Summary
מאמר זה מציג את המתודולוגיה מקורית המבוססת על actuation מרחוק של חלקיקים מגנטיים זורעים בbiofilm חיידקים וההתפתחות של פינצטה המגנטית ייעודית למדידה באתרו את התכונות מכאניות המקומיות של החומר החי המורכב שנבנה על ידי מיקרו אורגניזמים בממשקים.
Abstract
הידבקות חיידקים וצמיחה בממשקים להוביל להיווצרות של biofilms מבנים הטרוגנית תלת ממדים שנקרא. תאי מגורים במבנים אלה מוחזקים יחד על ידי אינטראקציות פיזיות מתווכות על ידי רשת של חומרים פולימריים תאיים. biofilms חיידקים להשפיע על פעילות אנושית רבות וההבנה של המאפיינים שלהם היא קריטית לשליטה טובה יותר של ההתפתחות שלהם - תחזוקה או חיסול - תלוי בתוצאה השלילית או חיובית שלהם. מאמר זה מתאר מתודולוגיה חדשנית במטרה למדוד באתרו את התכונות פיזיות המקומיות של biofilm שהיה, עד עכשיו, בדק רק מבחינה חומרית מקרוסקופית והומוגנית. הניסוי המתואר כאן כרוך בהחדרת חלקיקים מגנטיים לbiofilm גדל זרע בדיקות מקומיות שיכול להיות מופעלים מרחוק מבלי להפריע את המאפיינים המבניים של biofilm. פינצטה המגנטית ייעודי היתה developed להפעיל כוח מוגדר על כל חלקיק המוטבע בbiofilm. ההתקנה היא רכוב על הבמה של מיקרוסקופ כדי לאפשר ההקלטה של תמונות של התקופה מושך חלקיקי זמן לשגות. אז מסלולי החלקיקים המחולצים הרצף מושך ופרמטרי viscoelastic המקומיים נגזרים מכל עקומת עקירת חלקיקים, וכך לספק את הפצת 3D-המרחבי של הפרמטרים. השגת תובנות הפרופיל המכני biofilm הוא חיוני מנקודת המבט של מהנדס למטרות בקרת biofilm, אלא גם מנקודת מבט בסיסית כדי להבהיר את הקשר בין המאפיינים האדריכליים והביולוגיה הספציפית של מבנים אלה.
Introduction
biofilms חיידקים הם קהילות של חיידקים הקשורים למשטחים ביולוגיים או מלאכותיים 1-3. הם יוצרים על ידי מנגנון הידבקות צמיחה בשילוב עם הייצור של תאי מטריקס פוליסכריד עשיר שמגן ומייצב את המבנה 4,5. biofilms אלה אינם מכלולים פשוט פסיביים של תאים נדבקו למשטחים, אבל מאורגן ומערכות ביולוגיות מורכבות דינמיות. כאשר חיידקים לעבור מפלנקטון לאורח החיים biofilm, שינויים בביטוי גנים ופיזיולוגיה של תאים הם נצפו, כמו גם התנגדות מוגברת לantimicrobials ולארח הגנה חיסונית להיות במקור של זיהומים מתמשכים וכרוניים רבים 6. עם זאת, הפיתוח המבוקר של מבני חיים אלה מציעים גם הזדמנויות ליישומים תעשייתיים וסביבתיים, כגון bioremediation של אתרי פסולת מסוכנים, ביו סינון של מים או היווצרות של ביו מחסומים כדי להגן על קרקע ומי תהום מcontamin תעשייתייםation.
