Summary
Aktiviteten af enkelte neuroner fra voksen-alderen mus kan studeres ved at adskille neuroner fra bestemte områder af hjernen og ved hjælp af fluorescerende membranpotentialet farvestof billeddannelse. Ved afprøvning reaktioner på ændringer i glucose, kan denne teknik anvendes til at undersøge glucose følsomhed voksne ventromediale hypothalamus neuroner.
Abstract
Undersøgelser af neuronal aktivitet er ofte udføres ved hjælp af neuroner fra gnavere mindre end 2 måneder gamle på grund af de tekniske vanskeligheder, der er forbundet med stigende bindevæv og nedsat neuronal levedygtighed, der opstår med alderen. Her beskriver vi en metodologi for dissociation af sunde hypothalamus neuroner fra voksen-alderen mus. Evnen til at studere neuroner fra voksen-alderen mus tillader brugen af sygdomsmodeller der manifestere i en senere alder, og kan være mere udviklingsmæssigt nøjagtige for visse undersøgelser. Fluorescensimagografi af dissocierede neuroner kan anvendes til at studere aktiviteten af en population af neuroner i modsætning til anvendelse af elektrofysiologi at studere en enkelt neuron. Dette er især nyttigt, når man studerer en heterogen neuronal population hvori det ønskede neuronal type er sjældent såsom hypothalamus glucose sensing neuroner. Vi udnyttede membranpotentialet farvestof billeddannelse af voksne ventromediale hypothalamus neuroner til at studere deres svar til changes i ekstracellulær glukose. Glucose sensing neuroner menes at spille en rolle i det centrale regulering af energibalance. Evnen til at studere glukose sensing i voksne gnavere er særligt nyttigt, da overvægten af sygdomme relateret til dysfunktionel energibalance (f.eks. Fedme) øges med alderen.
Introduction
Hjernen regulerer energi homeostase gennem neuroendokrine og autonome nervesystem. Den ventromediale hypothalamus (VMH), der består af ventromedial kerne (VMN) og arcuate nucleus (ARC), er vigtig for den centrale regulering af energi-homeostase. Specialized glucose sensing neuroner, link inden for VMH neuronal aktivitet og perifer glukosehomeostasen 1. Der er to typer af glucose sensing neuroner, glucose exciterede (GE) neuroner stige, mens glucose hæmmede (GI) neuroner nedsætte deres aktivitet som ekstracellulære glucose stiger. VMH glucose sensing neuroner generelt undersøgt ved hjælp elektrofysiologi eller calcium / membranpotentiale følsomme farvestof billeddannelse.
Den elektrofysiologiske patch-clamp-teknikken anses for at være guldstandarden i studiet af ex vivo neuronal aktivitet. I denne teknik er en glasmikropipette elektrode fastgjort til cellemembranen via en høj modstand(GQ) sæl. Patch clamp elektroder tillader tidstro registrering af handling potentiale frekvens (strømtang) eller ion ledningsevne (spænding klemme) ændrer inden for en enkelt neuron. Mens patch-clamp-teknikken giver detaljerede oplysninger om ændringer i specifikke ion-kanal konduktanser en stor ulempe er, at kun en neuron kan observeres på et tidspunkt. Det tager ca 30-45 min for optagelsen til at kontrollere, at man optager fra en glukose sensing neuron før selv begynder en specifik eksperimentel behandling. Desuden GI og GE neuroner omfatter <20% af den samlede VMH neuronale population. Sammenblandingen dette problem er den manglende, i mange tilfælde en identifikation cellulær markør for disse neuroner. Således er det klart, at på trods af at give værdifulde elektriske information, som andre teknikker ikke kan, patch clamp-analyse er besværlig, tidskrævende og lavt udbytte.
