Summary
Dette papir viser en original metode baseret på fjernbetjeningen aktivering af magnetiske partikler seedede i en bakteriel biofilm og udvikling af dedikerede magnetiske pincet til at måle in situ den lokale mekaniske egenskaber af den komplekse levende materiale bygget af mikroorganismer på grænseflader.
Abstract
Bakteriel adhæsion og vækst på grænseflader føre til dannelse af tredimensionale heterogene strukturer såkaldte biofilm. Cellerne bolig i disse strukturer er holdt sammen af fysiske interaktioner medieret af et netværk af ekstracellulære polymere stoffer. Bakterielle biofilm påvirke mange menneskelige aktiviteter og forståelsen af deres egenskaber er afgørende for en bedre styring af deres udvikling - vedligeholdelse eller udryddelse - afhængig af deres skadelig eller gavnlig resultat. Dette papir beskriver en roman metode tager sigte på at måle in situ den lokale fysiske egenskaber af biofilm, der havde været, indtil nu, alene undersøges fra en makroskopisk og homogent materiale perspektiv. Den her beskrevne eksperiment involverer indførelse af magnetiske partikler i en voksende biofilm frø lokale prober, der kan fjernstyres aktiveres uden at forstyrre de strukturelle egenskaber af biofilmen. Dedikerede magnetiske pincet var developed at udøve en defineret kraft på hver partikel indlejret i biofilmen. Opsætningen er monteret på scenen af et mikroskop for at muliggøre registrering af time-lapse billeder af partikel-trækker periode. De partikelbaner ekstraheres derefter fra trække sekvens og de lokale viskoelastiske parametre afledt fra hver forskydningskurve partikel, hvorved der tilvejebringes 3D-rumlige fordeling af parametre. Opsamling indsigt i biofilmen mekanisk profil er afgørende fra en ingeniør synspunkt for biofilm kontrolformål, men også ud fra et grundlæggende perspektiv for at afklare forholdet mellem de arkitektoniske egenskaber og den specifikke biologi af disse strukturer.
Introduction
Bakterielle biofilm er fællesskaber af bakterier forbundet med biologiske eller kunstige overflader 1-3. De udgør med en vedhæftning vækst mekanisme kombineret med produktionen af polysaccharid-rige ekstracellulære matrix, der beskytter og stabiliserer bygningsværk 4,5. Disse biofilm er ikke blot passive samlinger af celler fast på overflader, men organiseret og dynamiske komplekse biologiske systemer. Når bakterierne skifter fra planktoniske til biofilm livsstil, er ændringer i genekspression og celle fysiologi observeret samt øget antibiotikaresistens og vært immunforsvar bliver på oprindelsen af mange vedvarende og kroniske infektioner 6. Men kontrolleret udvikling af disse levende strukturer også tilbyde, muligheder for industrielle og miljømæssige applikationer, såsom bioremediering af farligt affald sites, bio-filtrering af industriel vand eller dannelse af bio-barrierer for at beskytte jord og grundvand fra contamination.
Mens molekylære karakteristika for biofilm livsstil i stigende grad beskrives de mekanismer, der driver udvikling af lokalsamfundet og vedholdenhed fortsat uklare. Brug de seneste fremskridt på mikroskala målinger ved hjælp scanning elektrokemisk eller fluorescens mikroskopi, har disse levende organisationer er blevet vist at udvise en betydelig strukturel, kemiske og biologiske heterogenitet 7. Men indtil nu, biofilm mekanik er hovedsagelig blevet undersøgt makroskopisk. For eksempel observation af biofilm streamers deformation som følge af variationer i fluidstrømningshastigheder 8,9 énakset komprimering af biofilm stykker løfter fra agar medium eller dyrkes på låget glider 10,11, forskydning af biofilm indsamlet fra miljøet og derefter overført til en parallel plade rheometer 12,13, atomic force spektroskopi ved hjælp af en glasperle og belagt med en bakteriel biofilm knyttet til en AFM cantilever 14 eller en dedikeret MICRocantilever metode til at måle trækstyrke løsrevne biofilm fragmenter 15,16 er blevet gennemført i løbet af de sidste ti år, hvilket giver nyttige oplysninger om viskoelastiske af materialets art 17. Men det lader til, sandsynligt, at oplysninger om in situ biofilm mekaniske egenskaber går tabt, når materialet er fjernet fra dets oprindelige miljø, som ofte var tilfældet i disse tilgange. Desuden behandling af biofilm som et homogent materiale misser oplysninger om mulige heterogenitet de fysiske egenskaber i samfundet. Derfor kan de nøjagtige konsekvenser af strukturen mekanik i biofilmdannelse og biologiske egenskaber såsom genekspression mønster eller kemiske gradienter næppe blive anerkendt. For at gøre fremskridt i retning af en mikroskala beskrivelse af biofilm fysiske egenskaber, er nye dedikerede værktøj.