בעוד תכונות מולקולריות ספציפיות לדרך biofilm החיים מתוארות יותר ויותר, את המנגנונים המניעים את התפתחות הקהילה והתמדה עדיין אינם ברורים. שימוש בהתקדמות שחלה באחרונה במדידות microscale באמצעות אלקטרוכימיים סריקה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ארגוני חיים אלה הוכחו תערוכה ניכרת מבני, כימי וביולוגית ההטרוגניות 7. עם זאת, עד עכשיו, מכניקת biofilm נבדק בעיקר macroscopically. למשל, התבוננות בסרטי biofilm עיוות עקב שינויים בשיעורי זרימת נוזל 8,9, דחיסת uniaxial של חתיכות biofilm להרים ממדיום אגר או גדלה על הכיסוי מחליק 10,11, גזירה של biofilm שנאסף מהסביבה ולאחר מכן הועבר למקביל rheometer צלחת 12,13, ספקטרוסקופיה כוח אטומי באמצעות חרוז זכוכית ומצופה עם biofilm חיידקים מצורפים AFM שלוחה 14 או MICR ייעודישיטת ocantilever למדידת חוזק המתיחה של שברי biofilm מנותקים 15,16 יושמו במהלך עשר השנים האחרונות, ומספקת מידע שימושי על טבע viscoelastic של החומר 17. עם זאת, סביר להניח שמידע על תכונות מכאניות biofilm אתרו הולך לאיבוד כאשר החומר מוסר מהסביבה המקורית שלו, שהייתה קורים לעתים קרובות בגישות אלה. יתר על כן, הטיפול של biofilm כחומר הומוגני מחמיץ את המידע על ההטרוגניות האפשרית של התכונות פיזיות בקהילה. לכן, ההשלכות של מכניקת המבנה בהיווצרות biofilm ותכונות ביולוגיות כגון דפוסים ביטוי גנים או הדרגתיים כימי המדויקות בקושי יכולות להיות מוכרות. כדי להתקדם לכיוון תיאור microscale של התכונות פיזיות biofilm, כלים ייעודיים חדשים נדרשים.
מאמר זה מפרט את הגישה מקורית יזום כדי להשיגמדידה של פרמטרים מקומיים מכאניים באתר, מבלי להפריע את biofilm ומאפשר ציור של הפריסה המרחבית של תכונות חומר microscale ולאחר מכן ההטרוגניות מכאנית. העיקרון של הניסוי נשען על הסימום של biofilm גדל עם microparticles המגנטי ואחרי הטעינה מרחוק שלהם באמצעות פינצטה מגנטית בbiofilm הבוגר. עקירת חלקיקים תחת יישום כוח מגנטי מבוקר צילם מתחת למיקרוסקופ מאפשרת גזירת פרמטר viscoelastic מקומית, כל חלקיק דיווח הסביבה המקומית משלה. מתוך נתונים אלה, הפרופיל המכני 3D של biofilm ניתן להסיק, חושף dependences מצב מרחבית וסביבתי. כל הניסוי תוכלו לראות כאן על E. biofilm coli שנעשה על ידי זן מהונדס גנטי נושא פלסמיד כמו F-derepressed. התוצאות מפורטות במאמר האחרון 18 מספקות חזון ייחודי של הפנים של מכניקת biofilm ללא פגע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חיידקי תרבות והכנת השעיה
- פיק מושבה גדלה טרי מצלחת אגר Lysogeny מרק (LB), לחסן אותו ב 5 מיליליטר מדיום LB נוזלי המכיל 100 גר '/ מיליליטר אמפיצילין μ ו7.5 גר' / מיליליטר טטרציקלין μ ודגירה אותו במשך 5 עד 6 שעות ב 37 ° C ב רועד פלטפורמה.
- לאחר מכן, להוסיף 100 l μ של תרבות החיידקים ב5 מיליליטר בינוני מינימום (M63B1) בתוספת גלוקוז 0.4% ואותם ריכוזי האנטיביוטיקה. דגירה לילה תרבות טרי בדילול זה על 37 מעלות צלזיוס על פלטפורמה רועדת.
- לאחר 16 שעות של דגירה, להוסיף 100 μl תרבות הלילה עד 5 מיליליטר M63B1, גלוקוז 0.4%. שמור את הצינור על 37 C ° לפלטפורמה הרועדת עד 0.5 OD הוא הגיע. ההשעיה היא אז מוכנה להזרקה לתוך תעלת הניסוי ליצירת biofilm.
2. הכנת חלקיקים מגנטית
- קח 10 חלקיקים מגנטיים μl -2.8 μ מ 'קוטר - מהמניות ולשטוף אותם פי 3 ב190 בינוני מינימום μl בעזרת מתלה מדגם מגנטי.
- התאם את ריכוז חלקיקים ל5 x 10 6 מיליליטר / חרוזים. בדרך כלל 50 μl של הפתרון חרוז שטף מעורבב עם l 950 μ נוסף של M63B1 עם גלוקוז 0.4%.
3. ערוץ הכנה וBiofilm צמיחה
- השמה ערוץ
- חותך שתי נימי הזכוכית בורוסיליקט מרובעות (800 מ μ אורך צד) 10 סנטימטר ארוכה כדי להשיג חתיכות ארוכות שני 8 סנטימטר.
