Summary
Ekkokardiografi brukes vanligvis til ikke-invasiv karakterisere og kvantifisere endringer i hjertestruktur og funksjon. Vi beskriver en ultralydbasert bildealgoritme som tilbyr et forbedret surrogatmål av myokardmikrostruktur og kan utføres ved hjelp av bildeanalyseprogramvare med åpen tilgang.
Abstract
Ekkokardiografi er en allment tilgjengelig bildemodalitet som vanligvis brukes til ikke-invasiv karakterisere og kvantifisere endringer i hjertestruktur og funksjon. Ultralyd vurderinger av hjertevev kan omfatte analyser av backscatter signalintensitet innenfor en gitt interesseregion. Tidligere etablerte teknikker har hovedsakelig stolt på den integrerte eller gjennomsnittlige verdien av backscatter signalintensiteter, noe som kan være utsatt for variasjon fra aliasdata fra lave bildefrekvenser og tidsforsinkelser for algoritmer basert på syklisk variasjon. Her beskriver vi en ultralydbasert bildealgoritme som strekker seg fra tidligere metoder, kan brukes på en enkelt bilderamme og står for full fordeling av signalintensitetsverdier avledet fra en gitt myokardprøve. Når den brukes på representative muse- og bildedata, skiller algoritmen mellom personer med og uten eksponering for kronisk etterbelastningsmotstand. Algoritmen tilbyr et forbedret surrogatmål av myokardmikrostruktur og kan utføres ved hjelp av åpen tilgang bildeanalyseprogramvare.
Introduction
Ekkokardiografi er en allment tilgjengelig bildemodalitet som vanligvis brukes til ikke-invasiv karakterisere og kvantifisere endringer i hjertestruktur og funksjon. Ultralydvurderinger av hjertevev kan omfatte analyser av backscatter signalintensitet innenfor en gitt interesseregion på et enkelt tidspunkt, så vel som i løpet av hjertesyklusen. Tidligere studier har antydet at mål på sonografisk signalintensitet kan identifisere den underliggende tilstedeværelsen av myokardfiberdisarray, levedyktig versus ikke-levedyktig myokardvev og interstitiell fibrose1-3. Vi refererer til myokard "mikrostruktur" som vevsarkitekturen som kan karakteriseres, ved hjelp av sonografisk analyse, utover lineære målinger av brutto størrelse og morfologi. Følgelig har analyser av sonografisk signalintensitet blitt brukt til å evaluere mikrostrukturelle endringer av myokardvev i innstillingen av hypertrofisk og utvidet kardiomyopati4,5, kronisk koronararteriesykdom6,7, og hypertensiv hjertesykdom8,9. Tidligere etablerte teknikker har imidlertid hovedsakelig stolt på den integrerte eller gjennomsnittlige verdien av backscatter-signalintensiteter, som kan være utsatt for variasjon fra tilfeldig støy5, aliasdata fra lave bildefrekvenser10, og tidsforsinkelser for algoritmer basert på syklisk variasjon11.
Her beskriver vi metoden for å bruke en ultralydbasert bildeanalysealgoritme som strekker seg fra tidligere metoder; Denne algoritmen fokuserer på en enkelt end-diastolisk ramme for bildeanalyse og står for full fordeling av signalintensitetsverdier avledet fra en gitt myokardprøve. Ved å bruke perikardiet som en referanse i rammen12,13, kvantifiserer algoritmen reroduserer variasjon i sonografiske signalintensitetsfordelinger og tilbyr et forbedret surrogatmål for myokardmikrostruktur. I en trinnvis protokoll beskriver vi metoder for å klargjøre bilder for bruk, prøvetaking av interesseområder og behandling av data innenfor utvalgte interesseområder. Vi viser også representative resultater fra å bruke algoritmen på ekkokardiografiske bilder hentet fra mus og mennesker med variabel eksponering for etterbelastningsspenning på venstre ventrikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av bilder for analyser
- Få murine eller menneskelig ekkokardiografisk B-modus bilder i parasternal langaksevisning. Juster innstillinger for tidsøkningskompensasjon og plassering av overføringsfokuset for å optimalisere visualiseringen av LV og andre hjertestrukturer i parasternalvisningen, per vanlig praksis. Kontroller at alle bilder er lagret i DICOM-filformat. Standardiserte bildevisninger plasserer den inferolaterale venstre ventrikulære veggen ved foten av rammen. Rammer må vise hele venstre ventrikulært myokardium og perikardium. Oppløsningen må være høy nok til å avgrense den perikardbaserte grensen, myokardveggen og endokardielle grensen til venstre ventrikel. Forkast bilder med overflødig frafall eller bildeartefakter.