Dette papir beskriver en original tilgang udtænkt til at opnåmåling af lokale mekaniske parametre in situ uden at forstyrre biofilmen og muliggør tegning af den rumlige fordeling af de mikroskala materialeegenskaber og derefter den mekaniske heterogenitet. Princippet i forsøget hviler på doping af en voksende biofilm med magnetiske mikropartikler efterfulgt af deres afsides pålæsning med magnetiske pincet i den modne biofilm. Partikel forskydning under kontrolleret magnetisk kraftpåvirkning afbildet under mikroskop muliggør lokal viskoelastiske parameter afledning, hver partikel rapporterer sin egen lokale miljø. Ud fra disse data kan 3D mekaniske profil biofilmen drages, afslørende rumlige og miljømæssig stand afhængigheder. Hele eksperimentet vil blive vist her på en E. coli biofilm fra en gensplejset stamme, som bærer en derepresseres F-lignende plasmid. Resultaterne er beskrevet i et nyligt papir 18 giver en unik vision af det indre af intakte biofilm mekanik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Bakterier Kultur og Suspension Forberedelse
- Vælg en friskdyrket koloni fra en lysogeni Broth (LB) agarplade inokuleres det i 5 ml flydende LB-medium indeholdende 100 μ g / ml ampicillin og 7,5 μ g / ml tetracyklin og inkubere det i 5 til 6 timer ved 37 ° C på et rystebord.
- Derefter tilsættes 100 μ l af bakteriekulturen i 5 ml minimalmedium (M63B1) suppleret med 0,4% glucose og de samme koncentrationer af antibiotikum. Inkuber denne frisk fortyndede kultur natten over ved 37 ° C på et rystebord.
- Efter 16 timer inkubation tilsættes 100 ul overnatskulturen til 5 ml M63B1, 0,4% glucose. Hold røret ved 37 ° C til rystebord indtil 0,5 OD er nået. Suspensionen er derefter klar til injektion i eksperimentet kanal til biofilmdannelse.
2.. Magnetisk Partikelfremstillinq
- Tag 10 ul magnetiske partikler -2,8 μ meter i diameter - fra bestanden og vaske dem 3x i 190 ul minimum medium ved hjælp af en magnetisk prøve rack.
- Juster partikelkoncentrationen til 5 x 10 6 perler / ml. Typisk 50 pi af den vaskede perle opløsning blandes med en yderligere 950 μ l M63B1 med 0,4% glucose.
3.. Channel Forberedelse og biofilmvækst
- Channel Montering
- Skær to firkantede (800 μ m sidelængde) borsilicatglas kapillærer 10 cm lang for at få to 8 cm lange stykker.
- Lim de to kapillar stykker på to objektglas - skåret i halve først - 2 cm fra hinanden med 1 cm udhæng i begge ender, som i figur 1 ved hjælp af en hurtigt virkende cyanoacrylatlim (såkaldt super-lim).
- Autoklaver hele opsætningen og den nødvendige slange nødvendig for yderligere kanal tilslutning.
- Saml alle de sterile materialer underen laminar flow hætte: i) den monterede kanal og trap 1, ii) slanger og konnektorer, iii) de to boble fælder - boblen filter, der almindeligvis anvendes til at sikre børns drop-fodring (trap 1), og den hjemmelavede boblefælde som et 4 cm langt rør med en større diameter (fælde 2), iv) klemmer, v) 30 ml sprøjter fyldt med M63B1, 0,4% glucose, og vi) affald flaske.
- Tilslut hele opsætningen med Luer Lock connecters eller vejkryds i følgende rækkefølge: 50 ml M63B1 sprøjte styres af sprøjtepumpe, pædiatrisk boble filter, hjemmelavet boble fælde, kapillær (fig. 1, panel B), og røret til affaldet flaske. Fyld derefter setup med steril M63B1, 0,4% glucose, tænde sprøjtepumpen med en hastighed på omkring 10 ml / time, er højere end de eksperimentelle satser. Spore forsigtigt og fjerne alle de bobler i kredsløbet.
