Summary
Dit document toont een originele methode gebaseerd op de afstandsbedieningsinrichting van magnetische deeltjes geënt in een bacteriële biofilm en de ontwikkeling van specifieke magnetische pincet meten in situ lokale mechanische eigenschappen van het complex levend materiaal gebouwd door micro-organismen aan grensvlakken.
Abstract
Bacteriële hechting en groei interfaces tot de vorming van driedimensionale structuren heterogeen zogenaamde biofilms. De cellen woning in deze structuren worden samengehouden door fysische interacties gemedieerd door een netwerk van extracellulaire polymere stoffen. Bacteriële biofilms beïnvloeden vele menselijke activiteiten en het begrip van hun eigenschappen is cruciaal voor een betere controle van hun ontwikkeling - onderhoud of uitroeiing - afhankelijk van hun ongunstig, hetzij gunstig resultaat. Dit document beschrijft een nieuwe methode gericht op het meten in situ lokale fysische eigenschappen van de biofilm die was tot nu uitsluitend getoetst op een macroscopisch homogeen materiaal perspectief. De hier beschreven experiment omvat de invoering van magnetische deeltjes in een groeiende biofilm aan lokale sondes die op afstand worden bediend kan zonder verstoring van de structurele eigenschappen van de biofilm zaad. Dedicated magnetische pincet waren devekeld om een bepaalde kracht uit te oefenen op elk deeltje ingebed in de biofilm. De setup is gemonteerd op het podium van een microscoop om de opname van time-lapse beelden van de deeltjes trekken kunnen ontstaan. De deeltjestrajecten wordt geëxtraheerd uit het trekken sequentie en de lokale visco-elastische parameters afgeleid uit elk deeltje verplaatsing curve, waardoor de 3D-ruimtelijke verdeling van de parameters. Het verkrijgen van inzicht in de biofilm mechanische profiel is van essentieel belang vanuit het oogpunt van een ingenieur van mening voor biofilm controle doeleinden, maar ook vanuit een fundamenteel perspectief op de relatie tussen de architectonische eigenschappen en de specifieke biologie van deze structuren te verduidelijken.
Introduction
Bacteriële biofilms zijn gemeenschappen van bacteriën in verband met biologische of kunstmatige oppervlakken 1-3. Ze vormen van een adhesie-groeimechanisme gekoppeld aan de productie van polysaccharide-rijke extracellulaire matrix die het bouwwerk 4,5 beschermt en stabiliseert. Deze biofilms zijn niet alleen passief assemblages van cellen vast aan oppervlakken, maar georganiseerd en dynamische complexe biologische systemen. Wanneer bacteriën schakelen van plankton tot biofilm levensstijl, worden veranderingen in genexpressie en cel fysiologie en waargenomen als een stijging antibioticaresistentie en gastheer immuunsysteem aan de oorsprong van vele hardnekkige en chronische infecties 6. Echter, de gecontroleerde ontwikkeling van deze levende structuren bieden ook kansen voor de industrie en milieu-toepassingen, zoals het saneren van locaties met gevaarlijk afval, bio-filtratie van industrieel water of vorming van bio-belemmeringen voor de bodem en het grondwater te beschermen tegen Contaminatie.
