Summary
Detta dokument visar en originell metod som bygger på fjärrmanövreringen av magnetiska partiklar sådda i en bakteriell biofilm och utvecklingen av dedikerade magnetiska pincett för att mäta på plats den lokala mekaniska egenskaper i den komplexa levande material byggd av mikroorganismer vid gränssnitten.
Abstract
Bakteriell vidhäftning och tillväxt på gränssnitten leda till bildning av tredimensionella heterogena strukturer så kallade biofilms. Cellerna som håller till i dessa strukturer hålls samman genom fysikaliska växelverkningar som medieras av ett nätverk av extracellulära polymera substanser. Bakteriella biofilmer påverkar många mänskliga aktiviteter och förståelsen av deras egenskaper är avgörande för en bättre kontroll av deras utveckling - underhåll eller utrotning - beroende på negativ eller positiv utgång. Detta dokument beskriver en ny metod som syftar till att mäta på plats den lokala fysiska egenskaper biofilmen som varit hittills undersökt endast från en makroskopisk och homogent material perspektiv. Experimentet som beskrivs här består i att införa magnetiska partiklar i en växande biofilmen på utsäde lokala prober som kan fjärr manövreras utan att störa de strukturella egenskaperna hos biofilmen. Dedikerade magnetiska pincett var utveckvecklade för att utöva en bestämd kraft på varje partikel inbäddad i biofilmen. Konfigurationen är monterad på scenen av ett mikroskop för att möjliggöra registrering av tidsförlopp bilder av den partikel dragande perioden. Partikel banor är sedan utvinns ur dragsekvensen och de lokala viskoelastiska parametrar härrör från varje partikel förskjutningskurvan, vilket ger 3D-rumsliga fördelningen av parametrarna. Att få insikt i biofilmen mekaniska profilen är viktigt ur en ingenjör synvinkel för biofilm kontrollsyfte, men också från en grundläggande perspektiv för att klargöra förhållandet mellan de arkitektoniska egenskaper och den specifika biologin av dessa strukturer.
Introduction
Bakteriella biofilmer är samhällen av bakterier som följer med biologiska eller artificiella ytor 1-3. De bildas genom en vidhäftningstillväxtmekanism i kombination med framställning av polysackarid-rik extracellulär matris som skyddar och stabiliserar den byggnad 4,5. Dessa biofilmer är inte bara passiva assemblage av celler fastnat på ytor, men organiseras och dynamiska komplexa biologiska system. När bakterier byter från plankton till biofilmen livsstil, förändringar i genuttryck och cellfysiologi iakttas samt ökad resistens mot antimikrobiella och värd immunförsvar vara till grund för många långlivade och kroniska infektioner 6. Men en kontrollerad utveckling av dessa levande strukturer erbjuder även möjligheter för industri-och miljöapplikationer, till exempel biologisk rening av farligt avfall platser, bio-filtrering av industrivatten eller bildning av biologiska barriärer för att skydda mark och grundvatten från förorenade områdenation.
Medan molekylära egenskaper som är specifika för biofilm livsstil allt oftare beskrivs, de mekanismer som driver samhällsutvecklingen och uthållighet fortfarande oklara. Med hjälp av de senaste framstegen på mikroskala mätningar med hjälp av scanning elektrokemiska eller fluorescensmikroskopi, har dessa levande organisationer visat sig uppvisa betydande strukturell, kemisk och biologisk heterogenitet 7. Men fram till nu, biofilm mekanik har huvudsakligen undersökts makroskopiskt. Exempelvis observation av biofilm streamers deformation på grund av variationer i fluidflödeshastigheter 8,9, enaxlig kompression av biofilm bitar lyfta från agarmedium eller odlas på täckglas 10,11, skjuvning av biofilm uppsamlades från omgivningen och överförs sedan till en parallell tallrik reometer 12,13, atomkrafts spektroskopi med hjälp av en glaspärla och belagd med en bakteriell biofilm bifogas en AFM fribärande 14 eller en dedikerad MICRocantilever metod för mätning av draghållfasthet av fristående biofilmfragment 15,16 har genomförts under de tio senaste åren, att ge användbar information om den viskoelastiska materialets natur 17. Men det verkar troligt att information om in situ biofilm mekaniska egenskaper förloras när materialet tas bort från dess naturliga miljö, vilket ofta är fallet i dessa metoder. Dessutom är behandlingen av den biofilm som ett homogent material missar informationen om eventuell heterogenitet av de fysiska egenskaperna i samhället. Därför kan de exakta konsekvenserna av strukturmekanik i biofilmbildning och biologiska egenskaper såsom genuttryck mönstring eller kemiska gradienter knappast erkännas. Framsteg mot ett mikro beskrivning av biofilm fysikaliska egenskaper, nya dedikerade verktyg behövs.