Anvendelsen af fluorescens-billeddannelse af dissocierede VMH neuroner giver mulighed for undersøgelse af hundreds af neuroner samtidigt. Calcium følsomme farvestoffer kan anvendes til at måle intracellulære calcium ændringer, som indirekte korrelerer ændringer i neuronal aktivitet. Membranpotentiale følsomme farvestoffer anvendes til at overvåge membranpotentialet ændringer. Måling af cellulær membranpotentiale er et mere direkte indeks for neuronal aktivitet i forhold til ændringer i intracellulære calciumniveauer. Desuden membranpotentialet farvestof (MPD) billeddannelse potentielt registrerer mindre ændringer i membranpotentialet hvor handling potentiale fyring ikke ændres og intracellulære calcium niveauer kan ikke ændre. Begge disse fluorescens billeddannende teknikker er blevet brugt til at studere VMH glucose sensing neuroner fra unge mus 2-7. Mens resultaterne er mindre detaljerede end dem, der opnås med patch clamp elektrofysiologi, styrken af imaging eksperimenter er, at de samtidig vurdere en stor population af celler, som uundgåeligt omfatter et betydeligt antal glucose sensing neuroner. MPD billedbehandling is især nyttig til at studere GI neuroner, der er mere ensartet lokaliseret hele VMH og dermed yde et passende befolkning til at studere i dissocierede VMH (~ 15% GI). I modsætning hertil mens GE neuroner er tæt lokaliseret til ventrolaterale-VMN og celle ringe region mellem ARC og VMN, de repræsenterer ikke et betydeligt antal neuroner i VMH (<1% GE). Desuden ved at studere isolerede neuroner, astrocytisk og præsynaptiske virkninger elimineres. Dette kan være en fordel i at studere første ordens neuron virkninger, såvel som en ulempe, da fysiologiske forbindelser og fremgangsmåder er tabt.
En begrænsende faktor i både patch clamp-elektrofysiologi og MPD / calcium farvestof billeddannelse er behovet for at anvende yngre dyr (f.eks. Mus eller rotter <8 uger gamle). Dette skyldes overvejende øget bindevæv i kombination med nedsat neuronal levedygtighed, der opstår med alderen. I hjerne-skive elektrofysiologi studerne, øget bindevæv gør det vanskeligere at visualisere neuroner. Øget bindevævet gør det også vanskeligere at adskille et stort antal raske neuroner til billeddannelse undersøgelser. Desuden neuroner fra yngre dyr overlever længere i enten patch clamp optagelse eller billedbehandling. Anvendelse af museunger kan imidlertid være en stor begrænsning. Neuronal aktivitet og / eller reaktioner på neurotransmittere eller cirkulerende næringsstoffer ændrer sig med alderen. For eksempel, da energibalancen er tæt knyttet til reproduktiv status, kan hypothalamus neuroner regulerer energibalancen reagerer forskelligt i pre-vs postpubescent dyr. Derudover er der mange sygdomme kræver langvarig behandling eller ikke manifestere indtil voksenalderen. Prime eksempler på sådanne sygdomme er kosten fedme eller type 2 diabetes mellitus. Da glukose sensing neuroner menes at spille en rolle i disse sygdomme har vi udviklet en metode til en vellykket dyrkning af sunde voksne VMH neuroner til brug i MPD imaging experiments.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Dyr
- Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Medicine og Dentistry of New Jersey.
- Gruppen hus han C57BL / 6 mus på en 12 hr light/12 hr mørk tidsplan og tillade ad libitum adgang til vand og mad. Sacrifice på 4-5 måneder gammel. Aflivning af musene blev udført under anvendelse af kirurgisk plan af anæstesi og en sekundær form for eutanasi (dvs. trænge indsnit ind i brysthulen via membranen). Dette er i overensstemmelse med AVMA retningslinjer om eutanasi.
2. Udarbejdelse af perfusionsopløsningen, Dækglas, glaspipetter og Medier
- Gør 1L perfusion opløsning bestående af 2,5 mM KCI, 7 mM MgCl2, 1,25 mM NaH 2PO 4, 28 mM NaHCO3, 0,5 mM CaCl2, 7 mM glucose, 1 mM ascorbat og 3 mM pyruvat i destilleret dH 2 O. Juster osmolaritet til ~ 300 mOsm hjælp ca. 80 g / l saccharose. Oxygenate ved at boble med 95% O 2/5% CO 2 og pH justeres til 7,4. Hvert forsøg vil kræve ca 200 ml perfusionsopløsning. Alikvoter kan opbevares ved -20 ° C i op til 2 måneder.
- Gør 250 ml Neurobasal lager indeholdende Neurobasal medier uden glucose, 2,5 mM glucose og 100 U / ml penicillin streptomycin. Juster osmolaritet Neurobasal lager til 280 mOsm anvendelse af sucrose. Gør 500 ml dvale lager indeholdende dvale-A medier uden glucose, 2,5 mM glucose og 100 U / ml penicillin streptomycin.
- Rør begge bestande godt og filter-steriliseres ved hjælp Stericup vakuumfilter enheder. Vær forsigtig med ikke at indføre glucose eller andre forurenende stoffer gennem glasvarer eller røre barer. Wrap flasker i folien til at beskytte medier mod lys og opbevares ved 4 ° C i op til 2 måneder.