Terwijl de moleculaire kenmerken die specifiek zijn voor biofilm manier van leven in toenemende mate worden beschreven, de mechanismen achter de ontwikkeling van de gemeenschap en doorzettingsvermogen blijven onduidelijk. De recente ontwikkelingen op microschaal metingen met scanning elektrochemische of fluorescentiemicroscopie hebben deze levende organisaties is aangetoond dat aanzienlijke structurele, chemische en biologische heterogeniteit 7. Maar, tot nu toe, biofilm monteurs zijn vooral macroscopisch onderzocht. Zo waarneming van biofilm streamers vervorming als gevolg van variaties in fluïdumstroomsnelheden 8,9, uniaxiale druk van biofilm stukken heffen van agar medium of gegroeid op hoes schuift 10,11, dwarskracht biofilm vanuit het milieu en vervolgens overgebracht naar een parallelle plaat reometer 12,13, atomic force-spectroscopie met een glazen kraal en gecoat met een bacteriële biofilm bevestigd aan een AFM cantilever 14 of een speciale MICRocantilever methode voor het meten van de treksterkte van vrijstaande biofilm fragmenten 15,16 zijn uitgevoerd gedurende de laatste tien jaar, het verstrekken van nuttige informatie over de visco-elastische aard van het materiaal 17. Toch lijkt het waarschijnlijk dat gegevens over in situ biofilm mechanische eigenschappen verloren wanneer het materiaal wordt verwijderd uit zijn natuurlijke omgeving, die vaak in deze benaderingen was. Bovendien is de behandeling van de biofilm als een homogeen materiaal mist de gegevens over de mogelijke heterogeniteit van de fysische eigenschappen binnen de gemeenschap. Daarom is de exacte implicaties van de structuur mechaniek in de biofilmvorming en biologische eigenschappen, zoals genexpressie patroon of chemische gradiënten nauwelijks worden herkend. De overgang naar een microschaal beschrijving van de biofilm fysische eigenschappen, zijn nieuwe speciale gereedschappen nodig.
Deze paper Gegevens een originele aanpak bedacht te bereikenmeting van lokale mechanische parameters in situ zonder de biofilm en waardoor tekening van de ruimtelijke verdeling van de microschaal materiaaleigenschappen en de mechanische heterogeniteit. Het principe van het experiment berust op de dotering van een groeiende biofilm met magnetische microdeeltjes gevolgd door hun afgelegen inladen met magnetische pincet in het rijpe biofilm. Deeltje verplaatsing onder gecontroleerde magnetische kracht toepassing afgebeeld onder de microscoop stelt lokale visco-elastische parameter afleiding, elk deeltje de rapportering van haar eigen lokale omgeving. Uit deze gegevens kan de 3D-mechanische profiel van de biofilm worden getrokken, onthullende ruimtelijke en milieuconditie afhankelijkheden. De hele experiment wordt hier getoond een E. coli biofilm die door een genetisch gemanipuleerde stam die een gederepresseerde F-achtige plasmide. De beschreven in een recent artikel 18 resultaten geven een unieke visie op het interieur van intacte biofilm mechanica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bacteriën Cultuur en Suspension Voorbereiding
- Kies een vers gekweekte kolonie uit lysogenie Broth (LB) agar plaat, inoculeren in 5 ml vloeibaar LB-medium dat 100 μ g / ml ampicilline en 7,5 μ g / ml tetracycline en incubeer voor 5 tot 6 uur bij 37 ° C op een trillende platform.
- Voeg vervolgens 100 μ l van de bacteriecultuur in 5 ml minimaal medium (M63B1) aangevuld met 0,4% glucose en hetzelfde antibioticum concentraties. Incubeer dit vers verdund cultuur overnacht bij 37 ° C op een schuddend platform.
- Na 16 uur incubatie, voeg 100 ul van de kweek van een nacht tot 5 ml M63B1, 0,4% glucose. Houd de buis bij 37 ° C om de schudtafel tot 0,5 OD wordt bereikt. De suspensie is dan gereed voor injectie in het experiment kanaal voor biofilmvorming.
2. Magnetic Particle Voorbereiding
- Neem 10 pi magnetische deeltjes -2.8 μ m in diameter - van de voorraad en was ze 3x in 190 ul minimaal medium met behulp van een magnetische monster rek.
- Stel het deeltje concentratie 5 x 10 6 kralen / ml. Typically 50 pl van de gewassen korrel oplossing wordt gemengd met een verdere 950 μ l M63B1 0,4% glucose.
3. Channel Voorbereiding en biofilmgroei
- Kanaal Montage
- Snijd twee vierkante (800 μ m lengte) borosilicaatglas haarvaten 10 cm lang om twee 8 cm lange stukken te verkrijgen.