- Importer en bildefil for analyse til ImageJ programvareplattform v1.46 som en DICOM-fil. Konverter filen til en 8-biters bildefil.
- Bla gjennom påfølgende rammer i hjertesyklusen til du når en passende endediastolisk ramme av høy kvalitet. Du kan også velge den enddiastoliske rammen i et ekkokardiografisk visningsprogram og deretter eksportere til et .jpg filformat med høy oppløsning for bruk i ImageJ. Identifiser rammene nærmest end-diastole ved hjelp av R-bølgen av EKG-sporingen, og identifiser deretter den beste rammen som fanger LV med maksimal intern dimensjon. Tenk på denne enkeltrammen den enddiastoliske rammen.
- Det foreslås at brukere blir blindet for subjektidentitet når de velger interesseområder.
2. ROI-prøvetaking
- Valg av perikardreferanse. Når du velger den perikardielle regionen av interesse (ROI), tar sikte på å fange heterogeniteten til perikardvevet. Vær oppmerksom på at bildets lysstyrke og kontrast kan justeres for ROI-merking etter behov, uten at det påvirker analyseresultatene.
- Bruk verktøyet for rektangeltegning i ImageJ til å velge et rektangel med lengde som tilnærmer seg den midterste tredjedelen av den basale bøyningsveggen.
- Endre størrelsen på den rektangulære avkastningen slik at den strekker seg over bredden på perikardiet ved hjelp av ROI-størrelsesverktøyet.
- Roter avkastningen slik at den ligger innenfor det perikardbaserte området ved hjelp av Roteringsverktøyet i ImageJ.
- Gjør nødvendige justeringer i hjørnene av den perikardmessige avkastningen. Fang en endelig perikardiell interesseregion som ligger innenfor den midterste tredjedelen av perikardveggen, og inkluderer bredden på perikardveggen uten å strekke seg inn i myokard- eller ekstra-hjerteområdene. Ta sikte på å fange opp samme relative plassering og prosentandel av totalt perikardområde for alle tiltak i en gitt studie.
- Bruk algoritmen på utvalget via ImageJ analyseverktøy (se avsnitt 3).
- Valg av myokard. Nok en gang, ta sikte på å fange heterogeniteten til myokardvevet i midten av den basale inferolaterale myokardveggen. Vær oppmerksom på at bildets lysstyrke og kontrast kan justeres for ROI-merking etter behov, uten at det påvirker analyseresultatene.
- Velg et rektangel som strekker seg over bredden på den myokardiale veggen, unntatt endokardiet og epikardiet. Kontroller at det myokardbaserte merket område ligger ved siden av den perikardielle markeringen og i samme theta-vinkel. Ikke inkluder områder med papillær muskel innenfor utvalgsområdet.
- Roter den myokardbaserte avkastningen slik at den ligger parallelt med det perikardielle utvalget.
- Gjør eventuelle nødvendige justeringer i hjørnene av den myokardbaserte avkastningen. Isoler en endelig myokardregion av interesse som ligger innenfor den midterste tredjedelen av myokardveggen, og fanger bredden på veggen uten å strekke seg inn i de perikardiale eller intraluminale områdene.
- Bruke algoritmen på det merkede området via en ImageJ-makro.
3. Dataanalyse og behandling
- Installer ImageJ-makroen kalt "getHistogramValues.txt".
