Summary
本論文では、細菌バイオフィルムと、その場で界面で微生物によって構築された複雑な生活材料の局所的な機械的特性を測定するための専用の磁気ピンセットの開発に播種磁性粒子の遠隔操作に基づいて、元の方法論を示しています。
Abstract
インターフェイス上の細菌の付着と成長が3次元不均質な構造、いわゆるバイオフィルムの形成につながる。これらの構造の住居の細胞は、細胞外高分子物質のネットワークが介在する物理的な相互作用によって一緒に保持されている。細菌バイオフィルムは、多くの人間の活動に影響を与え、その性質を理解することは、彼らの開発のより良い制御のために重要である - 保守または根絶 - 彼らの有害または有益な結果に依存。本稿では、今まで、唯一の肉眼的および均質材料の観点から検討、 その場にあったバイオフィルムの局所的な物性を測定することを目指して新たな方法論を説明します。ここに記載された実験は、リモートでバイオフィルムの構造特性を乱すことなく作動させることができるローカルなプローブをシードする成長バイオフィルムに磁性粒子を導入することを含む。専用の磁気ピンセットDEVEたバイオフィルムに埋め込まれた各粒子に定義されている力を発揮するloped。セットアップは、粒子引上げ期間のタイムラプス画像の記録を可能にするために顕微鏡のステージに取り付けられている。粒子軌道はその後引っ張っ配列から抽出され、ローカル粘弾性パラメータは、これにより、パラメータの3次元空間分布を提供し、各粒子変位曲線から誘導される。バイオメカニカルプロファイルに洞察を得ることは、アーキテクチャの特性と、これらの構造の具体的な生物学の間の関係を明確にするために、バイオフィルム制御のためのビューの技術者の視点からだけでなく、根本的な観点から必要不可欠である。
Introduction
細菌バイオフィルムは、生物学的または人工表面1-3に関連する細菌の共同体である。彼らは建物4,5を保護し、安定化多糖類を多く含む細胞外マトリックスの生産と相まって接着成長機構によって構成している。これらのバイオフィルムは、表面に付着した細胞の単に受動的な集合体ではなく、組織化され、動的な複雑な生物系。細菌が浮遊性のバイオフィルムのライフスタイルに切り替えると、遺伝子発現および細胞生理の変化が観察されただけでなく、抗菌剤に対する耐性を増加させ、多くの持続的かつ慢性感染症6の原点にあること免疫防御をホストしている。しかし、これらの生活の構造の制御された開発はまた、有害廃棄物処理場のバイオレメディエーション、工業用水やcontaminから土壌·地下水を保護するためのバイオ障壁の形成のバイオろ過などの産業や環境のアプリケーションのための機会を提供ATION。
生活のバイオフィルム方法と特定の分子の機能がますます記載されているが、地域社会の発展と持続性を駆動するメカニズムは不明である。走査型電気化学または蛍光顕微鏡を用いてマイクロスケール測定に関する最近の進歩を用いて、これらの生体組織はかなりの構造的、化学的および生物学的な異質7を示すことが示されている。しかし、今までは、バイオメカニクスは、主にマクロ的に検討されている。例えば、バイオフィルムストリーマの観測は、流体の流量8,9の変化による変形、バイオフィルム片の一軸圧縮を寒天培地から持ち上げたり、カバーをして10,11、環境から収集されたバイオフィルムのせん断および並列に転送をスライド上で増殖プレートレオメーター12,13、AFMカンチレバー14または専用MICRに付着した細菌バイオフィルムとガラスビーズおよびコーティングを使用した原子間力分光法15,16は、材料17の粘弾性の性質に関する有用な情報を提供し、最後の10年間に実施されてきた離脱バイオフィルム断片の引張強度を測定する方法ocantilever。しかしながら、材料はしばしば、これらのアプローチであった場合、その天然の環境から取り出されたとき、その場バイオフィルムの機械的特性の情報が失われる可能性が高いようである。また、均質な材料としてバイオフィルムの治療は、コミュニティ内での物理的性質の可能性のある不均一性に関する情報をミス。したがって、構造バイオフィルム形成における力学とそのような遺伝子発現のパターニングまたは化学的勾配のような生物学的特性の正確な影響はほとんど認められないことができる。バイオフィルムの物理的性質のマイクロスケールの記述に向けて進行し、新たな専用のツールが必要です。
本論文では、達成するために考案さ独創的なアプローチを詳述バイオフィルムを妨害し、マイクロスケールの材料特性の空間分布の描画した後、機械的な不均一性を可能にすることなく、 その場での局所的な機械的パラメータの測定、。実験の原理は、成熟したバイオフィルムの磁気ピンセットを使用してリモートローディングが続く磁性微粒子と成長しているバイオフィルムのドーピングにかかっている。顕微鏡下で画像化され、制御磁気力作用下の粒子変位は、地元の粘弾性パラメータ導出、独自のローカル環境を報告し、各粒子を可能にします。これらのデータから、バイオフィルムの機械的な3Dプロファイルは、空間的および環境条件依存性を明らかにし、引き出すことができる。実験全体を大腸菌にここに表示されます大腸菌バイオフィルムは抑制解除のF様プラスミドを有する遺伝子改変株によって行われた。最近の論文18に詳細な結果は、無傷のバイオメカニクスの内部のユニークなビジョンを提供します。