- Lijm de twee capillaire stukken op twee glasplaatjes - gehalveerd eerste - 2 cm van elkaar met 1 cm overhang aan beide zijden zoals in figuur 1 met behulp van een snelwerkende cyanoacrylaat lijm (de zogenaamde super-lijm).
- Autoclaaf de gehele installatie en de nodige slangen nodig voor de verdere kanaal aansluiting.
- Verzamel alle steriele materialen ondereen laminaire stroming kap: i) de gemonteerde kanaal en val 1, ii) de slangen en aansluitingen, iii) de twee bubble vallen - de zeepbel filter vaak gebruikt om kinderen sondevoeding (trap 1) en de zelfgemaakte opvanginrichting beveiligen als een 4 cm lange buis met een grotere diameter (trap 2), iv) klemmen, v) 30 ml spuiten gevuld met M63B1, 0,4% glucose, en vi) de fles afval.
- Sluit de hele setup met Luer Lock connectoren of kruispunten in de volgende volgorde: 50 ml M63B1 spuit gecontroleerd door de injectiepomp, pediatrische bubble filter, zelfgemaakte Waterventiel, capillair (Figuur 1, paneel B), en de buis om de fles afval. Vul dan de opstelling met steriele M63B1, 0,4% glucose, het inschakelen van de injectiespuit pomp met een snelheid van ongeveer 10 ml / uur, hoger dan de experimentele tarieven. Zorgvuldig volgen en elimineren alle bubbels in het circuit.
- Stroming het medium door het systeem gedurende 10-15 min; gelijktijdig mix 1 ml van de bacterie suspensie bij OD 0.5 van Sectie1.3 met 1 ml van de gewassen kraal oplossing bereid in paragraaf 2.2.
- Bevestig (maar niet sluiten) klemmen om de buis op twee posities: voor en na de haarvaten. Schakel de stroom uit.
- Introduceer de bacteriële-kraal mengsel in de capillair achter de zelfgemaakte opvanginrichting met behulp van een 1 ml spuit, zorg te houden van de buis eindigt aan de lucht insleep te voorkomen. Terugplaatsen van de slang en sluit de klemmen.
- Herhaal dezelfde procedure voor de tweede capillaire en laat U alle buizen voor bubbels.
- Breng de inrichting aan de microscoop en laat het gedurende 15-20 minuten staan om de bacteriën in staat te regelen en hechten aan het oppervlak van het capillair. Installeer het capillair op de microscoop podium met de afvalcontainer op een iets hoger niveau. Plaats de spuit pomp op het aanrecht naast de microscoop. Verhoog de opvanginrichting voordat de capillaire iets hoger dan de capillaire vliegtuig naar bubbels te vangen.
- Biofilm Growth
- Stel het debiet op de spuit pomp en start de stroom, zal de biofilm nu ontwikkelen op de capillaire oppervlak tijdens de vereiste periode - meestal 24 of 48 uur in deze experimenten.
- Focus op de capillaire bodem vlak en start de time-lapse-opname van de voorbeeldfoto's - meestal een overname frequentie van 2 beelden / zal min adequaat de biofilm groei melden. Deze video monitoren biofilmgroei nacontrole (zie uittreksels in Video's 1, 2 en 3).
4. Magnetisch pincet Installatie
- Schroef de magnetische pincet op handbediende XYZ micromanipulators en schroef de micromanipulators op de microscoop podium om de positie van de pincet passen ten opzichte van het capillair. Plaats de pincet zoals in figuur 2 te zorgen voor de juiste magnetische veldgradiënt wordt opgewekt in de waarneming zone.
- Sluit de pincet to de functie generator via de eindversterker om een 40 sec periode van 24 sec nul signaal en 16 sec van 4 A gelijkstroom met een trekker naar het helder veld licht sluiter wordt na 20 seconden voor signaalsynchronisatie verstrekken van een reeks te genereren gebeurtenissen zoals in Figuur 3.
NB: De twee bewerkingen kunnen op elk moment tussen capillaire installatie en meting begin bereikt. Zie experimenteren overzicht schets in figuur 4.