- מדביקים את שני חתיכות נימים בשתי שקופיות זכוכית - לחתוך במחצית ראשונה - מלבד 2 סנטימטר עם הסככה 1 סנטימטר בכל צד כמו באיור 1 באמצעות דבק הפועל במהירות cyanoacrylate (מה שנקרא סופר דבק).
- החיטוי וההתקנה כל צינורות הנדרשים לחיבור ערוץ נוסף.
- אסוף את כל החומרים סטריליים תחתזרימה למינרית: i) את הערוץ ומלכודת 1 הרכובים, ii) צינורות ומחברים, iii) שתי מלכודות בועה - מסנן הבועה נפוץ המשמש לאבטחה של ילדי האכלת טפטוף (מלכודת 1) ואת מלכודת בועת תוצרת הבית כצינור ארוך 4 סנטימטר בקוטר גדול יותר (מלכודת 2), ד) מהדק, v) 30 מיליליטר מזרקים מלאים בM63B1, גלוקוז 0.4%, וצמי) בקבוק פסולת.
- חברו את כל ההתקנה עם connecters Luer נעילה או צמתים לפי הסדר הבא: 50 מיליליטר נשלט על ידי משאבת המזרק, מסנן בועת ילדים, מלכודת בועת תוצרת בית, נימים (איור 1, לוח ב '), והצינור לבקבוק פסולת M63B1 המזרק. ואז למלא את ההתקנה עם M63B1 סטרילי, גלוקוז 0.4%, הפעלת משאבת המזרק בשיעור של כ -10 מיליליטר / שעה, גבוהה יותר מהשיעורים הניסיוניים. לעקוב בזהירות ולחסל את כל הבועות במעגל.
- זרימה בינונית באמצעות מערכת ל10-15 דקות; במקביל לערבב 1 מיליליטר של ההשעיה החיידקים ב0.5 OD מסעיף1.3 עם 1 מיליליטר של הפתרון חרוז שטף הכין בסעיף 2.2.
- צרף (אבל לא לסגור) מהדק לצינורות בשתי עמדות: לפני ואחרי את נימי הדם. לעבור את הזרימה כבויה.
- להציג את תערובת חיידקי החרוז לתוך הנימים לאחר מלכודת בועת תוצרת הבית באמצעות מזרק 1 מיליליטר, מקפיד להחזיק את הצינור מסתיים למניעת כניסת אוויר. לצרף מחדש את הצינור ולאחר מכן לסגור את מהדק.
- חזור על אותו ההליך לנימים השניה וסמן את כל הצינורות לבועות.
- העבר את המכשיר למיקרוסקופ ולאפשר לו לעמוד על 15-20 דקות כדי לאפשר לחיידקים להתיישב ולצרף אל פני השטח של הנימים. התקן את הנימים לבמה מיקרוסקופ עם מיכל הפסולת ברמה מעט גבוהה יותר. מקם את משאבת המזרק על גבי הדלפק ליד מיקרוסקופ. לרומם את מלכודת הבועה לפני הנימים מעט גבוהות יותר ממטוס הנימים ללכוד בועות.
- Biofilm Growth
- התאם את קצב הזרימה במשאבת המזרק ולהתחיל את הזרימה, biofilm כעת לפתח על פני השטח הנימים במהלך התקופה הנדרשת - בדרך כלל 24 או 48 שעות בניסויים אלה.
- פוקוס על המטוס התחתון הנימים ולהתחיל את הקלטת הזמן לשגות של התמונות לדוגמא - בדרך כלל בתדירות רכישה של 2 תמונות / דקה תהיה מספק לדווח על צמיחת biofilm. צגי וידאו biofilm פוסט שליטה זו צמיחה (ראה תמציות בוידאו 1, 2 ו -3).
4. התקנה מלקטת מגנטי
- בורג פינצטה המגנטית על micromanipulators XYZ נשלט באופן ידני ולדפוק את micromanipulators על הבמה מיקרוסקופ כדי להתאים את המיקום של פינצטה יחסית לנימים. הנח את פינצטה כמו באיור 2 כדי להבטיח את שיפוע השדה מגנטי המתאים מופק באזור התצפית.
- חבר את t פינצטהo גנרטור הפונקציה באמצעות מגבר הכוח כדי ליצור תקופת 40 שניות של זמן עשויה 24 שניות אפס אות ו16 שניות של 4 נוכחית ישיר עם הדק נשלח לבהיר תריס אור השדה לאחר 20 שניות לסנכרון אות מתן רצף של אירועים כמו באיור 3.
