Summary
本文显示了基于接种在细菌生物膜和专用磁镊子的发展原位测量由微生物在接口内置的复杂生命的物质的局部机械特性的磁性粒子的远程致动的原始方法。
Abstract
细菌粘附和生长在接口导致的立体异构结构的所谓的生物膜的形成。细胞蜗居在这些结构是由胞外聚合物网络介导的物理相互作用结合在一起。细菌生物膜的影响许多人的活动及其性质的理解是至关重要的一个更好的控制其发展 - 维护或消灭 - 这取决于它们的不利或有利的结果。本文介绍了一种新的方法，旨在原位测量已被生物膜的本地物理性质，到现在为止，只检查从宏观和均质材料的观点。这里描述的实验中涉及引入磁性颗粒进入生物膜生长的种子，可以在不干扰生物膜的结构特性被远程致动本地探针。专用的磁性镊子是德韦大步施加一个力定义嵌入式生物膜每个粒子。安装被安装在显微镜的阶段，以使粒子拉期间的时间推移的图像的记录。粒子轨迹然后从拉序列提取与本地粘弹性参数从每个粒子位移曲线得出，由此提供的参数的三维空间分布。获得见解生物膜的机械配置是必不可少但从工程师的角度对生物膜的控制目的，而且从基本面看，澄清的建筑特性和这些结构的具体生物学之间的关系。
Introduction
细菌生物膜与生物或人工表面1-3相关的细菌群落。他们被加上生产多糖丰富的细胞外基质，保护和稳定的大厦4,5的附着生长机制形成。这些生物膜是细胞不会粘到表面的简单被动的组合，但有组织的和动态的复杂的生物系统。当细菌从浮游切换到生物膜的生活方式，改变基因表达和细胞生理学观察以及增加对抗菌性和宿主免疫防御是在许多长期存在的慢性感染6的由来。然而，这些生活结构的控制发展还为工业和环境应用，如生物修复的危险废物的场所，生物过滤工业用水或形成生物屏障，以保护土壤和地下水康泰明机会通报BULLETIN。
而具体到生活的方式生物膜分子特征越来越描述，带动社区发展和持久性的机制尚不清楚。使用上，使用扫描电化学或荧光显微镜微尺度测量的最新进展，这些活组织已表明具有相当大的结构，化学和生物异质7。然而，到现在为止，生物膜力学一直主要研究宏观。例如，观察生物膜拖缆的变形，由于变化的流体流速8,9，生物膜件单轴压缩解除从琼脂培养基或生长在盖玻片10,11，生物膜从环境中收集的剪切，然后转移到一个并行板流变仪12,13，采用了玻璃珠和涂有细菌生物膜附着于AFM悬臂14或专用的磁墨字符识别的原子力显微镜ocantilever测定方法分离的生物膜片段15,16的拉伸强度在10过去几年已经实现，提供对材料17的粘弹性性质的有用信息。然而，这很可能是在原位生物膜的机械性能信息时，该材料是从它的天然环境中，这是经常在这些方法的情况下除去丢失。另外，生物膜的治疗，作为均质材料射门对社区内的物理性能的可能的异质性的信息。因此，在生物膜形成的结构力学和生物特性，如基因表达的图案化或化学梯度的确切含义也很难被确认。要对生物膜的物理性能的微观描述的进步，新的专用工具是必需的。
本文详细构思，以达到原始的方法测量的原位局部机械参数，而不会干扰生物膜和有利的微尺度材料性质的空间分布绘图，然后在机械异质性。该实验的原理建立在一个生长生物膜与磁性体微粒随后通过远程装入利用磁镊子的成熟生物膜中的掺杂。在显微镜下成像控制磁力应用质点位移使当地的黏弹性参数导出，每个粒子报告自己的本地环境。从这些数据中，生物膜的三维机械更新可以得出，揭示空间和环境条件的依赖性。整个实验将在这里展示在大肠杆菌被大肠杆菌生物膜通过基因工程菌株携带去阻遏的F-质粒一样做。在最近的一篇文章18所详述的结果提供了完整的生物膜力学的内部的独到眼光。
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Protocol
1，细菌培养及悬浮法制备
- 从溶原性肉汤（LB）琼脂平板上挑新鲜生长的菌落，接种在含有100μ微克/毫升氨苄青霉素和7.5μ克/毫升四环素的LB液体培养基中5毫升孵育它为5至6小时，在37℃上用颤抖的平台。
- 然后，在5毫升的最小培养基（M63B1），补充了0.4％葡萄糖和相同浓度的抗生素添加的细菌培养物100μ升。这孵育新鲜稀释的培养过夜，于37℃用颤抖的平台上。
- 16小时培养后，μL过夜培养增加100至5ml M63B1，0.4％葡萄糖。保持所述管在37℃至摇动平台，直到0.5外径为止。该悬浮液，然后准备好用于注射到对生物膜形成的实验通道。
2，磁粉制备
- 取10μl的磁性粒子 -2.8μ米直径-从股票和它们洗干净3倍于190微升基本培养基用磁性样品架的援助。
- 调整颗粒浓度为5×10 6珠/毫升。通常为50微升的洗涤珠溶液的混合与另外的950μ升M63B1用0.4％葡萄糖。
3，渠道准备和生物膜生长
- 通道安装
- 切两方（800μ米边长），硼硅玻璃毛细管长10厘米，以获得两个8厘米长的块。