5. Creep Curve Acquisitie
- Gebruik de xy bewegingscontrole van de microscoop fase naar de rand van de linker magnetische pool en de linker rand van het capillair in de observatie hetzelfde veld brengen. Neem de oorsprong van de analyse referentiële op de kruising van x-en y-as gedefinieerd door de rand van het capillair en de rand van het poolstuk, respectievelijk (zie figuur 2).
- Pas de verticale positie van het capillair met behulp van fijne Focus Controle knop van de microscoop positie. Typisch de eerste onderzochte vlak ligt tussen 4 tot 7 μ m boven het capillaire bodem. Video 1 correspondeert met het xy veld dat de linker hoek heeft aan de basis van de ruimtelijke referentiële.
- Trigger de 40 sec opeenvolging van gebeurtenissen in punt 4.2 en figuur 3 beschreven door het inschakelen van de stroomgenerator en tegelijkertijd handmatig activeren de beeldacquisitie sequentie Video 1.
- Verplaats de capillair naar rechts veld buurman een 250 μ m vertaling van de microscooptafel naar links en werken als in paragraaf 5.3 tot Video 2 van schijf 2 te genereren en zo verder tot de gewenste video verkrijgen. Typisch 3 tot 4 gebieden 250 x 250 μ m 2 verzameld langs de x-as alvorens de vliegtuig en herhalen dezelfde handelingen voor het nieuwe vliegtuig.
6. Kracht IJking
- Bereid een glycerol-oplossing door het mengen van 39,8 g glycerol met 190 μ l van bi-gedestilleerd water en 10 ul van magnetische deeltjes in een 2 x 10 9 deeltjes / ml en vul een experimenteel kanaal met dit mengsel en plaats het op de microscoop podium zoals beschreven voor de biofilm monster.
- Na het installeren van de magnetische pincet als vermeld in paragraaf 4, gelden de magnetische kracht als vermeld in paragraaf 5.4 en maak time-lapse beelden telkens voor een enkele snelheid deeltje (v) en haar positie in de capillaire halen om de kalibratie-bestand af te leiden. Dit bestand moet de uitgeoefende kracht bevatten als functie van de positie in de zone van de analyse van de capillair volgens de wet van Stokes, F = 6πRηv (R: straal van het deeltje).
7. Analyse
- Gebruik een "particle tracker" software om tekstbestanden te verkrijgen met het deeltje posities in elk frame voor alle stapels van beelden verkregen als vermeld in paragraaf 5. Using het beeld stapel overname frequentie, bereken het deeltje verplaatsing als functie van de tijd (bijvoorbeeld Figuur 5 en video 4).
- De kracht kalibratiebestand, zet de verplaatsingscurven naleving curves (totaal conformiteit van het materiaal - J (t) - als functie van de tijd) afhankelijk van de mate formule:
waarin de relatie tussen materiaalspanning geeft en toegepaste spanning voor een probe deeltje met straal R ingebed in een onsamendrukbare, homogeen viscoelastische medium zoals eerder vastgesteld Schnurr en medewerkers 19. - Pas de kruip compliantiecurven de algemene Burgers model voor visco-elastische materialen en ontlenen de visco-elastische parameters, J 0, J 1, η 0, η 1 voor elk deeltje (
Opmerking: Deze fenomenologische analyse is eerder toegepast voor uiteenlopende materialen zoals biologische materialen zoals biofilms macroscopische reologie interpreteren 20-22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een typische analyse zal de ruimtelijke verdeling van de visco-elastische parameters te leveren tegen de micron schaal op een levend biofilm zonder zijn oorspronkelijke schikking te verstoren. Typische resultaten worden getoond in figuur 7 waarin de waarden J 0 - de elastische uitvoering - gegeven als functie van de z-as langs de diepte en de y-as langs een dwarsafmeting van de biofilm. Elk punt komt overeen met een kraal die kruip curve analyse heeft gegeven van een J 0 waarde. De gegevens bleek dat de lokale naleving gevarieerd langs de diepte van de biofilm over bijna drie orden van grootte maar ook sterke zijwaartse heterogeniteit plaats helemaal biofilm hoogten.