- Flow mediet gennem systemet i 10-15 min; samtidig blande 1 ml af bakterier suspension på OD 0.5 fra afsnit1.3 med 1 ml af den vaskede perle klargjort i afsnit 2.2.
- Vedhæft (men luk ikke) klemmer på slangen ved to positioner: før og efter kapillærer. Sluk for strømmen slukket.
- Indføre det bakterielle-kugle-blandingen ind i kapillarrøret efter hjemmelavet boblerør anvendelse af en 1 ml sprøjte, idet man til at holde op rørenderne at forhindre luft post. Re-vedhæfte slangen og luk klemmerne.
- Gentag den samme procedure for den anden kapillær og find ud af alle rør til bobler.
- Overfør apparatet til mikroskopet og lade det stå i 15-20 minutter for at gøre det muligt for bakterierne at afvikle og vedhæfte til overfladen af kapillarrøret. Installer kapillarrøret på mikroskop scenen med affaldsbeholderen på et lidt højere niveau. Placér sprøjten pumpe på bordplade ved siden af mikroskop. Løft boblerør før kapillarrøret lidt højere end den kapillære flyet til at fange bobler.
- Biofilm GroGJ
- Hastigheden på sprøjtepumpen og starte strømning vil biofilmen nu udvikle sig på kapillær overflade under den krævede periode - sædvanligvis 24 eller 48 timer i disse eksperimenter.
- Fokus på kapillær bundplan og start tidsforskudt optagelse af prøven billeder - som regel en erhvervelse frekvens på 2 billeder / min tilstrækkeligt vil rapportere væksten biofilm. Denne videomonitorer biofilmvækst efterkontrol (se uddrag i Videoer 1, 2 og 3).
4.. Magnetiske pincet Installation
- Skru de magnetiske pincet på manuelt styrede XYZ mikromanipulatorer og skru mikromanipulatorer på mikroskopbordet at justere placeringen af en pincet relativt til kapillarrøret. Placer pincetten som i fig 2 for at sikre en passende magnetfeltgradient genereres i observation zone.
- Slut pincetten to funktion generator via effektforstærkeren til at generere en 40 sek periode lavet af 24 sekunder nul signal og 16 sekunder af 4 A jævnstrøm med en udløser sendt til lysfelt lys lukkeren efter 20 sek til synkronisering af signalet giver en sekvens af begivenheder som i figur 3.
Bemærk: Disse to operationer kan opnås på ethvert tidspunkt mellem kapillær installation og måling begyndelsen. Se eksperimentere oversigt skitse i figur 4.
5.. Creep Curve Acquisition
- Brug xy bevægelse kontrol mikroskopbordet at bringe kanten af venstre magnetiske pol og den venstre kant af kapillarrøret i samme observation felt. Tag oprindelsen af analysen referentiel ved skæringspunktet mellem x-og y-akser, der er defineret ved kanten af den kapillære og kanten af polstykket, (se figur 2).
- Juster den lodrette position af kapillær med fint fokus control knop mikroskop position. Typisk det første undersøgte flyet ligger mellem 4 til 7 μ m over kapillære bunden. Video 1 svarer til xy felt, der har sin øverste venstre hjørne på oprindelsen af det rumlige referentiel.
- Udløs 40 sek hændelsesforløb, der er beskrevet i afsnit 4.2 og figur 3 ved at skifte på den aktuelle generator og samtidig manuelt udløse billedet erhvervelse sekvens af Video 1.
- Flyt kapillar til naboen til højre felt ved en 250 μ m oversættelse af mikroskopbordet til venstre og fungere som i afsnit 5.3 til at generere Video 2 af skive 2 og så videre for at opnå de nødvendige videoer. Typisk 3 til 4 inden for 250 x 250 μ m 2 opsamles langs x-aksen, før der skiftes flyet og gentage samme funktioner for den nye plan.
6.. Kraft kalibrering
- Forbered en glycerolopløsning ved at blande 39,8 g glycerol med 190 μ l bi-destilleret vand og 10 ul af magnetiske partikler i en 2 x 10 9 partikler / ml og fylde en eksperimentel kanal med denne blanding og læg den på mikroskopbordet som beskrevet for biofilmen prøven.