הערה: ניתן להשיג את שתי פעולות אלו בכל עת בין התקנת נימים ותחילת מדידה. ראה להתנסות סקיצה סקירה באיור 4.
5. הזחילה Curve רכישה
- השתמש בבקרת תנועת XY של הבמה מיקרוסקופ כדי להביא את הקצה של הקוטב המגנטי השמאלי והשמאלי הקצה של הנימים באותו תחום התצפית. קח את המקור של הקשרים הניתוח בצומת של ה-X וה-Y צירים שהוגדרו על ידי הקצה של הנימים וקצה חתיכת המוט, בהתאמה (ראה איור 2).
- התאם את המיקום האנכי של הנימים באמצעות קנס ג פוקוסידית ontrol של עמדת מיקרוסקופ. בדרך כלל בדק את המטוס הראשון ממוקם בין 4 עד 7 μ מ 'מעל תחתית הנימים. 1 הווידאו מתאים לשדה XY שיש לו הפינה השמאלית העליונה שלה במקור של הקשרים מרחביים.
- לעורר את רצף 40 שניות של אירועים שתוארו בסעיף 4.2 ואיור 3 על ידי מעבר על הגנרטור הנוכחי ובה בעת, לעורר באופן ידני את רצף רכישת תמונה של 1 וידאו.
- הזז את הנימים לשדה הימני השכן על ידי תרגום μ מ '250 של הבמה מיקרוסקופ לשמאל ולפעול כאמורים בסעיף 5.3 ליצור וידאו 2 של פרוסה 2 וכן הלאה כדי להשיג את קטעי הווידאו הנדרשים. 3 עד 4 בדרך כלל תחומי 250 x 250 μ מ 2 נאספים לאורך ציר ה-x לפני שינוי המטוס וחוזר על אותן פעולות עבור המטוס החדש.
6. חיל כיול
- הכן פתרון גליצרול על ידי ערבוב 39.8 גרם של גליצרול עם 190 μ ליטר של מים מזוקקים ודו 10 μl של חלקיקים מגנטיים ב2 x 10 9 מיליליטר / חלקיקים ולמלא את הערוץ ניסיוני בתערובת זו ולמקם אותו על הבמה מיקרוסקופ כפי שתואר למדגם biofilm.
- לאחר התקנת פינצטה המגנטית כאמור בסעיף 4, החל את הכוח המגנטי כאמור בסעיף 5.4 ולהפוך את הזמן לשגות תמונות כדי לחלץ כל חלקיק וחלקיק מהירות (V) ואת עמדתה בנימים כדי להפיק את קובץ הכיול. קובץ זה צריך להכיל את הכוח ליישם כפונקציה של מיקומו באזור של ניתוח של הנימים על פי חוק סטוקס, F = 6πRηv (R: רדיוס של החלקיקים).
7. ניתוח
- השתמש בתוכנת "חלקיק גשש" לקבל קבצי טקסט עם עמדות חלקיקים בכל מסגרת לכל הערימות של תמונות שנרכשו כאמור בסעיף 5. מנצלg את תדירות רכישת מחסנית התמונה, לחשב את תזוזת החלקיק כפונקציה של זמן (למשל איור 5 ו -4 וידאו).
- שימוש בקובץ כוח הכיול, להמיר את עקומות עקירה לעקומות ציות (תאימות כוללת של החומר - J (t) - כפונקציה של זמן) על פי נוסחת העמידה:
אשר נותן את היחס בין מאמץ חומר ויישם מתח לחלקיקי בדיקה של R הרדיוס מוטבע במדיום viscoelastic בלתי דחיס, הומוגנית כפי שנקבעו בעבר על ידי Schnurr ועמיתים לעבודה 19. - התאם את עקומות ציות השרץ למודל בורגרס הכללי לחומרי viscoelastic ולגזור את הפרמטרים viscoelastic, J 0, 1 J, η 0, η 1 עבור כל חלקיק (
הערה: ניתוח הפנומנולוגית זה כבר הועסק בעבר למגוון רחב של חומרים, כולל חומרים ביולוגיים כגון biofilms לפרש נתונים rheology מקרוסקופית 20-22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח טיפוסי יספק את הפריסה המרחבית של הפרמטרים viscoelastic בקנה מידת מיקרון בbiofilm חיים מבלי להפריע להסדר המקורי שלה. תוצאות אופייניות מוצגות באיור 7 שבו הערכים של 0 J - ציות האלסטיות - מקבלים כפונקציה של Z-הציר לאורך העומק ושל ציר ה-Y לאורך ממד רוחב של biofilm. כל נקודה מתאימה לחרוז שניתוח עקום השרץ סיפק ערך J 0. נתוני המחקר מראה כי הציות מקומי מגוון לאורך העומק של biofilm על פני כמעט שלושה סדרי גודל, אלא גם כי הטרוגניות רוחב חזקה התרחש בכל הגבהים biofilm.