- Bruk analyseverktøyet for ImageJ-histogram til å forhåndsvise fordelingen av signalintensitetsverdier i avkastningen (utfør dette trinnet for det perikardielle valget og for det mystiske valget).
- Bruk ImageJ-makroen til å registrere disse signaltetthetsverdiene for avkastningen (utfør dette trinnet for det flerårige valget og for det mystiske valget).
- Tilordne en intensitetsverdi fra 0 (mørkeste) til 255 (lyseste) enheter til hvert bildepunkt i markeringen.
- Ordne intensitetsverdiene hierarkisk, etter økende intensitet, for å produsere en fordeling av signalintensitet.
- Velg og rapporter følgende persentilverdier for fordelingen: 20. persentil,50. persentil (median) og 80. persentil.
- Normaliser myokardintensiteter ved hjelp av perikardreferansen.
- Normaliser ved å dele de myokardale persentilverdiene for intensitet med de tilsvarende perikardpertilverdienefor intensitet 12, eller ved å trekke den myokardale persentilverdien for intensitet fra den perikardale persentilverdienfor intensitet 13.
- Rapportverdier for de fire analysemetodene: normaliserte myokard-til-perikardialverdier for 20.-persentil, 50. persentil (median) og 80.
4. Kvantifisere syklisk variasjon
- Bruk algoritmen på myokardvalg gjennom påfølgende rammer i DICOM-filen, som beveger seg gjennom hjertesyklusen. Sammenlign forskjeller i intensitetsfordelinger mellom rammer, med oppmerksomhet på endesystoliske og enddiastoliske rammer.
Alle bildeanalysene beskrevet ovenfor utføres offline på ikke-invasive ekkokardiografiske bilder som tidligere er anskaffet og digitalt lagret i DICOM-format. Alle studieprotokoller ble godkjent av Brigham and Women's institutional review board og Harvard Medical Area standing Institutional Animal Care and Use Committee.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Signalintensitetsanalyse utføres i 4 hovedtrinn (figur 1), inkludert: 1) bildevalg og formatering, 2) prøvetaking av avkastning og referanseområder, 3) algoritmeapplikasjon og 4) behandling av endelige verdier for å gi myokard-til-perikardintensitetsforhold. Valg og størrelse på avkastningen er standardisert for å begrense interuser så vel som intrauservariabilitet (figur 2). Plasseringen av hver avkastning er også standardisert med hensyn til hvert anatomiske strukturer for å begrense intersubjekt samt intrasubjektvariabilitet.
Som et mål på myokardtetthet forventes algoritmen å avdekke endringer i signalintensitet gjennom hele hjertesyklusen, noe som tilsvarer den forventede økningen i myokardtetthet i systole sammenlignet med diastol. Som vist i figur 3, høyere persentilverdier av signalintensitet fremhever syklisk variasjon hos mus med og uten 7 ukers eksponering for etterbelastningsmotstand (dvs. en mus som gjennomgikk stigende aorta innsnevring sammenlignet med en kjøretøykontrollmus som gjennomgikk sham kirurgi).
Fra analyse av en enkelt end-diastolisk ramme (Figur 4), er betydelige forskjeller også notert for både mus og mennesker utsatt for kronisk etterbelastningsstress (tilfeller) sammenlignet med deres representative kolleger (kontroller). Både rekkevidden og størrelsen på signalintensiteten varierer mellom tilfeller og kontroller. Sett i analyser av syklisk variasjon, 80th sammenlignet med 50 persentilverdier innenfor hver signalintensitetsfordeling tyder en større relativ forskjell i signalintensitet mellom tilfeller og kontroller.