De gegevens kon eveneens de verdeling van de naleving waarden die hier getoond wijdverspreide en asymmetrische vorm (fig. 8), verschaffen sterke aanwijzingen dat de mechanische eigenschappen van de biofilm werden ondersteund doorsterk verknoopte polymeer gels. Inderdaad, analoge gedrag is eerder aangetoond geconcentreerd en zeer verknoopte actine gels 23.
Bovendien zijn deze in situ metingen van biofilm lokale eigenschappen uitgevoerd onder verschillende omgevingsomstandigheden, zoals lagere stroomsnelheid mogelijk het effect van een dergelijke variatie op de biofilm interne organisatie tonen. In figuur 9, de naleving waarden van een biofilm geteeld op 0,1 ml / uur vertoonde een nog steeds zeer heterogeen mechanische profiel maar niet hoger stijfheid van de diepere biofilm in vergelijking met de biofilm gekweekt bij 1 ml / uur. Deze resultaten toonden het significante effect van externe omstandigheden op de biofilm organisatie.
Figuur 2. Plaatsing van de magnetische pincet met betrekking tot het capillair op de microscoop podium en definitie van de ruimtelijke referentiële. Het bovenaanzicht geeft de positie van de meetzone in de capillair.
Figuur 3. Synchronisatie van de signalen over de 40 sec periode.
857/50857fig4.jpg "/>
Figuur 4. Experiment overzicht schets.
Figuur 5. Uittreksels uit partikeltraject analyse. Paneel A toont links de afbeelding van een typische deeltje in zijn oorspronkelijke stand vlak voor magnetische kracht applicatie (tijd 23.79 sec van de 40 seconden periode) en aan de rechterkant van de positie van het deeltje op tijd 30 sec samen met de weergave van het traject gevonden met ImageJ deeltjes tracker Paneel B toont de grafiek van de verplaatsingscurve Uit deze gegevens.; Hier tonen we een traject extract begint op het moment 23,79 sec tot het tijdstip t = 31,29 sec van de 40 sec periode.
Figuur 6. Viscoelastic parameter afleiding op basis van de fenomenologische model van Burger. (A) Burgers mechanisch model bestaande uit een combinatie van elastische Hookean lente (J 0) en Newtoniaanse smoorpot (η 0) in serie met een Maxwell element (veer ( J 1) en smoorpot (η 1) parallel). (B) Creep experimentele trace in blauw samen met de curve (in het groen) aangepast aan de Burgers vergelijking.
Figuur 7. Ruimtelijke verdeling van elastische compliance in een biofilm gekweekt 24 uur bij 37 ° C onder 1 ml / uur nutriënten stromen. Naleving waarden die door elk deeltje worden hier voorgesteld als een projectie op een (yz) vliegtuig met een koel tot warm aangepaste kleur kaart. Naleving waarden die door deeltjes in de onderlaag van de biofilm zijn lager dan 0,2 m 2 / N terwijl deeltjes in de bovenste 15 μ m layer rapportwaarden dan 1 m2 / N.
Figuur 8. Genormaliseerde verdeling van de visco-elastische parameters verkregen biofilm (A) en glycerol (B), een homogene viskeuze vloeistof. Biofilm vertoonde asymmetrische en brede verspreiding (scheefheid van 3,6 en genormaliseerde variantie 2,4) aangeeft materiaal heterogeniteit. Daarentegen symmetrische en nauwe verdeling karakteriseren een homogeen medium werd verkregen glycerol (scheefheid van 0,23 en genormaliseerde variantie 0.03).
Figuur 9. Ruimtelijke verdeling van elastische compliance in een biofilm gekweekt 24 uur bij 37 ° C onder een lager debiet van 0,1 ml / uur stroomsnelheid voedingsstoffen. Compliance waarden worden weergegeven volgens de biofilm diepte. Symbool kleuren geven de naleving bereiken.