- Flamme tips af 4 autoklaveres glaspipetter (9 i), så de tips er ingen longer skarpe og åbningen diametre er stor (~ 0,9 mm), medium-large (~ 0,7 mm), medium (~ 0,5 mm) og små (~ 0,3 mm). Den største skal næppe poleret og den mindste bør være omkring en tredjedel af denne diameter.
- På dagen før høst neuroner, rene fire 25 mm dækglas under anvendelse af 70% ethanol og passerer over en bunsenbrænder flamme. Placer hver dækglas i en steril 35 mm dyrkningsskål og tilsæt 2 ml steril 1% poly-D-lysin i dH 2 O. Sæt retterne i en inkubator (37 ° C) natten over. Den næste dag vaskes med sterilt dH2O 3x og tillade dækglas at tørre helt.
- Gør 75 ul alikvoter af 1 M mælkesyre og 200 pi alikvoter af Glutamax, skal opbevares ved -20 ° C. Fuldt tø portioner af mælkesyre og Glutamax før brug for at sikre homogenitet.
- På dagen for høst neuroner, lave 30 ml frisk dyrkningsmedier bestående af Hibernate-En bestand, der indeholder 1 mM mælkesyre, 0,5 mM Glutamax og 2% B27 uden insulin. Vortex og justere pH til 7,4 ved anvendelse af 1 N NaOH.
- Sæt 10 ml kultur medier i en 60 mm glas petriskål på is, satte 2 ml i en 15 ml konisk rør på is og holde de resterende medier ved stuetemperatur.
- På dagen for høst neuroner, at 25 ml frisk vækstmedium bestående af Neurobasal lager indeholdende 1 mM mælkesyre, 0,5 mM Glutamax og 2% B27 uden insulin. Vortex og justere pH til 7,4 ved anvendelse af 1 N NaOH. Lad den friske vækstmedier at ækvilibrere i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i mindst 30 minutter.
3. Cardiac Perfusion
- Fuldt tø 200 ml perfusionsopløsning og oxygenat med 95% O2 / 5% CO 2 på is i mindst 15 minutter.
- Vask en vibratome klinge med acetone, 70% ethanol, og dH 2 O. Placer bladet i vibratome.
- Skyl vibratome køle kammeret og perfusionsslange med dH 2 O. Fyld kølekammeret (4 ° C) Med perfusionsopløsning og fortsætte med at ilte.
- Bedøver en mus med natriumpentobarbital 50 mg / ml, fortyndet 1:1 med sterilt vand, injiceret intraperitonealt. Kontroller, at musen er fuldt bedøvet ved at klemme halen og observere noget svar.
- Hæld kold perfusionsopløsning i perfusionen reservoir og slange lige før dissektion. Save 20-30 ml hjerne dissektion og fortsætte med at ilte på is. Gravity flow fra en forhøjet 60 ml sprøjte gennem slanger og en 20 G nål giver tilstrækkelig flow. Opløsningen løber indtil luftboblerne er vasket ud. Fortsæt med at ilte.
- Skær tilbage huden over brystkassen på musen. Løft brystkassen og omhyggeligt gøre et vandret snit gennem mellemgulvet. Lav to laterale snit gennem brystkassen op mod armene for at blotlægge hjertet. Brug en pincet til at holde tilbage brystkassen.
- Lav en lille 2 mm snit i højre atrium for at tilvejebringe en udgang for blod at blive vasket ud af VascuLAR system.
- Punktere venstre ventrikel med perfusionen nål, bare nok til at indsætte nålen åbning. At holde nålen på plads med den ene hånd og starte strømmen af perfusionsopløsningen med den anden hånd. Efter 10-15 ml perfusionsopløsning bør blodet vaskes ud, og spildevandet vil rydde.
4.. Brain udskæring og Dissection
- Efter hjerte-perfusion, overførsel iltet kold perfusionsopløsning til en petriskål på is lige før brug.
- Hurtigt halshugge, fjerne hjernen fra kraniet og placere hjernen til perfusionsopløsningen. For at fjerne hjerne: Træk hud frem, lave en midterlinjen snit i kraniet mod øjenhuler, gøre 2 laterale snit mod hvert øje, bruge pincet til at trække sig tilbage på hver side af kraniet, lave en koronale snit mellem øjenhuler, og bruge en spatel til forsigtigt lokke hjernen ud i perfusionsopløsning. Brug en saks til at klippe de optiske skrifter om nødvendigt. Må ikke at røre hypothalamic område og ikke trække de optiske skrifter, fordi det lægger for meget pres på median eminence og underliggende hypothalamus væv.