Detta dokument detaljer ett original metod utformades för att uppnåmätning av lokala mekaniska parametrar in situ utan att det stör biofilmen och möjliggör ritning av den rumsliga fördelningen av de mikroskala materialegenskaper och sedan den mekaniska heterogenitet. Principen av experimentet vilar på dopning av en växande biofilmen med magnetiska mikropartiklar följt av deras fjärrladdning medelst magnetiska pincett i den mogna biofilm. Partikel förskjutning under kontrollerade magnetiska kraften ansökan avbildas i mikroskop möjliggör lokala viskoelastiska parametrar härledning, varje partikel rapporterar sin egen närmiljö. Från dessa data kan den 3D mekaniska profilen av biofilmen dras, avslöjar rumsliga och goda miljöförhållanden beroenden. Hela experimentet kommer att visas här på ett E. coli biofilm görs av en genetiskt modifierad stam bär en derepressed F-liknande plasmid. Resultaten beskrivs i en nyligen papper 18 ger en unik vision av det inre av intakta biofilm mekanik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakterier Kultur och Suspension Förberedelse
- Pick a nyligen odlas koloni från en Lysogeny Broth (LB)-agarplatta inokuleras den i 5 ml flytande LB-medium innehållande 100 μ g / ml ampicillin och 7,5 μ g / ml tetracyklin och inkubera det i 5 till 6 timmar vid 37 ° C på en platta.
- Sedan till 100 μ liter av bakteriekulturen i 5 ml minimal-medium (M63B1) kompletterat med 0,4% glukos och samma antibiotikakoncentrationer. Inkubera detta nyligen utspädd kultur över natten vid 37 ° C på en platta.
- Efter 16 h av inkubationen, tillsätt 100 | il av övernattskultur av 5 ml M63B1, 0,4% glukos. Håll röret vid 37 ° C till det skakande plattform tills en 0,5 OD nås. Suspensionen är sedan klar för injektion i experimentet kanal för biofilmsbildning.
2. Magnetpulver Förberedelse
- Ta 10 pl magnetiska partiklar -2,8 μ meter i diameter - från lager och tvätta dem 3x i 190 l minimal medium med hjälp av en magnetisk provställ.
- Justera koncentrationen partikel till 5 x 10 6 pärlor / ml. Typiskt 50 ul av den tvättade pärlan lösningen blandas med en ytterligare 950 μ liter M63B1 med 0,4% glukos.
3. Channel Förberedelse och Biofilm tillväxt
- Kanal Monterings
- Skär två kvadrat (800 μ m sidolängd) borosilikatglas kapillärerna 10 cm lång för att erhålla två 8 cm långa bitar.
- Limma de två kapillär bitar på två glasskivor - halveras först - 2 cm från varandra med 1 cm överhäng på någon sida som i figur 1 med en snabbverkande cyanoakrylatlim (så kallad super-lim).
- Autoklav hela installationen och den nödvändiga slangar som krävs för ytterligare kanalanslutning.
- Samla alla sterila material underett laminärt flöde huva: i) monterade kanal och fälla 1, ii) att slangar och kopplingar, iii) de två bubbelfällor - bubblan filtret används vanligen för att säkra barnens dropp-matning (fälla 1) och den hemlagade bubbelfälla som ett 4 cm långt rör med större diameter (fälla 2), iv) klämmor, v) 30 ml sprutor fyllda med M63B1, 0,4% glukos, och vi) avfallsflaskan.
- Anslut hela installationen med Luer Lock connecters eller korsningar i följande ordning: 50 ml M63B1 spruta kontrolleras av sprutpumpen, pediatrisk bubbla filter, hemlagad bubbelfälla, kapillär (Figur 1, panel B), och röret till avfallsflaskan. Fyll sedan installationen med steril M63B1, 0,4% glukos, sätta på sprutpumpen med en hastighet av cirka 10 ml / timme, högre än de experimentella priser. Noggrant spåra och eliminera alla bubblor i kretsen.
