半分を使用するかでよく追加の感染を含むいずれかステップ5.2。
注意：別のウイルスを使用するため、このプロトコルを適応する場合は、最初にあなたの一次抗体の最適な希釈を決定します。
- FACS緩衝液で細胞を2回洗浄します。
- 二次抗体を200μlに再懸濁した細胞（抗マウスIgG蛍光色素に結合した[励起/発光最大値：519分の495 nm]で）FACSバッファー（1:1,000）で希釈し、暗所で室温で1時間インキュベートする。
- FACS緩衝液で細胞を1回洗浄します。
注：この時点で、細胞を、暗所で4℃でO / Nを記憶することができる。
8。データの取得
- 、500μlのFACS緩衝液中で細胞を再懸濁を5mlポリスチレンチューブに転送し、フローサイトメーターを用いて分析する。計器を校正するためにMP-12に感染した細胞（無クリック反応、抗RVFV染色のみ）とモック感染細胞を（のみ反応をクリックします）を使用します。
しないE：あなたの楽器によって検出することができる適切な蛍光プローブを選択してください。参考までに、以下は、本書に示されたデータを取得するために使用されるレーザーラインと設定フィルタです。
519分の495の励起/発光スペクトルと蛍光団：
レーザー：488nmの
フィルタ：30分の530
665分の650の励起/発光スペクトルと蛍光団：
レーザー：640 nmの
フィルタ：20分の670
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Representative Results
P62のプロテアソームによる分解を促進することにより隔離することでは、（i）基本転写因子TFIIH 11と、（ii）のP44サブユニット：RVFVのNSsのタンパク質は、（ ブニヤウイルス科 、属フレボ ）11は、2つの異なるメカニズムを通じて宿主細胞一般的な転写を阻害TFIIH 6のサブユニット。 MP-12株は、生物学的安全性レベル2実験室で処理することができ、他の野生に適用される米国内の選択ルール剤、から除外されるのでRVFV MP-12ワクチン株13は、このプロトコルに記載された実験に使用されているRVFV株を入力します。 MP-12株のタンパク質のNSは完全に機能しており、ホスト転写6を抑制する能力を保持する。のNS遺伝子14の69％を包含する欠失を運ぶウイルスrMP12-C13typeは、宿主細胞の転写を抑制する能力を含むすべてのNS機能を欠く対照ウイルスとして含まれている。
図3Aは、フローサイトメトリーにより得られた定量的なデータを示す図である。データは、x軸上にプロットされた抗RVFV染色のためにy軸上にプロットし、その新生RNAへの組み込みのためのEUの蛍光信号に散布図として表現される。象限ゲートはモック感染細胞の大部分がACTD処理した細胞の大部分が左下の象限に位置していたし、感染細胞の大部分がプロットの右半分に位置していた、左上の象限に位置していたように設定された。細胞を、MP-12を感染させたときに、全細胞の81.5パーセント、または抗RVFV陽性細胞の93％が減少し、転写活性を示した。対照的に、wheのn個のセルがrMP12-C13typeに感染させた、全細胞の91.6パーセント、または抗RVFV陽性細胞の97％が、模擬感染細胞のそれに匹敵した転写活性を示した。 図3Bの形態では、図3Aと同じデータを示すEU混入で標識蛍光RNAのヒストグラムの。
図1。 MP-12とrMP12-C13type。293細胞に感染した細胞の蛍光顕微鏡は、感染またはMP-12またはNSSの欠失変異体RMP-12-C13typeいずれかに感染してモックだった。 15及び16 hpiの間に、細胞を1mMのEUで標識した。転写抑制のための対照として、模擬感染細胞を5 mg / mlのは、EUの処理と並行してACTDで処理した。核はDAPI染色（青色）を介して可視化され、ウイルスタンパク質の発現は、抗RVFV抗体（緑）で染色して可視化され、そしてRNA可視化である（赤）：蛍光色素（617分の590 nmの励起/発光最大値）で標識されたアジを組み込んだEUの検出によるD。
図2。細胞の蛍光顕微鏡は、293細胞はトランスフェモックだった。GFPまたはMP-12 NSsのいずれかのためにin vitroで合成されたRNAをトランスフェクション 、またはRNAは、GFPまたはMP-12 NSsのいずれかをコードする合成されたインビトロでトランスフェクトした。 15および16時間posttransfectionの間、細胞を1mMのEUで標識した。転写抑制のための対照として、モックトランスフェクトされた細胞を5 mg / mlのは、EUの処理と並行してACTDで処理した。 GFPの発現は、抗-GFP抗体（GI）を用いて染色することによって視覚化される、のNSの発現は、抗マウスIgG、続いて抗RVFV抗体（afの 、 離れた ）での染色により可視化される蛍光色素（励起/発光にコンジュゲートmaximuM：617分の590 nm）を（赤）：519分の495 nm）を（緑）、RNAは、蛍光色素（励起/発光極大で標識アジドで取り込まれたEUの検出によって可視化される。