- Bruge et barberblad og nålen sideværts trimme hjernevæv cirka 3 mm posteriort og anterior hypothalamus, mens vævet er nedsænket (bregma -3,52 mm). Det er især vigtigt for det forreste side skåret til at være niveau, så hjernen vil sidde lige på vibratome borepatron.
- Fjern det resterende hjernevæv fra opløsningen og bruge filtrerpapir til at væge væk løsning fra den monterede hjerne sektionen.
- Placer en klat superlim på en vibratom borepatron og sprede limen til størrelsen af hjernen. Sæt hjernevævet på toppen af lim med den forreste side nedad og hypothalamus vender bladet. Wick væk overskydende lim og placere patronen ind i vibratome kølekammeret. Vær forsigtig ikke at efterlade meget lim da det vil boble op omkring hjernen, når den placeres i opløsning.
- Med vibratome sat til en langsom hastighed (niveau 2) og høj amplitude (niveau 9), gør 300-500 um skiver indtil den når hypothalamus område. Nu gør tynde 100 um skiver skære fra den bageste til den forreste. De visuelle signaler er som følger. Posterior til hypothalamus den tredje ventrikel vil være meget lille (bregma -2,70 til -2,30 mm). På bregma -2,30 mm, tredje ventrikel adskilt i dorsale og ventrale sektioner på koronale skive.
- Når dele af den tredje ventrikel sikringen, lave to 500 um skiver, som vil indeholde den korrekte region i VMH (bregma -2,18 til -1.22 mm). Anterior til VMH den tredje ventrikel ikke længere strækker sig til den ventrale gulvet i hjernen (bregma -1,06 til -0,82) 8..
- Overfør disse skiver til petriskålen på is indeholdende dyrkningsmedier. Dissekere VMH (VMN + ARC) som vist i figur 1. Brug en pipette til forsigtigt overføre VMH stykker i 2 ml dyrkningsmedier på is.
5.. Dissociation og Kultur
- Fjern VMH is og placere ved stuetemperatur. Tilsæt 20 U / ml papain til 4 ml af dyrkningsmediet. Invert at blande og sted i en 34 ° C vandbad. Kontroller og bland ved inversion hvert minut indtil fordøjelsen medier er ikke længere uklar. Filter (0,22 um) i en steril kolbe, og overføre vævet til fordøjelsen medier.
- Fordøje væv ved rystning ved 100 opm ved 34 ° C i 30 minutter.
- Forbered 1 ml medium indeholdende 8% bovint serumalbumin (BSA) under fordøjelsen. 80 mg BSA opløses i 1 ml dyrkningsmedier og filter (0,22 um) i en konisk rør.
- Vask vævet ved overførsel til 5 ml dyrkningsmedium i et konisk rør og langsomt vende gang.
- Tilsæt 30 ul DNase enzym til 6 ml dyrkningsmedier og bland til at gøre trituration medier. Aspirer vaske medier og tilsæt 3 ml trituration medier.
- Brug glaspipetter at udriv i størrelsesordenen largest til mindste. Forsigtigt udriv 10x og derefter vente 4 min til større stykker til at slå sig ned. Brug det andet pipette til at overføre de øverste 2 ml indeholdende en dissocieret cellesuspension til en ny konisk rør. Tilsættes 2 ml findeling medier, udriv 10x og vente 3 min. Brug tredje pipette til at overføre de øverste 2 ml til cellesuspensionen. Der tilsættes 1 ml trituration medier, triturat 5x og vente 2 min. Den fjerde pipette til at overføre den øverste 2 ml til cellesuspensionen.
- Lag den dissocierede cellesuspension oven på 8% BSA, er omhyggelig med ikke at blande. Centrifuger ved 1000 rpm i 5 min.
- Placer autoklaveret 6 mm x 8 mm kloning flasker i midten af hvert dækglas. Dækglas skal være helt tør. Aspirer og pellet resuspenderes i 440 pi varm vækstmedier. Fyld kloning cylindre med den neuronale suspension og plads i inkubatoren i 20 min.
- Fjern kloningscylindre og meget forsigtigt vaske væk snavs. Fyld hver skål with 2 ml vækstmedium. Tillad celler til at komme sig i mindst 1 time, før nogen analyser udføres.
6.. Forberedelse til MPD Imaging
- Gør optagelse opløsning bestående af 121 mM NaCl, 4,7 mM KCI, 2 mM CaCl2, 0,1 mM MgCl2, 1,2 mM MgSO4, 0,97 mM K 2 HPO 4, 0,23 mM KH 2PO 4, 5 mM NaHCO3 og 25 mM HEPES. PH justeres til 7,4.