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Protocol
1。細菌培養および懸濁製剤
- 溶原性ブロス（LB）寒天プレートから新鮮に成長したコロニーを選び、5ミリリットルで100μグラム/ mlのアンピシリンおよび7.5μグラム/ mlのテトラサイクリンを含む液体LB培地をそれに接種し、37℃のオンで5〜6時間のためにそれをインキュベート揺れプラットフォーム。
- その後、最小培地（M63B1）は0.4％グルコースと同じ抗生物質濃度を補っ5ミリリットル中の細菌培養の100μLを追加します。揺れプラットフォーム上で37℃で、この新たに希釈した培養を一晩培養する。
- インキュベーションの16時間後、5ミリリットルM63B1、0.4％グルコースに一晩培養μlの100を追加します。 0.5 ODに達するまで揺れプラットフォームに37℃でチューブを保管してください。サスペンションは、バイオフィルム形成のための実験チャネルに注入するための準備ができる。
2磁気粒子調製
- 10μlの磁性粒子を取る -直径2.8μM -在庫から、それらを磁気サンプルラックを用いて190μlの最小培地中で3倍洗う。
- 5×10 6ビーズ/ mlに粒子濃度を調整します。典型的に洗浄し、ビーズ溶液の50μlを、0.4％グルコースを有するM63B1のさらなる950μリットルと混合される。
3。チャンネルの調製とバイオフィルムの成長
- チャンネル取り付け
- 2長さ8cmの部分を得るために長さ10cm 2の正方形（800μmの辺の長さ）ホウケイ酸ガラスキャピラリーを切った。
- 最初の半分にカット- - （SOスーパーグルーと呼ばれる）即効性シアノアクリレート接着剤を使用して、図1のように、どちらかの端に1cmのオーバーハングとは別に2センチメートル2枚のスライドガラス上に2つのキャピラリー部分を接着します。
- 全体のセットアップと、さらにチャネル接続に必要な必要なチューブをオートクレーブ。
- 下のすべての無菌材料を集める層流フード：I）を搭載し、チャネルとトラップ1、II）、チューブやコネクタ、III）2バブルトラップ - バブルフィルタは一般的に子供の点滴送り（トラップ1）と自家製気泡トラップを保護するために使用大きな直径の長さ4cmの管（トラップ2）のような、iv）のクランプ、v）をM63B1、0.4％グルコース、およびvi）廃液ボトルが充填された30ミリリットルの注射器。
- 廃液ボトルにシリンジポンプ、小児バブルフィルタ、自家製の気泡トラップ、キャピラリー（ 図1、パネルB）、チューブによって制御さ50ミリリットルM63B1注射器：次の順序でルアーロックconnectersまたは接合を有する全体のセットアップを接続します。その後、約10ミリリットルの実験の料金よりも高く/時の速度でシリンジポンプの電源を入れる、無菌M63B1、0.4％グルコースをセットアップを埋める。慎重に追跡し、回路内のすべての気泡を除去する。
- 10〜15分間システムを介してメディアを流す。同時にセクションからOD 0.5で細菌懸濁液1mlをミックス2.2節で作成洗浄ビーズ溶液1mLで1.3。
- 前後の毛細血管：添付します（ただし、閉じないでください）2の位置でチューブにクランプします。流れを切ります。
- ホーム管は空気流入を防止するために、終了まで保持するように注意しながら、1ミリリットルの注射器を使用して気泡トラップを作った後にキャピラリーに細菌 - ビーズ混合物をご紹介します。チューブを再び取り付けてからクランプを閉じます。
- 第2の毛管のために同じ手順を繰り返し、気泡のためのすべてのチューブをご確認ください。
- 顕微鏡に装置を転送し、それを解決し、キャピラリーの表面に付着する細菌を可能にするために15〜20分間放置する。わずかに高いレベルでの廃棄物容器に顕微鏡ステージ上に毛細血管をインストールします。顕微鏡の横のカウンターの上にシリンジポンプを配置します。気泡を捕捉する毛管面よりもわずかに高い毛管前に気泡トラップを上昇させる。
- バイオフィルムグロWTH
- シリンジポンプでの流量を調整し、フローを開始し、バイオフィルムは現在、必要な期間の間にキャピラリー表面に発展する - これらの実験では、通常は24または48時間。
- キャピラリー底面に焦点を当て、サンプル画像のタイムラプス撮影を開始 - 2画像の通常取得頻度/分を十分にバイオフィルムの成長を報告します。このビデオモニター、バイオフィルムの成長後のコントロール（ ビデオ1、2および3の抽出を参照してください）。
4。磁気ピンセットのインストール
- 手動で制御のXYZマイクロマニピュレータ上の磁気ピンセットをねじ込み、比較的毛細血管にピンセットの位置を調整する顕微鏡ステージ上でマニピュレーターをねじ込みます。適切な磁場勾配が観察ゾーンにおいて生成されていることを確認するために、図2のようにピンセットを置く。