- Flöde mediet genom systemet för 10-15 min; samtidigt blanda 1 ml av bakteriesuspension vid OD 0,5 från avsnitt1.3 med 1 ml av den tvättade pärla lösningen framställd i avsnitt 2.2.
- Fäst (men inte stänga) klämmor till slangen vid två lägen: före och efter kapillärerna. Stäng av flödet av.
- Introducera den bakteriella-pärla blandningen i kapillär efter hemgjorda bubbelfälla med hjälp av en 1 ml spruta, var noga med att hålla upp röret slutar att förhindra luft posten. Sätt tillbaka slangen och stäng klämmorna.
- Upprepa samma procedur för den andra kapillär och kolla alla rör för bubblor.
- Överför apparaten till mikroskopet och låt den stå i 15 till 20 minuter för att göra det möjligt för bakterierna att sätta sig och fäster till ytan av kapillären. Installera kapillären på mikroskop scenen med avfallsbehållaren på en något högre nivå. Placera sprutpumpen på bänk bredvid mikroskopet. Höj bubbelfälla innan kapillären något högre än kapillären planet för att fånga bubblor.
- Biofilm Growth
- Justera flödeshastigheten på sprutpumpen och starta flödet kommer biofilmen nu utvecklas på den kapillära ytan under den tid som krävs - vanligtvis 24 eller 48 h i dessa experiment.
- Fokus på det kapillära bottenplanet och starta time-lapse inspelning av bildexemplen - vanligen en förvärvsfrekvens på 2 bilder / min kommer på lämpligt sätt rapportera biofilmen tillväxt. Denna videomonitorer biofilmstillväxt efterkontroll (se utdrag i Videos 1, 2 och 3).
4. Magnetiska pincett Installation
- Skruva de magnetiska pincett på manuellt styrda XYZ mikromanipulatorer och skruva fast micromanipulators på mikroskop scenen för att justera positionen av pincetten relativt till kapillär. Placera pincett som i figur 2 för att säkerställa lämplig magnetfältsgradienten genereras i observationszonen.
- Anslut pincett to funktionsgeneratorn via effektförstärkaren för att generera en 40 sek tid gjort av 24 sek nollsignal och 16 sekunder av 4 A likström med en trigger skickas till den ljusa fältet ljus slutaren efter 20 sek för synkroniseringssignal som ger en sekvens av händelser som i figur 3.
Anm: Dessa två operationer kan uppnås när som helst mellan kapillär installation och mätning början. Se experimentera översikt skiss i figur 4.
5. Creep Curve Acquisition
- Använd xy rörelsekontroll av mikroskop scenen för att ta kanten av den vänstra magnetiska polen och den vänstra kanten på kapillär i samma observationsfältet. Ta ursprunget till analysreferens i skärningspunkten mellan x-och y-axlarna definieras av kanten på kapillär och kanten på polstycket, respektive (se figur 2).
- Justera den vertikala positionen för kapillär med fin fokus cONTROL vredet mikroskopets position. Vanligtvis det första undersökte planet ligger mellan 4 till 7 μ m över kapillär botten. Video 1 motsvarar xy fält som har sin övre vänstra hörnet till grund för den rumsliga refererande.
- Utlösa 40 sek sekvens av händelser som beskrivs i avsnitt 4.2 och figur 3 genom att slå på strömgeneratorn och på samma gång, utlösa bild förvärv sekvens Video 1 manuellt.
- Flytta kapillär till grannen högra fältet med 250 μ m översättning av mikroskop scenen till vänster och fungera som i avsnitt 5.3 för att generera video 2 av segment 2 och så vidare för att få de nödvändiga videoklipp. Normalt 3 till 4 områden av 250 x 250 μ m 2 samlas längs x-axeln innan du byter plan och upprepa samma operationer för det nya planet.
6. Force Kalibrering
- Bered en glycerollösning genom att blanda 39,8 g glycerol med 190 μ l bi-destillerat vatten och 10 pl magnetiska partiklar på en 2 x 10 9 partiklar / ml och fyll upp en experimentkanal med denna blandning och placera den på mikroskop scenen såsom beskrivits för biofilmsprovet.
- När du har installerat de magnetiska pincett som anges i avsnitt 4, tillämpa den magnetiska kraften som anges i avsnitt 5.4 och gör time-lapse bilder för att extrahera varje enskild partikelhastighet (v) och dess position i kapillär för härledning av kalibreringsfilen. Filen ska innehålla den anbringade kraften som en funktion av sin position i zonen för analysen av kapillär enligt Stokes lag, F = 6πRηv (R: radien för partikeln).