הנתונים גם נתנו גישה להתפלגות של ערכי הציות אשר מוצגים כאן בצורה נרחבת ולא סימטרית (איור 8), המספק אינדיקציות חזקות כי תכונות מכאניות של biofilm היו נתמכות על ידימאוד צולבים ג'לי פולימר. אכן, התנהגות מקבילה כבר הוכיחה בעבר על ג'לים אקטין מרוכז ומאוד צולבים 23.
בנוסף, אלה במדידות באתר של נכסים המקומיים biofilm בוצעו תחת תנאים סביבתיים שונים כגון קצב זרימה נמוך מאפשרים להדגים את ההשפעה של שינוי כזה על הארגון הפנימי biofilm. באיור 9, ערכי הציות של biofilm גדל ב0.1 מיליליטר / שעה הציגו פרופיל מכאני עדיין הטרוגנית מאוד אבל אין קשיחות גבוהה יותר של שכבת biofilm העמוקה יותר בהשוואה לbiofilm גדל ב 1 מיליליטר / שעה. תוצאות אלה הראו ההשפעה המשמעותית של התנאים החיצוניים על ארגון biofilm.
איור 2. מיקום של פינצטה המגנטית ביחס לנימים על הבמה מיקרוסקופ וההגדרה של הקשרים מרחביים. המבט מלמעלה מציין את המיקום של אזור המדידה בנימים.
איור 3. סנכרון של האותות על פני תקופת 40 שניות של זמן.
857/50857fig4.jpg "/>
איור 4. ניסוי סקיצה סקירה.
איור 5. תמציות מניתוח מסלול חלקיקים. לוח מראה בצד שמאל את התמונה של חלקיק טיפוסי בעמדתו הראשונית שלה רק לפני יישום כוח מגנטי (זמן שניות 23.79 תקופת 40 שניות) ומצד ימין את עמדתו של החלקיק ב זמן 30 שניות יחד עם התצוגה של המסלול מצא באמצעות גשש חלקיקי ImageJ לוח ב 'מציג את העלילה של עקומת העקירה נגזרת מנתונים אלה.; כאן אנו מציגים תמצית מסלול מתחילים בזמן 23.79 שניות עד הזמן t = 31.29 שניות של תקופת שניות 40.
איור 6. גזירת Viscoelastic פרמטר על בסיס המודל הפנומנולוגית של בורגר. () המבורגרים מודל מכאני המורכב בשילוב של קפיץ אלסטי Hookean (J 0) וdashpot הניוטונית (η 0) בסדרה עם אלמנט מקסוול (באביב ( J 1) וdashpot (η 1) במקביל). (ב) זחילת עקבות ניסיוניות בכחול יחד עם העקומה (בירוק) המותאמת למשוואה בורגרס.
איור 7. פריסה המרחבית של ציות אלסטי בbiofilm גדל 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס מתחת 1 מיליליטר / חומרים מזינים שעות לזרום. ערכי ציות שדווחו על ידי כל חלקיק מיוצגים כאן כהשלכה על מטוס (YZ) באמצעות מגניב כדי לחמם את המפה בצבע מותאמת אישית. ערכי ציות שדווחו על ידי חלקיקים הנמצאים בשכבה התחתונה של biofilm כולם נמוכים יותר מ0.2 מ 2 / N ואילו חלקיקים שנמצאו בערכי 15 דו"ח שכבת μ מ 'העליונים מעל 1 מ' 2 / נ
איור 8. הפצות מנורמלות של הפרמטרים viscoelastic הושגו בbiofilm () וגליצרול (ב '), נוזל צמיג הומוגנית. Biofilm הציג התפלגות סימטרית ורחבה (הטיה * של 3.6 ושונות מנורמל 2.4) המצביע על הטרוגניות חומר. לעומת זאת, סימטרי והפצה צרה אפיון בינוני הומוגנית הושגו בגליצרול (הטיה * של 0.23 ושונות מנורמל 0.03).