- ピンセットをTに接続するO電力増幅器を介してファンクション·ジェネレータは、24秒でゼロ信号及び4の配列を提供する信号同期のための20秒後に明視野光シャッターに送られ、トリガとの直接的な電流の16秒からなる時間の40秒の周期を生成する図3のようなイベント。
注：これらの2つの操作は、キャピラリーのインストールと測定開始までの任意の時点で達成することができる。 図4の概要スケッチを試して参照してください。
5。クリープ曲線取得
- 左側の磁極と同じ観察視野内の毛細血管の左端の端を持って来るために顕微鏡ステージのXY移動コントロールを使用します。 （ 図2参照）は、それぞれ、毛細管の端部によって規定されるx軸およびy軸の交点と磁極片の端部で解析参照の起源を取る。
- ファインフォーカスcを用いてキャピラリーの垂直位置を調整する顕微鏡位置のontrolつまみ。通常、最初に検査面はμ4から7の間メートルキャピラリー底部の上方に位置しています。 ビデオ1は、空間参照の原点にその左上隅を持つXYフィールドに対応しています。
- ビデオ1の画像取得シーケンスをトリガ手動で、電流発生器に同時に切り替えることにより、セクション4.2および図3に記載されたイベントの40秒シーケンスをトリガする。
- 左に顕微鏡ステージの250μmの翻訳で隣人右のフィールドに、キャピラリを移動し、スライス2のビデオ2を生成するというように、必要なビデオを得るために、セクション5.3のように動作します。 250×250μm 2の典型的に3〜4のフィールドは平面を変更し、新たな面に対して同じ動作を繰り返す前に、x軸に沿って収集される。
6。フォースキャリブレーション
- 双方向の蒸留水190μLと2×10 9個/ mlの磁性粒子の10μlのグリセロールの39.8グラムを混合することによってグリセロール溶液を調製し、この混合物を用いて実験的なチャネルを記入し、顕微鏡のステージ上に置きますバイオフィルム試料から調製した。
- セクション4に示すように、磁気ピンセットをインストールした後、5.4節に示されているように、磁力を適用し、キャリブレーションファイルを導き出すために、毛細管内の各単一粒子速度（V）とその位置を抽出するために、タイムラプス画像を作る。このファイルには、キャピラリの分析ストークスの法則によると、F =6πRηv（：粒子の半径R）のゾーン内の位置の関数として加えられた力が含まれている必要があります。
7。分析
- セクション5に示すように取得された画像のすべてのスタックの各フレーム内のパーティクルの位置でテキストファイルを取得するために「粒子トラッカー」ソフトウェアを使用してください。使うgの画像スタック取得周波数は、時間の関数としての粒子変位（ 例えば、 図5およびビデオ4）を計算する。
- フォースキャリブレーションファイルを使用して、コンプライアンス曲線に変位曲線を変換する（材料の全コンプライアンス- J（t）は、 -時間の関数として）コンプライアンス式に従って。
これは、材料の歪みとの関係を与え、予めSchnurr及び共同研究者19によって確立された非圧縮性の、均質な粘弾性媒体に埋め込 まれた半径Rのプローブ粒子のために応力を印加する。 - 粘弾性材料のための一般的なバーガーモデルにクリープコンプライアンス曲線を調整し、粘弾性パラメータを導出、J 0、J 1、0η、各粒子のためのη1（
注：この現象論的分析は、以前はそのような巨視的なレオロジーデータ20-22を解釈するバイオフィルムのような生物学的材料を含む広範囲の材料のために採用されている。
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Representative Results
典型的な分析は、元の配置を乱すことなく、生きている生物膜上にミクロンスケールでの粘弾性パラメータの空間分布を提供する。弾性コンプライアンス- -深さに沿っおよびバイオフィルムの横方向寸法に沿ってy軸、z軸の関数として与えられる典型的な結果は、J 0の値は、図7に示されている。各ポイントは、クリープ曲線分析は、J 0の値を提供したビーズに対応している。データは、ほぼ3桁以上のバイオフィルムの深さに沿って地元のコンプライアンスが変化していることを明らかにしただけでなく、その強い横異質性は、すべての生物膜の高さで行われた。
データはまた、バイオフィルムの機械的特性によって支持されたという強い指示を与える、ここに広範で非対称な形状（ 図8）を示したコンプライアンス値の分布へのアクセスを与え非常に高分子ゲルを架橋。実際、類似の挙動は、以前に濃縮され、高度に架橋されたアクチンゲル23で実証されている。
また、このような低流量のような異なる環境条件下で行わこれらのバイオフィルムのインサイチュ測定の局所的特性は、バイオフィルム内部組織に対するそのようなバリエーションの効果を実証することができます。 図9では、0.1ミリリットル/時間で成長させたバイオフィルムのコンプライアンス値は、1ミリリットル/時間で成長させたバイオフィルムと比較してまだ非常に不均一な機械的プロファイルより深いバイオフィルム層のno高い剛性を示した。これらの結果は、バイオフィルムの組織の外部の条件の重大な影響を示した。