- Tilføj glukose til at gøre den ønskede lave glukose testopløsning (0,1-2,0 mM glucose). Bland grundigt og reserve 400 ml lav glukose optagelse løsning. Tilføj glukose til de resterende 600 ml til at gøre 2,5 mM glucose optagelse løsning og bland grundigt.
- Beskyt farvestof fra lys så meget som muligt. Tilsæt 4 ml stuetemperatur Buffer til en Blue MPD hætteglas. Bland grundigt og tilsættes 5 ul farvestof per ml optagelse løsning. Hold opløsningen homogen ved blanding med pipetten mellem løsninger. Farvestoffet indeholder fluorescerende molecules, der trænger ind i celler med depolarisering og quencher molekyler kan som ikke krydser cellemembranen. Alikvoter kan opbevares ved -20 ° C og anvendt inden for 4 dage. Må ikke fryses-tø mere end én gang.
- Cellerne inkuberes i 2 ml 2,5 mM glucose optagelse løsning plus farvestof ved 34 ° C i 30 min. En tør varmeblok kan anvendes. Beskyttes mod lys.
- Forbered sprøjtepumper og perfusion med 2,5 mM og 0,1 mM optagelsesløsninger plus farvestof. Tubing fra 60 ml sprøjter skal være tilsluttet en manifold.
- Efter at stoppe enhver pumpe, vent ~ 10 sek før du skifter løsninger på manifolden for at forhindre tryk oprustning i sprøjten. Trykændringer ændre væske levering til den lukkede kammer, der indeholder neuroner, der forårsager ændringer i mikroskop fokus under forsøget og fordrejning af billeder.
- Manifolden output slangen skal tilsluttes en in-line varmelegeme og derefter polyethylen rør, der forbinder til et lukket kammer. Bobler skal ryddes og perfusionshastigheden skal indstilles til 0,5 ml / min. Beskyttes mod lys.
- Overfør 25 mm dækglas med vedhængende neuroner til den lukkede kammer, være omhyggelig med ikke at tillade dækglas til at tørre og ikke at indføre luftbobler. Slippet er justeret i rillerne på det nederste stykke er et par dråber af optagelse løsning placeret langs siderne, og det øverste stykke forsigtigt monteret til at holde dækglasset på plads.
- Brug en pipette til at fylde kammeret med optagelse løsning og derefter placere en 18 mm dækglas på toppen. Forsigtigt passe hvid ring ind i kammeret for at holde mindre dækglasset på plads. Tryk ned meget langsomt og let at forhindre luftbobler i at blive indført i den lukkede kammer.
- Start sprøjten pumpe til 2,5 mM glucose optagelse løsning, skal du trykke ned på den hvide ring, og oprette forbindelse til det lukkede kammer. Langsomt frigive pres fra hvid ring og oprette forbindelse til slanger, der fører til en affaldsbeholder.
- Centrer neuronerne ved hjælp af lav lyse felt lys. Forsøge at minimere den tid, cellerne bliver udsat for lys.
- Lad perfusion system til at køre i 10 minutter for at muliggøre stabilisering af temperatur, fokus og farvestof ligevægt.
- Mens priming åbne MetaMorph programmet og tager et lyst felt billede (10X) af neuroner. Brug autofokus funktionen til at tage 3 stakke af fluorescerende billeder (150 msek, smalle Cy3 filter, 10x) og bestemme fokus inden for 5 um. Ved afslutningen af 10 min priming periode kontrollere fokus en gang mere.
- Begynd at optage fluorescerende billeder hver 30 sek 40 min. Etablere en baseline på 2,5 mM glucose i 10 min, derefter falde glukose til 15 minutter, og til sidst tilbage til 2,5 mM glucose i 15 min. Løsninger ændres ved at stoppe en sprøjtepumpe, venter 10 sek, vender en port på manifolden, og starte en anden sprøjtepumpe. Ændringer bør forekomme forud for ønskede tidspunkter based på den forsinkelse mellem manifolden og celler.
- Efter optagelsen alle fluorescerende billeder, tage et lyst felt billede af neuroner.
8.. MPD Imaging Analyse
- Brug MetaMorph til at oprette ovale regioner rundt hver celle i det lyse felt billede taget ved afslutningen af forsøget. Regionerne bør være en smule større end hver neuron og kan gøres 1 pixel uden for cellen mørke kant. Må ikke vælge celler, der er usundt, overlappende, eller tæt på snavs. Usunde celler forekommer ofte mørke. Endelig skabe 5 store ovale regioner på områder uden celler eller vragrester for baggrunden målinger.