図3。 MP-12またはrMP12-C13typeに感染した細胞の（A）のフローサイトメトリー分析。細胞は感染、またはMP-12またはrMP12-C13typeいずれかに感染してモックだった。図12および図13 hpiの間に、細胞を0.5mMのEUで標識した。転写抑制のための対照として、モックトランスフェクトされた細胞をEUの処理と並行してACTD5μgの/ mlで処理した。 （抗RVFV）およびRNAがアジドを組み込んだEUの検出によって可視化される：ウイルスタンパク質の発現は、蛍光色素（519分の495 nmの励起/発光極大）で標識した二次抗体、続いて抗RVFV抗体で染色することによって視覚化される（RNA）：蛍光色素（665分の650 nmの励起/発光極大）で標識した。 DAT散布図として表現される。（B）は 、同じデータの表現は、ヒストグラムに示されるように。 EU組み込むための蛍光強度がx軸上にプロットされ、細胞数をy軸上にプロットされている。 より大きい数字を表示するにはここをクリック 。
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Discussion
提供されたプロトコールは、新生RNAへウリジンアナログEUの取り込みを介して宿主細胞の転写に対するウイルス感染の影響を測定するための方法が記載されている。それは、高速で敏感であり、それは、放射性同位元素の使用に依存しない：この方法は、従来の方法に比べていくつかの利点を有する。さらに、この方法は、蛍光顕微鏡又は本質的に同じ試薬を用いてフローサイトメトリーを介して、定量的データを介して定性的データを得るように構成することができる。ウイルス抗原に対する免疫蛍光染色と組み合わせると、この方法はまた、研究者が非感染細胞からの感染を区別することができます。
それは、ホスト転写物、3 H-ウリジン又はBRUの取り込みに頼る他の方法と共有されている欠点をラベルとして、この方法はまた、同じ速度で新たに合成されたウイルスRNAにラベルを付けることに注意することが重要である。 RVFV MP-12感染の場合には、少なくとも、しかし、我々は発見したAMO遠による宿主転写物のUNTは、ウイルス転写物の量を上回るので、このアッセイにより測定した全RNA上のウイルスRNAの影響は無視できる。別のウイルスで使用するためにこのプロトコルを適応すると、研究者はACTDと感染細胞の治療を通じて、彼らのローカライズのいずれかを介してウイルスの転写産物を同定したい、または蛍光in-situハイブリダイゼーション（FISH）15でも可能性があります。ウイルスはその後、ウイルスRNAを簡単にまだほとんど標識1時間後に核内に含まれている細胞RNA、区別することができる、そのようなMP-12として、細胞質で複製した場合。感染した細胞は、ウイルスRNA合成は影響を受けない残して宿主細胞の転写を抑制することACTDで処理することができる。従って、二本鎖DNAに結合し、16によるACTD関数は、DNA依存性転写を阻害したが、ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼには効果がありません。
このプロトコルを実行するとき、それは避けることが重要であるEU標識RNAとして透過とクリック標識反応の間にヌクレアーゼの混入はRNaseが3による劣化に敏感のまま。さらに、研究者は、固定間長引くインキュベーション時間として、クリック標識反応にすぐに進み、°Cは、RNA蛍光信号の損失につながる最終的にRNAの分解につながり、さらには4で、反応をラベルをクリックする必要があります。タイムコース実験を行うときに特別な関心のある研究者は、すべての細胞が、標識固定し、同時に染色することができるように、彼らの実験を設計する必要があります。幸いなことに、RNA蛍光シグナルは、クリック標識反応後に安定したままなので、プロトコルは、簡単にこのステップの後に停止させることができます。
最後に、研究者は、多くのウイルスによる細胞変性効果（CPE）が負の任意の特異的な転写抑制が存在しない場合にも、細胞RNA合成に影響を与えることに留意する必要があります。それ細胞がまだ有効である場合、時間感染後の転写活性を測定することが重要である。変異ウイルスは、例えばRMP-12-C13type（ 図1および図3）などの転写を抑制する能力を欠く可能な場合は、この転写を測定するための最適な時点を決定する強力なツールとすることができる。
多数の実験を計画する際に、研究者は、それによって二次抗体の必要性を排除およびウイルス抗原の検出に要する時間を短縮し、蛍光色素17との一次抗体を直接標識することを検討します。
要約すると、このプロトコルは、宿主細胞の転写に対するウイルス感染の効果を測定するための迅速かつ信頼性の高い方法を提供する。それは簡単に異なるウイルスの使用に適合し、特定のウイルス又は細胞タンパク質のための免疫染色を含むように変更される可能性を有することができる。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
私たちは、フローサイトメトリーのヘルプのためにUTMBフローサイトメトリーコアファシリティのマウスポリクローナル抗RVFV抗血清とM.グリフィンを提供するためにRBテッシュに感謝します。サポートされていたこの作品は、NIHの助成金R01 AI08764301、優秀西部地域センターを通じて5 U54 AI057156によってサポートされていました、そしてUTMB.BKにおけるワクチン開発のためのシーリーセンターから資金がUTMB.OLでジェームズ·W·マクラフリンフェローシップ基金によってサポートされていましたモーリスR.ハイルマン早期キャリア調査官賞によって。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
References
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