図2。顕微鏡ステージと空間参照の定義上の毛細血管に対する磁気ピンセットの位置づけ。平面図は、毛細管内の測定ゾーンの位置を示している。
図3。時間の40秒の期間にわたって信号の同期。
857/50857fig4.jpg "/>
図4。概要スケッチを試してみてください。
図5。粒子軌道解析から抽出されます。パネルAは単に磁力アプリケーション（40秒周期の時間23.79秒）の前に、右での粒子の位置を初期位置に典型的な粒子の画像の左に示しています一緒ImageJの粒子トラッカーを使用して見つかった軌跡の表示に時間が30秒パネルBは、これらのデータから得られた変位曲線のプロットを示す。ここでは、時刻tに一度に23.79秒の起動弾道エキスを表示= 40秒周期の31.29秒。
図6。バーガーの現象論的モデルに基づいて粘弾性パラメータ導出。（A）バーガー弾性フックの春（J 0）の組み合わせで構成される機械的モデルとニュートンダッシュポット（η0）マクスウェル要素（春（と直列にJ 1）とダッシュポット（η1）並行して）。 （B）バーガー式に調整（緑色）の曲線と一緒に青色で実験的なトレースをクリープ。
図7。1ミリリットル/時の栄養分の流れの下で37℃で24時間後に成長したバイオフィルムにおける弾性コンプライアンスの空間分布 。各粒子によって報告されたコンプライアンス値カスタムカラーマップを暖めるためにクールを使用して（YZ）面上への投影としてここに表現されます。粒子は1メートル2 / N以上の上位15μmの層の報告値で見ながら、バイオフィルムの最下層に位置する粒子によって報告されたコンプライアンス値はすべて0.2メートル2 / Nよりも低くなってい
図8で得られた正規化されたバイオフィルムの粘弾性パラメータの分布（A）およびグリセロール（B）、均質な粘性の液体。バイオフィルムは、材料の不均一性を示す非対称と広い分布（3.6および2.4の正規化された分散歪度）を示した。対照的に、対称かつ均一な媒体を特徴づける狭い分布グリセロール（0.23および0.03の正規化された分散歪度）で得られた。
図9は、0.1ミリリットル/時間の栄養素流の低流量で37℃で24時間増殖させたバイオフィルムにおける弾性コンプライアンスの空間分布。コンプライアンス値は、バイオフィルムの深さに応じて表されている。シンボルカラーは、コンプライアンス範囲を与える。
図10。磁極青写真。寸法はcm単位で与えられている。
図11。磁気ピンセット配線。 パネルAの寸法は側面図は-しっかりと銅線の2120ターンを巻き付け、その中心部に軟磁性合金ポールを挿入する前に、磁気コイル（ パネルB）を構築するために使用されている。直流電流は、 パネルCに示すように、磁気極性を規定するコイルに供給される。 図4に概要スケッチをも試して見る。
ビデオ1：この映画は単にキャピラリー中の細胞-粒子混合物の注射後のバイオフィルムの初期段階を示している。取得頻度は、1画像/秒で、映画は10フレーム/秒で再生されます。 このビデオを見るにはここをクリックしてください。
ビデオ2：この映画は、4時間の成長後にバイオフィルムを示しています。粒子は徐々にBに分配される表面から剥離される iofilmボリューム、青の矢印は、剥離のイベントをマーク。取得頻度は、図2のイメージ/分で、映画は15フレーム/秒で再生される動画をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ビデオ3：バイオ20時間の成長後。映画は20ミクロンのキャピラリーの底の上に位置する中央面に取り込まれる。画像は2枚/分の周波数で取得した、映画は15フレーム/秒で再生されます。 このビデオを見るにはここをクリックしてください。
ビデオ4：ImageJのを使用する典型的な粒子追跡。映画は一度に23秒を開始し、一度に30秒の終了シーケンス全体の抽出物を示しています。黄色の軌跡は、磁気作動時に粒子変位を示している。取得頻度は、30枚/秒、映画は30フレーム/秒で再生されている。https://www.jove.com/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video4.avi "ターゲット=" _blank ">この番組をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この磁性粒子は、播種し、元の状態で成長しているバイオフィルムの粘弾性パラメータをその場で 3Dマッピングで有効になって実験を引っ張って。このアプローチは、Eの機械的な不均一性を明らかにした大腸菌バイオフィルムは、ここで増殖させ、細胞外マトリックスに強く、より正確には架橋の程度の基本的な意味を示唆し、バイオフィルムの物理的特性を支持するバイオフィルムの成分を指摘する手がかりを与えた。
細菌バイオフィルムでの機械的性質のパターンの認識は、これらの複雑な材料の総合的な表現を構築するために重要です。これらの知見は、機械的なパターンや、バイオフィルムの開発を支える原動力の明確化に役立つはずの遺伝子発現microniches、のような生物学的不均一を結ぶ因果関係を明確にする道を開く。