7. Analys
- Använd ett program "partikel tracker" för att få textfiler med partikelpositioner i varje ram för alla högar av bilder som förvärvats som anges i avsnitt 5. Using bild stacken förvärvsfrekvens, beräkna partikelförskjutning som funktion av tiden (t.ex. Figur 5 och Video 4).
- Med hjälp av kraften kalibreringsfil, konvertera förskjutningskurvor till efterlevnad kurvor (total efterlevnad av materialet - J (t) - som en funktion av tid) enligt efterlevnaden formel:
som ger sambandet mellan material-stam och pålagd spänning för en sond partikel med radien R inbäddade i en inkompressibel, homogen viskoelastiska mediet som tidigare har fastställts genom Schnurr och medarbetare 19. - Justera krypefterlevnadskurvorna till den allmänna hamburgare modell för viskoelastiska material och härleda de viskoelastiska parametrar, J 0, J 1, η 0, η 1 för varje partikel (
OBS: Denna fenomenologisk analys har tidigare använts för en mängd olika material, inklusive biologiskt material som biofilmer att tolka makroskopiska reologi uppgifter 20-22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En typisk analys kommer att ge den geografiska fördelningen av de viskoelastiska parametrar i micron skala på en levande biofilm utan att störa den ursprungliga arrangemang. Typiska resultat visas i fig 7 där värdena på J 0 - det elastiska iakttagen - anges som en funktion av z-axeln längs djupet och av y-axeln längs en tvärgående dimensionen av biofilmen. Varje punkt motsvarar en pärla som krypkurva Analysen har givit J 0 värde. Data visade att lokala överensstämmelse varierade längs djupet i biofilmen över nästan tre storleksordningar men också att en stark lateral heterogenitet ägde rum på alla biofilm höjder.
Uppgifterna gav också tillgång till fördelningen av efterlevnad värden som uppvisade här en utbredd och asymmetrisk form (Figur 8), som ger starka indikationer på att mekaniska egenskaper biofilmen stöddes avhöggradigt tvärbundna polymer geler. Faktum är analogt beteende tidigare visats på koncentrerade och mycket tvärbundna aktin geler 23.
Dessutom är dessa in situ mätningar av biofilm lokala egenskaper som utförs under olika miljöförhållanden som t.ex. lägre flöde gör det möjligt att visa effekten av sådan variation på biofilmen interna organisationen. I fig. 9, compliance värden av en biofilm odlades vid 0,1 ml / h uppvisade en fortfarande mycket heterogen mekanisk profil men inte högre styvhet hos djupare biofilmskiktet jämfört med biofilmen odlas vid en ml / timme. Dessa resultat visade på betydande inverkan på de yttre förhållandena på biofilmen organisationen.
Figur 2. Positionering av de magnetiska pincett med avseende på kapillären på mikroskopställningen och definition av det rumsliga refererande. The toppvy indikerar positionen för mätningszonen i kapillären.
Figur 3. Synkronisering av signaler över 40 sek tidsperiod.
857/50857fig4.jpg "/>
Figur 4. Experiment översikt skiss.
Figur 5. Utdrag ur partikel bana analys. Panel A visar på den vänstra bilden av en typisk partikel vid sitt ursprungliga läge precis innan magnetisk kraft ansökan (tid 23.79 sek på 40 sek perioden) och till höger position partikeln vid tid 30 sek tillsammans med visningen av banan hittade med ImageJ partikel tracker Panel B visar handlingen i kurvan förskjutning från dessa data.; Här visar vi en bana extrakt börjar vid tiden 23,79 sek upp till tiden t = 31,29 sek i 40 sek perioden.
Figur 6. Viskoelastiska parameter härledning på basis av den fenomenologisk modell av Burger. (A) Burgers mekanisk modell som består i en kombination av elastiskt Hookean fjäder (J 0) och Newtonsk stötdämpare (η 0) i serie med en Maxwell elementet (fjäder ( J 1) och stötdämpare (η 1) parallellt). (B) Creep experimentellt spår i blått tillsammans med kurvan (i grönt) anpassas till Burgers ekvation.