- Efter installation af magnetiske pincet som angivet i afsnit 4, anvende den magnetiske kraft, som angivet i afsnit 5.4 og gøre time-lapse billeder at udtrække hver enkelt hastighed partikel (v) og sin position i kapillarrøret at udlede kalibreringen fil. Denne fil skal indeholde den påførte kraft som funktion af sin position i den zone af analysen af kapillær ifølge Stokes lov, F = 6πRηv (R: radius af partiklen).
7.. Analyse
- Brug en "partikel tracker" software til at opnå tekstfiler med partikel positioner i hver ramme for alle de stakke af billeder, der er erhvervet som angivet i afsnit 5. Using billedet stakken erhvervelse frekvens, beregne forskydningen partikel som en funktion af tid (fx figur 5 og video 4).
- Brug af force kalibrering fil, konvertere kurver fortrængningsmaskinerne til compliance-kurver (total overholdelse af materialet - J (t) - som en funktion af tiden) i henhold til overholdelse formel:
som giver forholdet mellem materiale stamme og anvendt stress for en sonde partikel med radius R indlejret i en inkompressibel, homogen viskoelastisk medie som tidligere var indført ved Schnurr og medarbejdere 19. - Juster krybe overholdelse kurver til den generelle Burgers model for viskoelastiske materialer og udlede de viskoelastiske parametre J 0, J1, η 0, η 1 for hver partikel (
Bemærk: Denne fænomenologisk analyse har tidligere været ansat i en bred vifte af materialer, herunder biologiske materialer, såsom biofilm at fortolke makroskopiske rheologimodificerende data 20-22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En typisk analyse vil give den rumlige fordeling af viskoelastiske parametre på micron skala på en levende biofilm uden at forstyrre dens originale arrangement. Typiske resultater er vist i figur 7, hvor værdierne af J 0 - den elastiske opfyldelse - er givet som en funktion af z-aksen langs dybden og på y-aksen langs en lateral dimension af biofilmen. Hvert punkt svarer til en kugle, som krybe kurve analyse har givet en J 0 værdi. De data viste, at den lokale overholdelse varierede langs dybden af biofilm over næsten tre størrelsesordener, men også, at stærke lateral heterogenitet fandt sted på alle biofilm højder.
Dataene gav også adgang til fordelingen af compliance værdier, som udviste her en udbredt og asymmetriske form (figur 8), der giver stærke indikationer på, at mekaniske egenskaber af biofilm blev støttet afstærkt tværbundne polymergeler. Faktisk har analog adfærd tidligere blevet demonstreret på koncentrerede og stærkt tværbundne actin geler 23.
Hertil kommer, in situ målinger af biofilm lokale ejendomme udført under forskellige miljøforhold såsom lavere flow disse gøre det muligt at påvise effekten af sådan en variant af den interne organisation biofilm. I figur 9, compliance værdier af en biofilm dyrket ved 0,1 ml / time udviste en stadig stærkt heterogen mekanisk profil, men ikke højere stivhed dybere biofilmlag sammenlignet med biofilm dyrket ved 1 ml / time. Disse resultater viste signifikant effekt af de eksterne forhold på biofilmen organisation.
Figur 2. Positionering af de magnetiske pincet med hensyn til kapillarrøret på mikroskopbordet og definition af det rumlige refererende. Ovenfra angiver placeringen af målezonen i kapillarrøret.
Figur 3. Synkronisering af signalerne over 40 sek periode.
857/50857fig4.jpg "/>
Figur 4.. Eksperiment oversigt skitse.
Figur 5. Ekstrakter fra partikelbanen analyse. Panel A viser til venstre et billede af en typisk partikel på sin udgangsstilling lige før magnetisk kraftpåvirkning (tid 23.79 sek i 40 sek periode), og på den højre position af partiklen på 30 sek sammen med visning af den bane findes ved hjælp ImageJ partikel tracker Panel B viser plot af kurven forskydning stammer fra disse data.; viser vi her en bane ekstrakt begyndende ved tid 23.79 sek op til tiden t = 31.29 sek i 40 sek periode.
Figur 6. Viskoelastiske parameter afledning på grundlag af den fænomenologiske model af Burger. (A) burgere mekanisk model, som består i en kombination af elastisk Hookean fjederen (J 0) og newtonsk dashpot (η 0) i serie med en Maxwell element (fjeder ( J 1) og dashpot (η 1) i parallel). (B) Creep eksperimenterende spor i blå sammen med kurven (i grønt) justeret til den Burgers ligning.