Figuur 10. Magnetische pool blauwdruk. De afmetingen zijn aangegeven in cm.
Figuur 11. Magnetische pincet bedrading. Panel A - wordt gebruikt om strak wind de 2120 windingen van koperdraad en bouwen de magnetische spoel (panel B) voordat u de zachte magnetische legering paal in het midden. Gelijkstroom wordt geleverd in de spoel bepalen magnetische polariteit zoals getoond in paneel C. Zie ook experimenteren overzicht schets in figuur 4.
Video 1: Deze film toont de eerste fase van de biofilm vlak na injectie van de cel-deeltje mengsel in de capillair. Overname frequentie afbeelding 1 / sec en de film wordt gespeeld op 10 beelden / sec. Klik hier om deze video te bekijken.
Video 2: Deze film toont de biofilm na 4 uur groei. Deeltjes geleidelijk los van het oppervlak te verdelen in de b iofilm volume, blauwe pijlen markeren detachement evenementen. Acquisitie frequentie is 2 image / min en de film wordt afgespeeld met 15 beelden / sec. Klik hier om deze video te bekijken.
Video 3: biofilm na 20 uur groei. De film wordt genomen in een middenvlak gelegen 20 micrometer over de capillaire bodem. Beelden werden verkregen bij 2 beelden / min frequentie en de film wordt afgespeeld met 15 beelden / sec. Klik hier om deze video te bekijken.
Video 4: Typische particle-tracking met behulp van ImageJ. De film toont een extract van de gehele sequentie begint op tijdstip 23 seconden en eindigt op tijdstip 30 sec. Gele baan geeft deeltje verplaatsing op magnetische bediening. Overname frequentie is 30 beelden / sec en de film wordt gespeeld op 30 frames / sec.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video4.avi "target =" _blank "> Klik hier om deze video te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze magnetische deeltjes zaaien en trekken experiment geactiveerd in situ 3D-kaarten van de visco-elastische parameters van een groeiende biofilm in de oorspronkelijke staat. Deze benadering bleek de mechanische heterogeniteit van de E. coli biofilm hier gegroeid en gaf aanwijzingen te wijzen op de biofilm componenten ondersteunen van de biofilm fysische eigenschappen, sterk suggereert een fundamentele implicatie van de extracellulaire matrix en meer bepaald de mate van cross-linking.
De erkenning van de mechanische eigenschappen patronen in bacteriële biofilm is cruciaal voor het opbouwen van een uitgebreide weergave van deze complexe materialen. Deze bevindingen openen de weg naar de causale relaties koppelen mechanische patronen en biologische heterogeniteit zoals genexpressie microniches, die moeten helpen verduidelijken van de drijvende krachten die ten grondslag liggen biofilm ontwikkeling te verduidelijken.
Tot nu toe, de vraag van de biofilm mechasche eigenschappen waren hoofdzakelijk vanuit een Macroscopisch vaak door schrapen biofilm uit de eerste site 8,9,12,13, die een belangrijk risico van informatieverlies vertegenwoordigt. Onze niet-invasieve methode brengt de eerste in situ karakterisering van de biofilm 3D mechanische profiel in zijn oorspronkelijke omgeving.
Nog De aanpak heeft een beperking die in de eigenschappen van de magnetische afstandsbedieningsinrichting colloïdaal probes. Inderdaad, het geeft een intrinsieke aanbod van toegankelijke krachten gegeven door de pole-deeltje afstand, pole materiaaleigenschappen en prestaties spoel. De huidige configuratie van de set-up kon de indringende van stijfheid waarden tot 200 Pa, wat voldoende was voor de hier onderzochte biofilms. Toch verdere engineering van onze set-up - waarbij bijvoorbeeld elektromagneet koeling - moet verschuiven van kracht en termijnen mogelijk te maken met een factor 2 tot 3.