Figur 7. Spatial distribution av elastisk överensstämmelse i en biofilm odlas 24 h vid 37 ° C under 1 ml / timme näringsämnen flöda. Efterlevnad värden som rapporterats av varje partikel representeras här som en projektion på en (yz)-planet med hjälp av en kall för att värma anpassade färgkartan. Efterlevnad värden som rapporterats av partiklar som ligger i bottenskiktet av biofilmen är alla lägre än 0,2 m 2 / N medan partiklar som finns i de övre 15 μ m lager rapport värden över 1 m 2 / N.
Figur 8. Normaliserade fördelningar av de viskoelastiska parametrar som erhölls i biofilmen (A) och glycerol (B), en homogen viskös vätska. Biofilm uppvisade asymmetrisk och bred distribution (skevhet på 3,6 och normaliserad varians 2.4) som anger material heterogenitet. Däremot var symmetrisk och snäv fördelning som kännetecknar ett homogent medium som erhållits i glycerol (skevhet på 0,23 och normaliserad varians 0,03).
Figur 9. Spatial distribution av elastisk överensstämmelse i en biofilm odlas 24 h vid 37 ° C under ett lägre flöde av 0,1 ml / h näringsämnen flöde. Compliance värden är representerade enligt biofilmen djup. Symbol färger ger complianceområden.
Figur 10. Magnetpol blåkopia. Mått anges i cm.
Figur 11. Magnetiska pincett ledningar. Panel A - används för att tätt linda 2120 varv koppartråd och bygga magnetspolen (panel B) innan du sätter i den mjuka magnetiska legerings pol i mitten. Likström levereras i spolen som definierar magnetisk polaritet som visas i panel C. Se också experimentera översikt skiss i Figur 4.
Video 1: Denna film visar den inledande fasen av biofilmen strax efter injektion av den cellpartikelblandningen i kapillären. Förvärvsfrekvensen är 1 bild / sek och filmen spelas vid 10 bilder / sek. Klicka här för att se filmen.
Video 2: Denna film visar biofilmen efter 4 tim tillväxt. Partiklar gradvis frigöras från den yta som skall distribueras i b iofilm volym, blå pilar markerar lösgör händelser. Förvärvsfrekvens är 2 bild / min och filmen spelas upp med 15 bilder / sek. Klicka här för att se filmen.
Video 3: Biofilm efter 20 tim tillväxt. Filmen är tagen i ett mellanplan som ligger 20 nm över kapillär botten. Bilder förvärvades vid 2 bilder / min frekvens och filmen spelas upp med 15 bilder / sek. Klicka här för att se filmen.
Video 4: Typisk partikelspårning med ImageJ. Filmen visar ett extrakt av hela sekvensen med början vid tiden 23 sek och slutar vid tiden 30 sekunder. Gul bana visar partikelförskjutning på magnetisk aktivering. Förvärvsfrekvens är 30 bilder / sek och filmen spelas upp med 30 bilder / sek.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video4.avi "target =" _blank "> Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna magnetpulver sådd och dra experiment aktiverat på plats 3D-kartläggning av de viskoelastiska parametrar för en växande biofilm i originalskick. Detta tillvägagångssätt visade den mekaniska heterogenitet E. coli biofilm odlas här och gav ledtrådar för att peka ut de biofilm komponenter som stöder biofilm fysikaliska egenskaper, starkt tyder på en grundläggande konsekvens av den extracellulära matrisen och närmare bestämt dess grad av tvärbindning.
Erkännandet av mekaniska egenskaper mönster i bakteriell biofilm är avgörande för att bygga en heltäckande representation av dessa komplexa material. Dessa resultat öppnar vägen för att klargöra orsakssambanden som länkar mekaniska mönster och biologiska heterogeniteter såsom genuttryck microniches, vilket bör bidra till att klargöra de drivkrafter som ligger till grund biofilm utveckling.
Hittills har frågan om biofilmen mechaniska egenskaper hade behandlats huvudsakligen från en makroskopisk synvinkel och ofta genom att skrapa biofilm från sin ursprungliga plats 8,9,12,13, vilket utgör en viktig risk att data går förlorade. Vår icke-invasiv metod medför den första in situ karakterisering av biofilmen 3D mekaniska profilen i sin ursprungliga miljö.