Figur 7. Rumlige fordeling af elastisk overholdelse i en biofilm dyrket 24 timer ved 37 ° C under 1 ml / time næringsstoffer flyde. Compliance-værdier rapporteret af hver partikel er repræsenteret her som en projektion på et (YZ) flyet ved hjælp af en kølig at varme brugerdefineret farve kort. Compliance-værdier rapporteret af partikler er placeret i det nederste lag af biofilmen er alle lavere end 0,2 m 2 / N, mens partikler findes i de øverste 15 μ m lag rapport værdier over 1 m 2 / N.
Figur 8. Normaliserede fordelinger af viskoelastiske parametre opnået i biofilm (A) og i glycerol (B), en homogen viskos væske. Biofilm udviste asymmetrisk og bred fordeling (skævhed på 3,6 og normaliseret varians 2.4) indikerende materiale heterogenitet. Derimod blev symmetrisk og smal fordeling kendetegner en homogen medium opnået i glycerol (skævhed på 0,23 og normaliseret varians 0,03).
Figur 9. Rumlige fordeling af elastisk overholdelse i en biofilm dyrket 24 timer ved 37 ° C under en lavere mængde på 0,1 ml / time næringsstoffer flow. Er Compliance værdier repræsenteret ifølge biofilmen dybde. Symbol farver giver compliance intervaller.
Figur 10. Magnetisk pol plan. Dimensionerne fremgår af cm.
Figur 11. Magnetiske pincet ledninger. Panel A - bruges til stramt vind de 2.120 drejninger af kobbertråd og bygge den magnetiske spole (panel B), før du sætter den bløde magnetiske legering pol i dens centrum. Jævnstrøm tilføres i spolen definerer magnetiske polaritet, som vist i panel C. Se også eksperimentere oversigt skitse i Figur 4..
Video 1: Denne film viser den indledende fase af biofilm lige efter injektion af celle-partikel-blandingen i kapillarrøret. Erhvervelse frekvens er 1 billede / sek og filmen afspilles med 10 billeder / sek. Klik her for at se denne video.
Video 2: Denne film viser biofilmen efter 4 timer vækst. Partikler gradvist frigøres fra overfladen, der skal fordeles i b iofilm volumen, blå pile markerer udstationeringsprocedurer begivenheder. Erhvervelse frekvens er 2 image / min, og filmen afspilles med 15 billeder / sek. Klik her for at se denne video.
Video 3: Biofilm efter 20 timers vækst. Filmen er taget i en midterste plan placeret 20 um over kapillær bunden. Billeder blev erhvervet ved 2 billeder / min frekvens og film afspilles med 15 billeder / sek. Klik her for at se denne video.
Video 4: Typisk partikel tracking bruge ImageJ. Filmen viser et uddrag af hele sekvensen starter ved tid 23 sek og slutter ved 30 sek. Gul bane viser partikel forskydning ved magnetisk aktivering. Erhvervelse frekvens er 30 billeder / sek og filmen afspilles med 30 billeder / sek.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video4.avi "target =" _blank "> Klik her for at se denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne magnetisk partikel såning og trække eksperiment aktiveret in situ 3D kortlægning af viskoelastiske parametre for en voksende biofilm i sin oprindelige tilstand. Denne fremgangsmåde viste mekaniske heterogenitet af E. coli biofilm dyrkes her og gav spor at påpege de biofilm komponenter understøtter de biofilm fysiske egenskaber, hvilket kraftigt antyder en grundlæggende konsekvens af den ekstracellulære matrix og mere præcist dens grad af krydsbinding.
Anerkendelsen af mekaniske egenskaber mønstre i bakteriel biofilm er afgørende for opbygningen af en omfattende repræsentation af disse komplekse materialer. Disse resultater åbner op den måde at klarlægge årsagssammenhænge forbinder mekaniske mønstre og biologiske heterogeneities såsom genekspression microniches, som skal hjælpe afklare de drivende kræfter understøtter biofilm udvikling.
Indtil nu, er spørgsmålet om biofilmen mechaniske egenskaber var rettet hovedsageligt fra et makroskopisk synspunkt og ofte ved at skrabe biofilm fra sin oprindelige websted 8,9,12,13, som udgør en alvorlig risiko for tab af data. Vores noninvasiv metode bringer om første in situ karakterisering af biofilmen 3D mekaniske profil i dens oprindelige miljø.