Algoritmen som presenteres her, gir utdata i form av myokard-til-perikardielle forhold mellom signalintensitet, der de flerårige verdiene fungerer som referanse i rammen (figur 5). Forholdet mellom myokard-til-perikardial signalintensitet ble bestemt basert på enkeltbildeanalyse av bilder hentet fra representative kontroller og tilfeller av etterbelastningsstress. Samsvar med resultatene ovenfor, gir det myokardial-til-perikardiale forholdet mellom 80 persentilsignalintensitetsverdier størst evne til å skille mellom kontroller og tilfeller. Forventede forskjeller i myokardmikrostruktur, basert på våre bildeanalyseresultater, var i samsvar med funn fra myokardvevs histologi i kontroll og casemus ved 7 uker etter henholdsvis sham- eller aortabåndkirurgi (figur 6).
Figur 1. Arbeidsflytprosess for et enkeltbilde. Prosessen inkluderer fire hovedtrinn som kan gjentas når man sammenligner forsøkspersoner eller ved kvantifisering av syklisk variasjon.
Klikk her for å vise større bilde.
Figur 2. Region av interesse (ROI) prøvetakingsteknikk. Bildeanalysealgoritmen er standardisert for bruk hos mus (A) og hos mennesker (B). Myokard- og perikardvalg for henholdsvis representative muse- og menneskelige bilder vises.
Klikk her for å vise større bilde.
Figur 3. Variasjon av sonografisk signalintensitet gjennom hele hjertesyklusen. Algoritmen ble brukt på et myokardområde av interesse over påfølgende rammer av DICOM-bilder hentet fra en representativ kontrollmus (A) og en aorta-bånd mus (B). Bildefrekvensen var 212 for begge bildene. For disse bildene ble syklisk variasjon vurdert ved hjelp av 3 cutpoints: 20 persentil (diamant),50 persentil (firkantet) og 80persentil (trekant). Relativ konjunkturvariabilitet er høyere for de80 persentilverdiene enn for de lavere cutpoint-verdiene. Klikk her for å vise større bilde.
Figur 4. Signalintensitetsfordelinger vises fra enkeltbildeanalyse av representativ mus og menneskelige bilder. Histogrammer viser fordelinger av signalintensitet avledet fra myokardi av en kontrollmus ved 7 uker etter sham kirurgi (A), en aorta-banded mus på 7 uker etter operasjonen (B), et normotensivt menneske (C), og et hypertensivt menneske (D). Blå loddrette linjer angir20. persentil, 50.persentil og80. Fordelingene av signalintensitet er høyredreinede, og er større innen rekkevidde, for forsøkspersonene med kronisk etterbelastningsstress (dvs. aortabånd sammenlignet med kontrollmus og hypertensiv sammenlignet med normotensivt menneske).
Klikk her for å vise større bilde.
Figur 5. Representative data produsert av bildeanalysealgoritmen. (A) viser data fra en sham-operert (kontroll) sammenlignet med aorta-bånd (case) mus på 7 uker. (B) viser data fra et menneske med normalt blodtrykk (kontroll) sammenlignet med et menneske med kronisk hypertensjon (tilfelle). Forholdet mellom myokard-til-perikardial signalintensitet ble bestemt ved hjelp av 3 analytiske metoder i algoritmen: forholdet mellom20. forholdet mellom50 persentilverdier; og forholdet mellom80. Den største forskjellen mellom kontroller og tilfeller er demonstrert ved å bruke forholdet mellom de80 persentilverdiene for signalintensitet.
Klikk her for å vise større bilde.
Figur 6. Forskjeller i myokardvevs histologi mellom mus med og uten eksponering for etterbelastningsstress. Representative Massons trichrome fargede deler av venstre ventrikel vises for en mus som gjennomgikk sham kirurgi (A: kontroll) og en mus som gjennomgikk aorta banding (B: tilfelle) på 7 uker etter operasjonen. Seksjoner viser tilstedeværelse av betydelig kollagenavsetning og interstitiell fibrose i saken sammenlignet med kontrollen. Skalastenger representerer 50 μm.