Ansatsen har ännu en begränsning som är bosatt i egenskaperna hos den magnetiska fjärrmanövrering av kolloidalt sonder. I själva verket visar det en inneboende utbud av tillgängliga krafter ges av pole-partikeln avstånd, pol materialegenskaper och spole prestanda. Den aktuella konfigurationen av utformningen möjliggjorde sondering av hållfasthetsvärden på upp till 200 Pa, vilket var tillräckligt för de undersökta här biofilmer. Trots ytterligare konstruktion av vår set-up - som omfattar till exempel elektro kylning - bör möjliggöra växling av kraft-och tidsgränser med en faktor 2 till 3.
We arbetar för närvarande som rör de fysiska och dynamiska egenskaper i en biofilm undersöker relationen mellan lokala viskoelastiska parametrar som rapporterats av den passiva förskjutning av sonden på en större tidsskala. Dessutom undersöker vi effekten av olika kemikalier inriktade på olika komponenter i biofilm på sin mekaniska profilen.
Denna nya metod avslöjar detaljerna i bakteriella biofilm inre mekanik och bidrar till en bättre förståelse av dessa levande strukturer, avgörande från en ingenjör synvinkel för biofilm kontrollsyfte, men också från en grundläggande perspektiv för att klargöra förhållandet mellan de arkitektoniska egenskaper och de särskilda biologin av dessa strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete var delvis finansierats med bidrag från Agence Nationale pour la Recherche, PIRIbio programmet Dynabiofilm och från CNRS Tvärvetenskap riskprogram. Vi tackar Philippe Thomen för hans kritisk läsning av manuskriptet och Christophe Beloin för att tillhandahålla E. coli-stam som används i detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and cells | |||
| Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter |
| Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline. | |
| Table 2: Capillaries and tubing | |||
| Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | |
| Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3 mm |
| Table 3: Biofilm growth | |||
| Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | Standard medium used to grow bacteria. |
| M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria. | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose. |
| Table 4: Electronics | |||
| Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | |
| Heater controller | World precision instruments | 300354 | |
| Function generator | Agilent technologies | 33210A | |
| Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | |
| Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | |
| Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | |
| Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | |
| Table 5: Optics | |||
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | |
| S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth. | |
| Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. |
| Table 6: Image analysis | |||
| ImageJ | NIH - particle tracker plugin | ||
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S. Battling biofilms. Scientific American. 285, 74-81 (2001).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6, 199-210 (2008).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: an in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnology and bioengineering. 65, 83-92 (1999).
- Klapper, I., Rupp, C. J., Cargo, R., Purvedorj, B., Stoodley, P. Viscoelastic fluid description of bacterial biofilm material properties. Biotechnol Bioeng. 80, 289-296 (2002).
- Korstgens, V., Flemming, H. C., Wingender, J., Borchard, W. Uniaxial compression measurement device for investigation of the mechanical stability of biofilms. Journal of microbiological. 46, 9-17 (2001).
- Cense, A. W., et al. Mechanical properties and failure of Streptococcus mutans biofilms, studied using a microindentation device. Journal of microbiological methods. 67, 463-472 (2006).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Physical Review Letters. 93, (2004).
- Towler, B. W., Rupp, C. J., Cunningham, A. B., Stoodley, P. Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis. Biofouling. 19, 279-285 (2003).
- Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy. Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).
- Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Micro-cantilever method for measuring the tensile strength of biofilms and microbial flocs. Journal of microbiological methods. 55, 607-615 (2003).
- Aggarwal, S., Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Development and testing of a novel microcantilever technique for measuring the cohesive strength of intact biofilms. Biotechnology and bioengineering. 105, 924-934 (2010).
- Guélon, T., Mathias, J. -D., Stoodley, P. Biofilm Highlights. Series on Biofilms (eds Hans-Curt Flemming, Jost Wingender, & Ulrich Szewzyk). 5, Springer. Berlin Heidelberg. (2011).
- Galy, O., et al. Mapping of Bacterial Biofilm Local Mechanics by Magnetic Microparticle Actuation. Biophysical journal. 103, 1-9 (2012).
- Schnurr, B., Gittes, F., MacKintosh, F. C., Schmidt, C. F. Determining Microscopic Viscoelasticity in Flexible and Semiflexible Polymer Networks from Thermal Fluctuations. Macromolecules. 30, 7781-7792 (1997).
- Aggarwal, S., Hozalski, R. M. Effect of Strain Rate on the Mechanical Properties of Staphylococcus epidermidis Biofilms. Langmuir. 28, 2812-2816 (2012).
- Towler, B. W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law. Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).
- Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms. Biofouling. 27, 207-215 (2011).
- Apgar, J., et al. Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles. Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).