איור 9. פריסה המרחבית של ציות אלסטי בbiofilm גדל 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס תחת זרימה נמוכה של 0.1 זרימת חומרים מזינים מיליליטר / שעה. ערכי ציות מיוצגים לפי עומק biofilm. צבעי סמל לתת טווחי התאימות.
איור 10 תכנית קוטב מגנטית.. ניתנות מידות בס"מ.
איור 11. חיווט פינצטה מגנטית. בלוח - משמש בחוזקה בסופו של 2,120 הסיבובים של חוט נחושת ולבנות את הסליל המגנטי (לוח ב ') לפני הכנסת מוט סגסוגת מגנטית הרך במרכזו. זרם ישיר מסופק בסליל המגדיר קוטביות מגנטית כפי שמוצג ב-C פנל. ראה גם להתנסות סקיצה סקירה באיור 4.
1 וידאו: סרט זה מראה את השלב הראשוני של biofilm רק לאחר ההזרקה של תערובת תא חלקיקים בנימים. תדירות רכישה היא תמונת 1 / שניות והסרט הוא שיחק ב10 מסגרות / sec. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
וידאו 2: סרט זה מציג את biofilm לאחר 4 צמיחת שעה. חלקיקים בהדרגה מנותקים מפני השטח שיחולק לב נפח iofilm, חיצים כחולים מסמנים אירועי התנתקות. תדירות רכישה היא 2 תמונה / דקות והסרט הוא שיחק ב15 מסגרות / sec. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
וידאו 3: Biofilm לאחר 20 צמיחת משאבי אנוש. הסרט שצולם במטוס באמצע ממוקם 20 מיקרומטר מעל תחתית הנימים. תמונות נרכשו ב2 תמונות / תדירות דקות והסרט הוא שיחק ב15 מסגרות / sec. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
וידאו 4: מעקב אחר חלקיקים אופייני באמצעות ImageJ. הסרט מציג תמצית של כל הרצף החל משעת הזמן 23 שניות ומסתיימת בזמן 30 שניות. צהוב מסלול מציג תזוזת חלקיקים על actuation המגנטי. תדירות רכישה היא 30 תמונות / שניות והסרט הוא שיחק ב30 מסגרות / שנייה.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video4.avi "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חלקיקים מגנטיים זה זריעה ומושכים ניסוי אפשר במיפוי 3D באתרו של הפרמטרים viscoelastic של biofilm גובר במצבו המקורי. גישה זו חשפה את ההטרוגניות מכאנית של א ' biofilm coli גדל כאן ונתן רמזים להצביע על רכיבי biofilm תמיכה בתכונות פיזיות biofilm, חזק המצביעים על משמעות בסיסית של המטריצה תאית ולייתר דיוק מידת cross-linking שלה.
זיהוי תבניות תכונות מכאניות בbiofilm חיידקים הוא חיוני לבניית ייצוג מקיף של חומרים אלה מורכבים. ממצאים אלה יפתחו את הדרך להבהיר את הקשרים סיבתיים מקשרים דפוסים מכאניים וheterogeneities ביולוגי כגון microniches ביטוי גנים, שאמורה לעזור להבהרת הכוחות המניעים שבבסיס פיתוח biofilm.
עד עכשיו, השאלה של Mecha biofilmמאפייני nical היו מופנים בעיקר מנקודת המבט מקרוסקופית ולעתים קרובות על ידי גירוד biofilm מהאתר שלה ראשוני 8,9,12,13, המייצג את הסיכון חשוב של אובדן מידע. השיטה לא פולשנית שלנו מביאה הראשון באפיון אתרו של הפרופיל המכני 3D biofilm בסביבתו המקורית.
הגישה עדיין יש מגבלה המתגוררת במאפיינים של actuation מרחוק המגנטי של בדיקות colloidal. ואכן, הוא מציג מגוון פנימי של כוחות נגישים שניתן על ידי מרחק מוט החלקיקים, תכונות חומר מוט וביצועי סליל. התצורה הנוכחית של ההגדרה אפשרה לחיטוט של ערכי קשיחות עד 200 אבא, שהיה מספיק לbiofilms נבחן כאן. אף על פי כן, הנדסה נוספת של ההגדרה שלנו - מעורב, למשל, קירור אלקטרומגנט - צריכה לאפשר הסטה של גבולות כוח והזמן בפקטור של 2 עד 3.