これまで、バイオメカの質問nicalプロパティは、ビューのマクロな観点から、主に対処し、多くの場合、情報損失の重要なリスクを表し、その最初のサイト8,9,12,13からバイオフィルムを削っていた。当社の非侵襲的な方法は、その元の環境におけるバイオフィルム、3Dメカニカルプロフィールのその場での特性評価の最初もたらす。
アプローチはまだコロイド状プローブの磁気遠隔操作の特性に存在する制限があります。実際、ポール粒子間距離、ポール材料特性とコイルの性能によって与えられたアクセス可能な力の本質的な範囲を表示します。セットアップの現在の構成は、ここで検討し、バイオフィルムのために十分であった200 Paで、最大の剛性値のプロービングを可能にしました。それにもかかわらず、私たちのセットアップをさらにエンジニアリング - 、例えば、電磁石の冷却に関連するが - 2から3倍の力と時間の制限のシフトを有効にする必要があります。
WEは現在、より大きな時間スケールでのプローブの受動的な変位によって報告された地元の粘弾性パラメータをリンク関係を調査し、バイオフィルム内の物理的および力学的特性に関連に取り組んでいます。加えて、我々はその機械のプロファイル上のバイオフィルムのさまざまなコンポーネントを対象とした様々な化学物質の影響を模索している。
この新しいアプローチは、アーキテクチャの特性と特定の関係を明確にするために、バイオフィルム制御のためのビューの技術者の視点からも根本的な観点から重要な、細菌性バイオフィルム内部力学の詳細を明らかにし、これらの生体構造のより良い理解に貢献するこれらの構造の生物学。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作業は、部分的には通信社国立からの補助金によって支えられてLAルシェルシュ、PIRIbioプログラムDynabiofilmを注ぎ、CNRS学際リスクプログラムから。我々は、 大腸菌を提供するための原稿の彼の重要な読書のためのフィリップThomenとクリストフBeloinに感謝本研究で使用した大腸菌株 。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and cells | |||
| Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter |
| Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline. | |
| Table 2: Capillaries and tubing | |||
| Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | |
| Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3 mm |
| Table 3: Biofilm growth | |||
| Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | Standard medium used to grow bacteria. |
| M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria. | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose. |
| Table 4: Electronics | |||
| Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | |
| Heater controller | World precision instruments | 300354 | |
| Function generator | Agilent technologies | 33210A | |
| Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | |
| Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | |
| Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | |
| Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | |
| Table 5: Optics | |||
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | |
| S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth. | |
| Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. |
| Table 6: Image analysis | |||
| ImageJ | NIH - particle tracker plugin | ||
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