- 胶水2的毛细管片上的两个载玻片-切成两半第一-相距2厘米与1厘米悬任一端上， 如图1使用速效氰基丙烯酸酯胶（所谓的超级胶水）。
- 高压处理整个设置和需要进行进一步的通道连接所需的管材。
- 聚集下的所有无菌材料在层流罩是：i）安装在通道和陷阱1，ⅱ）管和连接器，iii）该2气泡陷阱 - 泡沫过滤器通常用于保护儿童滴哺（陷阱1）和自制的气泡阱作为大直径的4厘米长的管子（陷阱2），IV）夹具，V）30毫升注射器装满M63B1，0.4％葡萄糖，及vi）废液瓶。
- 连接整个安装与鲁尔锁按以下顺序连接到电脑或或路口：50毫升M63B1注射器，注射泵，儿科泡沫过滤器，自制的泡沫陷阱，毛细管（ 图1，图B），管到废液瓶控制。然后填入安装用无菌M63B1，0.4％葡萄糖，以约10毫升/小时，比实验速率更高的速率打开注射泵。仔细地跟踪和消除电路中的所有气泡。
- 通过该系统为10-15分钟流动的介质;同时将1毫升细菌悬液在OD 0.5从第1.3用1毫升2.2节准备的冲珠液。
- 附加（但不要关闭）夹在油管在两个位置：前后毛细血管。切换流过。
- 引入细菌珠混合物进入毛细管用1毫升注射器自制泡沫陷阱后，小心地托起管端，以防止空气进入。重新连接油管，然后关闭夹子。
- 重复同样的步骤进行的第二毛细管和检查所有的管气泡。
- 该装置转移到显微镜，并允许它静置15-20分钟，以使细菌沉降并附着在毛细管的表面上。安装在毛细管上的显微镜载物台用在稍高的水平的废物容器中。放置在显微镜旁边的柜台上方的注射泵。毛细管比毛细管平面稍高捕捉气泡前提高了泡沫陷阱。
- 生物膜格罗问心无愧
- 通常在24或48小时在这些实验 - 调整在注射器泵的流速，并开始流动，生物膜现在将在规定期间开发的毛细管表面。
- 专注于毛细管底平面，并开始样品图像的时间间隔录制 - 2张图片通常是采集频率/分钟，会充分报告生物膜生长。此视频监视器生物膜生长后期控制（见中提取视频1，2和3）。
4，磁性镊子安装
- 拧上手动控制XYZ显微操作的磁性镊子和螺丝显微镜舞台上的显微操作来调整镊子的位置相对于毛细管。将镊子如在图2，以确保适当的磁场梯度是在观察区产生。
- 连接镊子吨Ø通过功率放大器函数发生器产生的时间40秒内由24秒零信号和16秒4的直流电用20秒的信号同步后发送到明视场光闸提供的序列触发事件，在图3中 。
注：这两个操作可以在毛细管的安装和测量开始之间的任何时间来实现。见实验概述草图如图4所示。
5，蠕变曲线收购
- 使用显微镜载物台的XY移动控制，使左侧的磁极，并在相同的观察视野的毛细血管的左手边缘的边缘。取分析参照的原点在x-和通过毛细管的边缘限定的y坐标轴的交点和磁极片的边缘上，分 别（ 见图2）。
- 用细焦点c调整毛细管的垂直位置显微镜的位置ONTROL旋钮。通常情况下，第一检测平面位于介于4至7μ米的毛细管底部的上方。 视频1对应于xy字段具有其顶部的左上角处的空间参照的原点。
- 触发通过对电流发生器，并在同一时间开关在4.2节和图3描述的事件的40秒的顺序，手动触发录像1的图像采集序列。
- 将毛细管的邻居右场由显微镜载物台的一个250μ米翻译到左边，并作为在第5.3节，以产生视频切片2的2等以获得所需的视频。为250×250μ 平方公尺通常为3至4场是沿改变平面并且重复相同的操作，对于新平面之前的x轴收集。
6。力校准
- 通过混合39.8克甘油与190μ升双蒸水和10微升的磁性颗粒在2×10 9个/毫升准备甘油溶液，并填写实验频道与此混合物，并把它放在显微镜载物台如对于生物膜样品。
- 安装磁性镊子如第4所示后，将在第5.4节所指示的磁力，使时间推移图像提取每个单粒子速度（v）和毛细管的位置，以获得校准文件。此文件应包含所施加的力作为其在毛细管分析的区域位置的函数，根据Stokes定律，F =6πRηv（R：颗粒半径）。
7。分析
- 使用“粒子跟踪器”的软件来获取文本文件，用于收购如第5所示的图像的所有堆在每一帧中颗粒归仓。使用设置克图像堆栈采集频率，计算颗粒的位移与时间的函数（ 例如， 图5和视频4）。
- ：根据符合公式使用强制校准文件，转换成位移曲线，以符合曲线（作为时间的函数的材料完全符合- -嘉（T））
这使材料应变之间的关系和所施加的应力为半径R的嵌入在一种不可压缩的，均匀的粘弹性介质如先前由Schnurr和同事19建立的探针粒子。 - 调整蠕变柔量曲线的粘弹性材料的一般Burgers模型，并推导出粘弹性参数，J 0，J 1，η0，η1为每个粒子（
注意：此现象学分析先前已经用于各种各样的材料，包括生物材料，例如生物膜来解释宏观流变数据20-22。
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Representative Results