Wדואר עובד כרגע על הקשורים בתכונות פיזיות ודינמיות בbiofilm חוקר את הקשר המקשר פרמטרים viscoelastic מקומיים שדווחו על ידי העקירה הפסיבית של החללית בזמן בקנה מידה גדולה יותר. בנוסף, אנו בוחנים את ההשפעה של כימיקלים שונים מיקוד רכיבים שונים של biofilm על הפרופיל המכני שלה.
גישה חדשה זו חושפת את הפרטים של מכניקה הפנימית biofilm חיידקים ותורמת להבנה טובה יותר של מבנים אלה חיים, חיוני מהנקודה של מהנדס מבט למטרות בקרת biofilm, אלא גם מנקודת מבט בסיסית כדי להבהיר את הקשר בין המאפיינים האדריכליים וספציפיים ביולוגיה של מבנים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו הייתה חלק נתמך על ידי מענקים מNationale סוכנות הידיעות לשפוך la משוכלל ונדיר, תכנית PIRIbio Dynabiofilm ומתכנית סיכוני הבינתחומי CNRS. אנו מודים לפיליפ Thomen לקריאה הביקורתית של כתב היד וכריסטוף Beloin למתן א זן חיידק המשמש בעבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and cells | |||
| Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter |
| Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline. | |
| Table 2: Capillaries and tubing | |||
| Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | |
| Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3 mm |
| Table 3: Biofilm growth | |||
| Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | Standard medium used to grow bacteria. |
| M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria. | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose. |
| Table 4: Electronics | |||
| Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | |
| Heater controller | World precision instruments | 300354 | |
| Function generator | Agilent technologies | 33210A | |
| Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | |
| Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | |
| Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | |
| Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | |
| Table 5: Optics | |||
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | |
| S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth. | |
| Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. |
| Table 6: Image analysis | |||
| ImageJ | NIH - particle tracker plugin | ||
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S. Battling biofilms. Scientific American. 285, 74-81 (2001).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6, 199-210 (2008).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: an in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnology and bioengineering. 65, 83-92 (1999).
- Klapper, I., Rupp, C. J., Cargo, R., Purvedorj, B., Stoodley, P. Viscoelastic fluid description of bacterial biofilm material properties. Biotechnol Bioeng. 80, 289-296 (2002).
- Korstgens, V., Flemming, H. C., Wingender, J., Borchard, W. Uniaxial compression measurement device for investigation of the mechanical stability of biofilms. Journal of microbiological. 46, 9-17 (2001).
- Cense, A. W., et al. Mechanical properties and failure of Streptococcus mutans biofilms, studied using a microindentation device. Journal of microbiological methods. 67, 463-472 (2006).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Physical Review Letters. 93, (2004).
- Towler, B. W., Rupp, C. J., Cunningham, A. B., Stoodley, P. Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis. Biofouling. 19, 279-285 (2003).
- Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy. Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).
- Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Micro-cantilever method for measuring the tensile strength of biofilms and microbial flocs. Journal of microbiological methods. 55, 607-615 (2003).
- Aggarwal, S., Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Development and testing of a novel microcantilever technique for measuring the cohesive strength of intact biofilms. Biotechnology and bioengineering. 105, 924-934 (2010).
- Guélon, T., Mathias, J. -D., Stoodley, P. Biofilm Highlights. Series on Biofilms (eds Hans-Curt Flemming, Jost Wingender, & Ulrich Szewzyk). 5, Springer. Berlin Heidelberg. (2011).
- Galy, O., et al. Mapping of Bacterial Biofilm Local Mechanics by Magnetic Microparticle Actuation. Biophysical journal. 103, 1-9 (2012).
- Schnurr, B., Gittes, F., MacKintosh, F. C., Schmidt, C. F. Determining Microscopic Viscoelasticity in Flexible and Semiflexible Polymer Networks from Thermal Fluctuations. Macromolecules. 30, 7781-7792 (1997).
- Aggarwal, S., Hozalski, R. M. Effect of Strain Rate on the Mechanical Properties of Staphylococcus epidermidis Biofilms. Langmuir. 28, 2812-2816 (2012).
- Towler, B. W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law. Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).
- Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms. Biofouling. 27, 207-215 (2011).
- Apgar, J., et al. Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles. Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).