Klikk her for å vise større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver protokollen for en bildeanalysealgoritme som kvantifiserer sonografisk signalintensitetsfordeling og i sin tur tilbyr et surrogatmål av myokardmikrostruktur. Standardiserte funksjoner i protokollen, inkludert valg, størrelse og plassering av avkastningen og referanseområdet, bidrar til å minimere bruker- og emnebasert variasjon. Vi demonstrerer at når den brukes på enddiastoliske ekkokardiografiske bilder med én ramme, kan algoritmen på riktig måte skille mellom normalt myokardium versus myokard som er utsatt for stress etter belastning.
Protokollen beskriver hvordan algoritmen kan brukes ved hjelp av Open Source ImageJ-programvarepakken. Innenfor dette bildeanalysemiljøet kan algoritmen brukes til å produsere data om fordelingen av signalintensitetsverdier fra en gitt myokardvevsprøve. De resulterende signalintensitetsfordelingene kan vises i form av histogrammer. Histogrammer av intensitetsverdier innen myokardvalg viser at syke myokardvev viser et riktig skifte i distribusjon, og et større verdiområde, sammenlignet med ikke-disket myokardium. Dette mønsteret ses når algoritmen brukes på både menneskelige og murine ekkokardiografiske bilder.
Variasjon i signalintensitet over hjertesyklusen observeres for å samsvare med fysiologiske endringer i myokardtetthet. En analytisk metode som konsekvent skiller mellom tetthetsendringer gjennom hele hjertesyklusen, antas å være følsom for forskjeller i myokardtetthet som oppstår som svar på patologiske prosesser1,6. Faktisk observeres syklisk variasjon ved påføring av algoritmen til påfølgende rammer i murine ekkokardiogrammer. En større variasjon i intensitet over hjertesyklusen observeres for bildeintensitetsverdier ved høyere sammenlignet med lavere persentiler innenfor den totale signalintensitetsfordelingen.
Når algoritmen brukes på representative prøver av ekkokardiografiske bilder hentet fra forsøkspersoner med og uten eksponering for etterbelastningsmotstand, observeres den myokardial-til-perikardiale forholdstettheten ved utvalgte persentilverdier å være spesielt effektiv til å skille personer med sammenlignet med uten eksponering for kronisk etterbelastningsmotstand. Dette funnet er observert i analyser av representative muse- og menneskedata. Forhøyede myokardtettheter forventes å bli sett i myokardvevet til personer utsatt for kronisk etterbelastningsstress, siden slik stress er kjent for å fremme interstitiell kollagenavsetning og utvikling av myokardfibrose14. Måling av myokardvevsendringer over tid kan brukes til å gi en bedre forståelse av vevsresponsen på langvarig stress og sykdomsprogresjon. Videre studier er nødvendig for å vurdere om variasjoner i signalintensitet korrelerer med histologiske endringer over tid, samt med økende alvorlighetsgrad av en gitt sykdom fenotype.
Bildeanalysealgoritmen har begrenset anvendelighet for bilder med artefakter som vil forstyrre avkastning og/eller referansevalg, ufullstendig visualisering av endokardielle kantlinjer eller generell dårlig kvalitet. Algoritmen kan kanskje ikke sammenligne myokard- og perikardområder av interesse nøyaktig når persentilverdier viser et ikke-lineært mønster ved gråtonetilordning, eller når utilstrekkelig dynamisk område brukes. Selv om slike tilfeller forventes å være sjeldne innenfor 10th til 90 persentilverdier av signalintensitet i de fleste fenotyper, foreløpig vurdering av backscatter linearitet og dynamisk område kan garanteres for å studere nye fenotyper av interesse og / eller analysere bilder ervervet ved hjelp av ukonvensjonelle ultralyd teknikker. Algoritmen er også begrenset av mangel på automatisering av ROI- og referanseprøvevalgprosessen. I tillegg har algoritmen begrenset kapasitet til bruk i krysssammenligninger av bilder tatt ved hjelp av markant forskjellige ekkokardiografiske anskaffelsesparametere. I den nåværende rapporten ble bilder hos mus anskaffet ved hjelp av en 18-38 MHz svinger med bildefrekvenser fra 225-247 fps; bilder hos mennesker ble anskaffet ved hjelp av en 1-5 MHz svinger med bildefrekvenser fra 34-54 fps. Videre studier er nødvendig for å bestemme mulige protokollrevisjoner som kan være nødvendig for bilder som er anskaffet ved hjelp av annet utstyr og med bildefrekvenser som er markert utover de ovennevnte rapporterte områdene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter er erklært.