一个典型的分析将提供粘弹性参数的空间分布上的一个活生生的生物膜微米尺度不影响到其原来的安排。典型的结果示于图7，其中J 0的值-弹性柔-被给定为z轴沿y轴沿生物膜的横向尺寸的深度和的函数。每个点对应的蠕变曲线分析提供了为J 0值珠子。数据显示，当地合规沿着生物膜的深度超过幅度近三个数量级，但也是强大的横向不均匀性变化发生在所有生物膜的高度。
该数据也给访问哪些在这里展出了广泛的和不对称的形状（ 图8），提供了强有力的迹象表明合规值的分布是生物膜的力学性能进行了支持高度交联的聚合物凝胶。实际上，类似的行为已经预先证明对浓缩和高度交联的肌动蛋白的凝胶23。
此外，这些中的不同的环境条件下进行的，例如较低的流速生物膜局部特性原位测量启用以证明在生物膜的内部组织这样的变化的影响。在图9中 ，以0.1毫升/小时生长的生物膜的顺应性值显示出仍然高度异质机械更新，但更深一层生物膜的任何更高的刚性相比，以1毫升/小时的生长生物膜。这些结果证明的外部条件对生物膜组织的显著影响。
图2。磁镊子相对于显微镜舞台上和空间参考的定义中的毛细管的定位的顶视图，表示用测量区域中的毛细管的位置。
图3。同步随着时间的40秒周期的信号。
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图4。实验概述草图。
图5。从粒子轨迹分析萃取物。图A显示在左边的典型颗粒的图像在刚刚磁力应用（时间23.79秒的40秒期间）前的初始位置，并在右侧的粒子的位置时间30秒，连同使用ImageJ粒子跟踪图B显示了从这些数据得出的位移曲线的情节中找到轨迹的显示;在这里我们展示一个轨迹提取物在开始时23.79秒最多时间t = 31.29秒的40秒的时期。
汉堡的唯象模型的基础上，如图6所示。粘弹性参数推导（A）汉堡力学模型由弹性虎克弹簧（j 0）和串联一个麦克斯韦元件（弹簧（牛顿粘壶（η0）的组合□1）和缓冲器（η1）并联）。 （ 二）蓝色蠕变实验跟踪与曲线（绿色）调整到Burgers方程。
图7。弹性柔度的下1毫升生长24小时，在37℃生物膜的空间分布/小时养分流动 。报告的每个粒子符合价值观这里被表示为使用冷色到暖色自定义颜色映射投影到（YZ）平面。报告由位于生物膜的底层颗粒遵守值都低于0.2米2 / N，而在高于1米2 / N。上部15μ米层报告值发现粒子
图8中的生物膜（A）和甘油（B）中得到的粘弹性参数，均匀的粘稠液体的归一化分布。生物膜表现出非对称分布范围广（3.6偏度和归一化方差2.4）表示的材料的异质性。相比之下，对称分布窄表征均匀介质中的甘油（0.23和归一化方差0.03偏斜度）获得。
图9。弹性柔顺的在0.1毫升/小时的营养素流更低的流动生长24小时后，在37℃的生物膜的空间分布。合格值根据生物膜的深度表示。符号的色彩给人的合规范围。
图10。磁极蓝图。尺寸给出厘米。
图11。磁镊子布线。 A组的尺寸侧视图-用来紧紧缠绕2,120圈铜线，并在它的中心插入软磁合金杆之前建立的电磁线圈（B组 ）。直流电流在线圈中供给所示图C限定磁极性。参见实验概述草图如图4所示。
视频1：该电影只显示注射的细胞-颗粒混合物在毛细管的后生物膜的初始阶段。采集频率为1张/秒，播放短片以10帧/秒。 请点击此处观看该视频。
视频2：这部电影显示经过4小时生长生物膜。颗粒逐渐从分派到B的表面分离 iofilm体积，蓝色箭头标记支队事件。采集频率为2图像/分钟和电影播放15帧/秒。 请点击此处观看该视频。
视频3：生物膜后20小时的增长。这部电影是采取位于20微米以上的毛细管底部的中间平面。被收购的2幅图像/分钟频率的图像和电影播放15帧/秒。 请点击此处观看该视频。
视频4：使用ImageJ典型粒子跟踪。这部影片展示了整个序列的起始时间23秒，在时间30秒结束的摘录。黄色的轨迹显示在磁驱动质点位移。采集频率为30帧/秒，播放短片以30帧/秒。https://www.jove.com/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video4.avi“目标=”_blank“>请点击此处观看该视频。
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Discussion
此磁性粒子播种和拉试验中的一个生长的生物膜在其原始状态下的粘弹性参数的原位三维测绘启用。这种方法揭示了大肠杆菌的力学性能不均匀性这里大肠杆菌生物膜的生长，给了线索指出生物膜元器件配套生物膜的物理性能，强烈暗示了细胞外基质的基本内涵和更精确的交联度。
在细菌生物膜的机械性能模式的识别是建立这些复杂的材料进行全面的代表性至关重要。这些发现开辟澄清联机械纹和生物异质性，如基因表达microniches，这应该有助于澄清的驱动力支撑生物膜发展的因果关系的方式。