- Overfør regionerne til alle fluorescerende billeder og inspicere at kontrollere, at ingen bevægelse / skift har fundet sted. Brug Measure funktion for at registrere fluorescens intensiteten af hver region for alle billeder i en Excel-fil. Brugen af Journals i Metamorph tilrådes.
- I Excel, oprette et gennemsnit af de 5 baggrunden regioner for hver fluorescerent billede. Dette repræsenterer den gennemsnitlige baggrundsværdi for hvert tidspunkt. For hvert billede / tidspunkt, trække baggrunden fra alle regionens målinger. Den baggrundssubtraktion fluorescens intensitet vil blive henvist til som Intensitet herefter.
- For hver celle, beregne den gennemsnitlige intensitet under minutter 2-8 af optagelsen. Dette repræsenterer Baseline af cellen i 2,5 mM glucose. En 2 minutters buffer på begge ender af hver behandling bruges til at minimere støj.
- For hver celle, beregne den procentvise ændring fra baseline: (Intensitet-Baseline) / Baseline
- Opret en linje graf med den procentvise ændring fra baseline vs tid.
- Beregn den gennemsnitlige procentvise ændring fra baseline i løbet af få minutter 18-23. Beregn den gennemsnitlige procentvise ændring fra baseline i løbet af få minutter 35-40. Mens billedbehandlingen ikke er brugt, bliver støjen reduceres gennem gennemsnitsberegning af intensitet i hver celle region, baggrund subtraktion og gennemsnitsberegning af region intensitet over 5 min or længere.
- Kontrol forsøg, hvor 2,5 mM glucose optagelse løsning udveksles med 2,5 mM glucose optagelse løsning skal udføres for at afgøre støjtærsklen. Beregn den gennemsnitlige procentvise ændring fra baseline i løbet af få minutter 18-23 i mindst 6 retter og 3 mus. Bestem middelværdi og standardafvigelse af disse værdier.
- Indstil tærsklen for en positiv depolarisering svar til middelværdien plus 2 standardafvigelser. Gennemsnittet plus 2 standardafvigelser svarer til en forskel med p <0,05. Vores kontrol eksperimenter afslørede en 10% ændring fra baseline som passende tærskelværdi.
- For hver celle, vurderer reversible depolarisering respons baseret på 2 kriterier. For det første skal den gennemsnitlige procentvise ændring fra baseline i løbet af få minutter 18-23 være større end 10%, den tærskel, i det foregående trin. For det andet skal den gennemsnitlige procentvise ændring fra baseline i løbet af få minutter 35-40 være mindre end halvdelen af den gennemsnitlige procentvise ændring frabaseline i løbet af få minutter 18-23. Det andet kriterium blev valgt, da det viste sig at være mere stringent end stimulation med glutamat eller KCI. Usunde neuroner ofte reagere på stimulation med glutamat eller KCl, selvom deres svar på nedsat glukose ikke er reversibel.
- For hver skål beregne% af depolariserede neuroner. Denne værdi bruges til at kvantificere% af GI neuroner mellem forskellige behandlingsgrupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den præcise dissektion af VMH væk fra andre hypothalamus områder er vigtigt at opnå ensartede resultater. Inddragelse af andre områder kunne udvande VMH neuronal befolkning, ændre% af depolariserede neuroner beregnes. Endvidere har glucose sensing neuroner blevet identificeret i andre hypothalamus regioner, såsom den laterale hypothalamus, som kan variere, funktionelt og mekanisk fra VMH glucose sensing neuroner. Figur 1 illustrerer de korrekte anatomiske steder for korrekt dissektion. Efter ovenstående protokollen, kan hjernevæv, der indeholder den korrekte VMH region adskilles. Yderligere dissektion til præcist at adskille VMN og ARC, samtidig med at helheden af hver delpopulation, må ikke være mulig. Figur 2 viser et eksempel på sund dissocieret VMH neuroner. Ved hjælp af immunocytokemi bekræftede vi, at vores forberedelse er> 90% neuronal. Kun raske neuroner bør anvendes til data analysersis og retter med alt for mange usunde neuroner skal kasseres. Neuroner, der er usunde ofte har meget mørke kanter, tage op MPD i højere grad, og har uregelmæssige former. Derudover bør neuroner udplades med en sådan tæthed, at de fleste neuroner ikke rører hinanden under optagelsen. Neuroner valgt til analyse, bør ikke røre andre celler eller vragrester.