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for ressurser levert av Harvard Medical School / Brigham and Women's Hospital Cardiovascular Physiology Core Laboratory. Dette arbeidet ble delvis støttet av midler fra National Institutes of Health grants HL088533, HL071775, HL093148 og HL099073 (RL). MB var mottaker av en American Heart Association grunnlegger affiliate postdoctoral fellowship award. KU er mottaker av en American Heart Association grunnleggere affiliate postdoctoral fellowship award. SC ble støttet av en pris fra Ellison Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ v 1.46 | NIH (Bethesda, MD) | open access software | |
| Power ShowCase | Trillium Technology (Ann Arbor, MI) | commercial software |
References
- Yamada, S., Komuro, K. Integrated backscatter for the assessment of myocardial viability. Curr. Opin. Cardiol. 21, 433-437 (2006).
- Mimbs, J. W., O'Donnell, M., Bauwens, D., Miller, J. W., Sobel, B. E. The dependence of ultrasonic attenuation and backscatter on collagen content in dog and rabbit hearts. Circ. Res. 47, 49-58 (1980).
- Picano, E., et al. In vivo quantitative ultrasonic evaluation of myocardial fibrosis in humans. Circulation. 81, 58-64 (1990).
- Mizuno, R., et al. Myocardial ultrasonic tissue characterization for estimating histological abnormalities in hypertrophic cardiomyopathy: comparison with endomyocardial biopsy findings. Cardiology. 96, 16-23 (2001).
- Mizuno, R., Fujimoto, S., Saito, Y., Nakamura, S. Non-invasive quantitation of myocardial fibrosis using combined tissue harmonic imaging and integrated backscatter analysis in dilated cardiomyopathy. Cardiology. 108, 11-17 (2007).
- Marini, C., et al. Cyclic variation in myocardial gray level as a marker of viability in man. A videodensitometric study. Eur. Heart. J. 17, 472-479 (1996).
- Komuro, K., et al. Sensitive detection of myocardial viability in chronic coronary artery disease by ultrasonic integrated backscatter analysis. J. Am. Soc. Echocardiogr. 18, 26-31 (2005).
- Ciulla, M., et al. Echocardiographic patterns of myocardial fibrosis in hypertensive patients: endomyocardial biopsy versus ultrasonic tissue characterization. J. Am. Soc. Echocardiogr. 10, 657-664 (1997).
- Maceira, A. M., Barba, J., Varo, N., Beloqui, O., Diez, J. Ultrasonic backscatter and serum marker of cardiac fibrosis in hypertensives. Hypertension. 39, 923-928 (2002).
- D'Hooge, J., et al. High frame rate myocardial integrated backscatter. Does this change our understanding of this acoustic parameter. Eur. J. Echocardiogr. 1, 32-41 (2000).
- Finch-Johnston, A. E., et al. Cyclic variation of integrated backscatter: dependence of time delay on the echocardiographic view used and the myocardial segment analyzed. J. Am. Soc. Echocardiogr. 13, 9-17 (2000).
- Di Bello, V., et al. Increased echodensity of myocardial wall in the diabetic heart: an ultrasound tissue characterization study. J. Am. Coll. Cardiol. 25, 1408-1415 (1995).
- Takiuchi, S., et al. Quantitative ultrasonic tissue characterization can identify high-risk atherosclerotic alteration in human carotid arteries. Circulation. 102, 766-770 (2000).
- Querejeta, R., et al. Serum carboxy-terminal propeptide of procollagen type I is a marker of myocardial fibrosis in hypertensive heart disease. Circulation. 101, 1729-1735 (2000).