We werken momenteel aan betreffende de fysieke en dynamische eigenschappen in een biofilm onderzoek naar de relatie koppelen lokale visco-elastische parameters gerapporteerd door de passieve verplaatsing van de sonde op een grotere tijdschaal. Verder onderzoeken we het effect van verschillende chemicaliën gericht is op verschillende onderdelen van de biofilm op de mechanische profiel.
Deze nieuwe benadering onthult de details van de bacteriële biofilm interne mechanica en draagt bij aan een beter begrip van deze levende structuren, van cruciaal belang vanuit het oogpunt van een ingenieur van mening voor biofilm controle doeleinden, maar ook vanuit een fundamenteel perspectief op de relatie tussen de architectonische eigenschappen en de specifieke verduidelijken biologie van deze structuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de Agence Nationale pour la Recherche, PIRIbio programma Dynabiofilm en van CNRS Interdisciplinair Risk programma. Wij danken Philippe Thomen voor zijn kritische lezing van het manuscript en Christophe Beloin voor het verstrekken van de E. coli stam gebruikt in dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and cells | |||
| Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter |
| Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline. | |
| Table 2: Capillaries and tubing | |||
| Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | |
| Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3 mm |
| Table 3: Biofilm growth | |||
| Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | Standard medium used to grow bacteria. |
| M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria. | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose. |
| Table 4: Electronics | |||
| Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | |
| Heater controller | World precision instruments | 300354 | |
| Function generator | Agilent technologies | 33210A | |
| Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | |
| Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | |
| Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | |
| Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | |
| Table 5: Optics | |||
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | |
| S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth. | |
| Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. |
| Table 6: Image analysis | |||
| ImageJ | NIH - particle tracker plugin | ||
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S. Battling biofilms. Scientific American. 285, 74-81 (2001).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6, 199-210 (2008).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: an in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnology and bioengineering. 65, 83-92 (1999).
- Klapper, I., Rupp, C. J., Cargo, R., Purvedorj, B., Stoodley, P. Viscoelastic fluid description of bacterial biofilm material properties. Biotechnol Bioeng. 80, 289-296 (2002).
- Korstgens, V., Flemming, H. C., Wingender, J., Borchard, W. Uniaxial compression measurement device for investigation of the mechanical stability of biofilms. Journal of microbiological. 46, 9-17 (2001).
- Cense, A. W., et al. Mechanical properties and failure of Streptococcus mutans biofilms, studied using a microindentation device. Journal of microbiological methods. 67, 463-472 (2006).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Physical Review Letters. 93, (2004).
- Towler, B. W., Rupp, C. J., Cunningham, A. B., Stoodley, P. Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis. Biofouling. 19, 279-285 (2003).
- Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy. Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).
- Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Micro-cantilever method for measuring the tensile strength of biofilms and microbial flocs. Journal of microbiological methods. 55, 607-615 (2003).
- Aggarwal, S., Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Development and testing of a novel microcantilever technique for measuring the cohesive strength of intact biofilms. Biotechnology and bioengineering. 105, 924-934 (2010).
- Guélon, T., Mathias, J. -D., Stoodley, P. Biofilm Highlights. Series on Biofilms (eds Hans-Curt Flemming, Jost Wingender, & Ulrich Szewzyk). 5, Springer. Berlin Heidelberg. (2011).
- Galy, O., et al. Mapping of Bacterial Biofilm Local Mechanics by Magnetic Microparticle Actuation. Biophysical journal. 103, 1-9 (2012).
- Schnurr, B., Gittes, F., MacKintosh, F. C., Schmidt, C. F. Determining Microscopic Viscoelasticity in Flexible and Semiflexible Polymer Networks from Thermal Fluctuations. Macromolecules. 30, 7781-7792 (1997).
- Aggarwal, S., Hozalski, R. M. Effect of Strain Rate on the Mechanical Properties of Staphylococcus epidermidis Biofilms. Langmuir. 28, 2812-2816 (2012).
- Towler, B. W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law. Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).
- Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms. Biofouling. 27, 207-215 (2011).
- Apgar, J., et al. Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles. Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).