Data fra optagelser af GI neuron og en nonGI neuron er vist i figur 3.. Efter opnåelse af en baseline i 10 min blev den ekstracellulære glukose faldt fra 2,5 til 0,1 mM. GI neuron viser en robust reversibel reaktion større end den forudbestemte tærskelværdi på 10% ændring fra baseline. Stigningen i fluorescens afspejler depolarisering. Mens GE neuron hyperpolarisering svar også registreres, frekvensen er for lav (<1% neuroner) for vellykket brug af denne teknik på denne undertype af glukose sensing neuron. En række fysiologiske glucose fald blev testet, og den procentdel af VMH neuroner, som reversibelt depolariseret blev beregnet for hver skål. Figur 4 viser, at der eksisterer en positiv sammenhæng mellem størrelsen af den glukosesænkning og procentdelen af depolariserende neuroner. Dette viser, at vellykket primær kultur af voksne murine neuroner kan anvendes i forbindelse med fluorescensimagografi at tillade undersøgelse af voksne VMH GI neuroner.
Figur 1. Coronal sektion med markører for korrekt VMH dissektion. Det dissekerede væv indeholder VMN og ARC, med minimal kontaminering fra andre hypothalamus områder. Diagonale snit skal foretages fra ~ 25-30% under toppen af den tredje ventrikel til ~ 25-30% mellem det punkt, hvor cortex opfylder hypothalamus område (blå *), og den tredje ventrikel(3V). Tilpasset fra bregma -2.8 mm Paxinos og Watson 1998 9. svarende til Mouse Brain bregma-1.7mm. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Lysfelt billede af sunde VMH neuroner fra en voksen mus. Dette billede blev taget 24 timer efter dissociation og har været anvendt til MPD billeddannelse. Et par eksempler på neuroner, der ville (blå *) eller ikke ville (rød x) anvendes til analyse er markeret. Klik her for at se større billede .
Figur 3.. Repræsentative MPD fluorescens spor af en GI neuron (grøn linie) og en nonGI neuron (orange linie). Cellerne blev gennemskyllet med 2,5 mM glucose (G) optagelse løsning i 10 min, efterfulgt af et fald til 0,1 mM G i 15 minutter og en tilbage til 2,5 mM G i 15 min. I GI neuron, den procentvise ændring fra baseline steget til over 10% i løbet af 0,1 mM G perfusion periode (40% gennemsnit fra 20-25 min) og faldt til mindre end halvdelen af denne stigning i 2,5 mM G vending periode (15 % i gennemsnit 35-40 min). Klik her for at se større billede .
Figur 4.. Den procentdel af voksne VMH neuroner, som reversibelt depolarisere reaktion på nedsat glukose detekteres med fluorescerende MPD billeddannelse. Apositivt forhold mellem størrelsen af glukosesænkning og den procentdel af depolariserende neuroner. Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nøglen til at være i stand til at studere aktiviteten af neuroner fra voksne mus er evnen til at adskille sunde neuroner. Dissociation af hypothalamus neuroner fra voksne mus er sværere på flere vigtige skridt i den protokol, i forhold til neuroner fra unge mus. Vi har overvundet dette problem på en række måder. Gør tykke 500 um hjerneskiver minimerer mekaniske skader på neuroner i forhold til de sædvanlige 250-350 um skiver anvendes til hjernevæv fra yngre mus. Men tykkere skiver kræver større opmærksomhed på hjerte-perfusion og papainspaltning af hjernevæv. Hvis blod er set på hjernevæv, vurdere præcision og placering af snit i højre forkammer og nålen placeres i venstre ventrikel. Strømningshastigheden og mængde perfusionsopløsning kan også justeres. En grundig perfusion er bydende nødvendigt, da blod er toksisk for neuroner og vil resultere i et lavere udbytte af raske neuroner. Papainfordøjelse skal være effektiv nok til at tilladetil skånsom findeling og let frigivelse af enkelte celler fra hjernevæv. Et ineffektivt papainfordøjelse er mistanke når VMH væv synker hurtigt i slutningen af fordøjelsen og når større vævsstykker er til stede under den anden triturering. Med god fordøjelse vævsstykker næppe påvises med det blotte øje i tredje triturering. Hvis triturering ikke blid, vil neuronal sundhed lide. Hvis der er mistanke om en ineffektiv papainfordøjelse, kan koncentrationen af papain øges med 5 U / ml eller kan bruges et nyt hætteglas af papain. Imidlertid bør papain koncentration ikke øges over 30 U / ml, da dette kan forringe neuronal sundhed.