Tilgangen endnu har en begrænsning med bopæl i de særlige kendetegn ved den magnetiske fjernbetjeningsanordningen af kolloide sonder. Faktisk viser den en iboende vifte af tilgængelige styrker givet af pole-partikel afstand, pole materialeegenskaber og spole ydeevne. Den nuværende konfiguration af opsætning aktiveret sondering af Stivhedsværdier op til 200 Pa, hvilket var tilstrækkeligt til de undersøgte her biofilm. Ikke desto mindre, yderligere engineering af vores set-up - involverer for eksempel elektromagnet køling - skal muliggøre flytning af magt og frister med en faktor 2 til 3.
We arbejder i øjeblikket på om de fysiske og dynamiske egenskaber i en biofilm undersøger forholdet forbinder lokale viskoelastiske parametre rapporteret af den passive forskydning af sonde på et større tidsskala. Derudover undersøger vi effekten af forskellige kemikalier rettet mod forskellige dele af biofilm på dets mekaniske profil.
Denne nye tilgang afslører detaljerne i bakterielle biofilm interne mekanik og bidrager til en bedre forståelse af disse levende strukturer, afgørende fra en ingeniør synspunkt for biofilm kontrol formål, men også fra et grundlæggende synspunkt at afklare forholdet mellem de arkitektoniske egenskaber og den specifikke biologi af disse strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde var delvist støttet af tilskud fra Agence Nationale pour la Recherche, PIRIbio program Dynabiofilm og fra CNRS Tværfaglig Risk-program. Vi takker Philippe Thomen for hans kritisk læsning af manuskriptet og Christophe Beloin for at give E. coli-stamme, der anvendes i dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and cells | |||
| Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter |
| Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline. | |
| Table 2: Capillaries and tubing | |||
| Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | |
| Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3 mm |
| Table 3: Biofilm growth | |||
| Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | Standard medium used to grow bacteria. |
| M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria. | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose. |
| Table 4: Electronics | |||
| Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | |
| Heater controller | World precision instruments | 300354 | |
| Function generator | Agilent technologies | 33210A | |
| Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | |
| Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | |
| Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | |
| Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | |
| Table 5: Optics | |||
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | |
| S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth. | |
| Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. |
| Table 6: Image analysis | |||
| ImageJ | NIH - particle tracker plugin | ||
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S. Battling biofilms. Scientific American. 285, 74-81 (2001).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6, 199-210 (2008).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: an in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnology and bioengineering. 65, 83-92 (1999).
- Klapper, I., Rupp, C. J., Cargo, R., Purvedorj, B., Stoodley, P. Viscoelastic fluid description of bacterial biofilm material properties. Biotechnol Bioeng. 80, 289-296 (2002).
- Korstgens, V., Flemming, H. C., Wingender, J., Borchard, W. Uniaxial compression measurement device for investigation of the mechanical stability of biofilms. Journal of microbiological. 46, 9-17 (2001).
- Cense, A. W., et al. Mechanical properties and failure of Streptococcus mutans biofilms, studied using a microindentation device. Journal of microbiological methods. 67, 463-472 (2006).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Physical Review Letters. 93, (2004).
- Towler, B. W., Rupp, C. J., Cunningham, A. B., Stoodley, P. Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis. Biofouling. 19, 279-285 (2003).
- Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy. Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).
- Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Micro-cantilever method for measuring the tensile strength of biofilms and microbial flocs. Journal of microbiological methods. 55, 607-615 (2003).
- Aggarwal, S., Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Development and testing of a novel microcantilever technique for measuring the cohesive strength of intact biofilms. Biotechnology and bioengineering. 105, 924-934 (2010).
- Guélon, T., Mathias, J. -D., Stoodley, P. Biofilm Highlights. Series on Biofilms (eds Hans-Curt Flemming, Jost Wingender, & Ulrich Szewzyk). 5, Springer. Berlin Heidelberg. (2011).
- Galy, O., et al. Mapping of Bacterial Biofilm Local Mechanics by Magnetic Microparticle Actuation. Biophysical journal. 103, 1-9 (2012).
- Schnurr, B., Gittes, F., MacKintosh, F. C., Schmidt, C. F. Determining Microscopic Viscoelasticity in Flexible and Semiflexible Polymer Networks from Thermal Fluctuations. Macromolecules. 30, 7781-7792 (1997).
- Aggarwal, S., Hozalski, R. M. Effect of Strain Rate on the Mechanical Properties of Staphylococcus epidermidis Biofilms. Langmuir. 28, 2812-2816 (2012).
- Towler, B. W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law. Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).
- Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms. Biofouling. 27, 207-215 (2011).
- Apgar, J., et al. Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles. Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).