到现在为止，生物膜机器人的问题nical物业已解决主要从宏观的角度，往往是从最初的网站8,9,12,13，它代表信息丢失的重要危险刮生物膜。我们的非侵入性的方法带来了首次在其原始环境中的生物膜3D机械配置的原位表征。
该方法还具有驻留在胶体探针的磁性遥控致动的特性的限制。事实上，它显示由极粒子的距离，极材料性能和线圈性能给出访问势力的固有范围。的设置当前配置启用刚性值高达200帕，这是足以让这里研究的生物膜探测。尽管如此，我们的设置进一步的工程 - 涉及，例如，电磁铁冷却 - 应以2〜3倍的能力和时间的限制转移。
WË目前正在就有关在生物膜调查报告的链接通过探头的被动位移在更大的时间尺度局部粘弹性参数的关系的物理和动力学性质。此外，我们正在探索关于它的机械配置针对生物膜的不同组成部分的各种化学物质的影响。
这种新的方法揭示了细菌生物膜内部机制的细节，有助于更好地理解这些活结构，关键但从工程师的角度对生物膜的控制目的，而且从基本面看，以澄清建筑性质和具体之间的关系生物学这些结构。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
这项工作是由来自法新社国立补助倒拉RECHERCHE，PIRIbio程序Dynabiofilm和法国国家科学研究中心的跨学科风险项目支持的一部分。我们感谢菲利普托门对他的批判的手稿和Christophe Beloin阅读提供了E。大肠杆菌菌株在这项工作中使用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and cells | |||
| Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter |
| Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline. | |
| Table 2: Capillaries and tubing | |||
| Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | |
| Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3 mm |
| Table 3: Biofilm growth | |||
| Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | Standard medium used to grow bacteria. |
| M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria. | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose. |
| Table 4: Electronics | |||
| Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | |
| Heater controller | World precision instruments | 300354 | |
| Function generator | Agilent technologies | 33210A | |
| Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | |
| Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | |
| Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | |
| Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | |
| Table 5: Optics | |||
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | |
| S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth. | |
| Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. |
| Table 6: Image analysis | |||
| ImageJ | NIH - particle tracker plugin | ||
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