Eksponeringen for BSA er endnu et vigtigt skridt i protokollen. Efter tritureret celler er blevet centrifugeret på BSA gradient, både mængden af tid neuroner er udsat for BSA og mængden af BSA lov til at forblive med pillen bør minimeres. Supernatanten og BSA gradientbør aspireres umiddelbart efter centrifugering periode. Vakuumsug kan anvendes til at fjerne størstedelen af supernatanten, men den sidste ~ 100 pi skal fjernes manuelt med en pipette, således at cellepelleten ikke forstyrres. Et andet vigtigt aspekt af at opnå raske neuroner er at optimere celledensitet. Neuroner belagte for tyndt er ikke så sundt. Da så få neuroner opnås fra hver mus hjernen, er det ikke praktisk at tælle celler, før udpladning. I den tid, der ville blive brugt optælling, vil et betydeligt antal celler klæbe til plasten og ville blive tabt. Brug 4 retter pr mus (~ 1 x 10 4 celler / ml) som udgangspunkt, empirisk bestemmelse af antallet af retter er den mest praktiske tilgang til at opnå optimal neuron tæthed. Udbyttet af VMH neuroner fra ældre mus kan forventes at være omkring halvdelen af udbyttet fra unge mus. Yderligere fejlfinding for at forbedre neuron udbytte indebærer kvantificering af neuroner resterendepå hvert trin af dissociation protokollen til at lokalisere trin af tung neuronal nedslidning.
Ved hjælp af vores protokol, kan sunde dissocierede neuroner overleve i kultur op til 2-3 dage. , Brug af filtreret astrocyt-condition vækstmedier tillader imidlertid neuroner til at overleve op til 2 uger i kultur. Vækst medier kan være betinget af inkubation på sammenflydende primære astrocytter natten over. Astrocytter fra samme gnaver stamme, køn og hjerne region bør udnyttes. Mens brugen af astrocyt-konditionerede medier introducerer en anden variabel, kan denne modifikation er nødvendig for alternative eksperimenter kræver mere tid i kultur. Endvidere, af grunde, som ikke er klar, har vi fundet, at evnen til at fornemme glukose let tabt med suboptimal neuronal sundhed trods opretholdelse af reaktioner på andre stimuli, såsom glutamat. Derfor skal ekstra pleje skal træffes. At observere neuronale reaktioner på nedsat glukose, er det bydende nødvendigt at undgå contaminatiden af bakterier, mug, salte, sæbe og glukose. Alle glasvarer og ikke-sterile plast skal vaskes grundigt med dH 2 O. Udover levende forureninger, vil rengøringsmidler og salte påvirker neuronal integritet og aktivitet. Små mængder af glukose i væsentlig grad kan ændre glucosekoncentrationer. Dette ville forstyrre resultater, da glucose sensing neuroner er meget følsomme over for små ændringer i ekstracellulær glucose i nonhyperglycemic fysiologiske område på 0,1 til 2,5 mM 10,11.
Når du bruger MPD billedbehandling, konsistens og side-by-side eksperimentering mellem behandlingsgrupper er afgørende for meningsfulde resultater. Forskellige behandlingsgrupper bør afprøves på samme dag, hvis muligt, eller i det mindste på skiftende dage. Dette minimerer mulige variationer i præparater kultur eller MPD portioner. Derudover fandt vi mindst variation opstår, når billeddannelse er udført indenfor 24 timer af neuron dissociation grunde nævnt ovenfor. Da resultaterneanalyseres som en% af depolariserende neuroner, præcision og konsekvens i VMH dissektion og neuronal forberedelse er også vigtigt. Den samlede VMH neuronal population udvundet skal være konstant og må ikke indeholde neuroner fra andre regioner. Således bør ovennævnte protokol følges nøje og præcist. Men hvis alternative forsøg skal udføres og befolkning vedligeholdelse er ikke en bekymring, væv slag kan gøres for at isolere VMN eller ARC neuroner.
De her beskrevne metoder fastlægge, hvordan at høste sunde VMH neuroner fra en voksen mus og hvordan du bruger MPD billedbehandling til at studere glucose sensing neuroner. I stedet kunne man udvikle undersøge VMH neuronale reaktioner på stimuli andre end glucose ændringer. Alternativt kan dissociation protokol ekstrapoleres til høst neuroner fra andre hjerneregioner. Brug neuroner fra voksne mus, kan undersøgelser nu udføres ved hjælp af murine sygdomsmodeller, der udvikler eller fremskridt med alderen. Moreover, kan raske voksne neuroner undersøges yderligere ved hjælp af andre end MPD billeddannelse teknikker såsom calcium billedbehandling, elektrofysiologi, encellede PCR, immunocytokemi eller en kombination af disse teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI | used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
References
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant? Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
- Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
- Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
- Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
- Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
- Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 4th edn, Academic Press. (1998).
- Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
- Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).
