Cultura de Tecidos isolada Piso Placa e Produção de meio condicionado Para avaliar as propriedades funcionais dos pavimentos Sinais lançado placa

Summary

A placa do piso é uma estrutura fundamental das desenvolvimento da medula espinhal, que fornecem sinais difusíveis para progenitores e diferenciação de neurônios. Nós descrevemos um método para produzir laje meio condicionado, para aplicá-lo ao novo tecido da medula espinhal, e para avaliar as consequências sobre as proteínas de interesse pela bioquímica.

Abstract

Durante o desenvolvimento, progenitores e os neurônios pós-mitóticas receber sinais de territórios adjacentes que regulam o seu destino. A laje é um grupo de células gliais que revestem o canal ependimária na posição ventral. A laje expressa morfogénios fundamentais que contribuem para o padrão de linhagens de células da medula espinhal. Em fases posteriores de desenvolvimento, a laje regula a navegação dos axônios na medula espinhal, agindo como uma barreira para impedir a passagem dos axônios ipsi e cruzamento da linha média de controle por axônios comissurais ^1. Estas funções são conseguidas através da secreção de várias pistas de orientação. Algumas dessas sugestões funcionar como atrativos e repelentes para os axônios em crescimento, enquanto outros regular receptores de orientação e sinalização a jusante para modular a sensibilidade dos axônios para as pistas de orientação locais ^2,3. Aqui, descrevemos um método que permite estudar o comportamento de andar de placa sinais derivados de uma variedade de desencontextos lopmental, com base na produção de médio laje condicionado (FP ^{cm) 4-6.} Em seguida, exemplificam o uso deste FP ^cm no contexto da orientação do axónio. Em primeiro lugar, a espinal medula é isolado de embrião de ratinho em E12.5 e a laje é dissecados e cultivados numa matriz de plasma de trombina (Figura 1). Segundo, dois dias depois, tecidos comissural são dissecados a partir de embriões E12.5, triturado e exposto para o ^cm FP. Em terceiro lugar, o tecido são processadas para análise de Western blot de marcadores comissurais.

Introduction

A laje é um centro de padronização bem conhecido da medula espinhal em desenvolvimento, desempenhando papéis importantes na especificação de progenitores e linhagens de células pós-mitóticas e controlar a navegação axônio ^7,8. O procedimento experimental descrito aqui para produzir FP ^cm permite aos investigadores para avaliar as propriedades funcionais dos sinais provenientes de placas de piso em um de vários contextos de processos de desenvolvimento, a partir de padrões de células e a sobrevivência das células e a migração do axónio.

Para ilustrar o uso de tais ^cm FP, os tecidos da medula espinal dorsal contendo neurónios comissurais são dissecados, dilacerada e estimuladas com o ^cm FP. Os tecidos podem então ser processadas para análise de Western blot. Isto permite investigar os regulamentos da máquina orientação do axônio por sinais liberados laje. O método de tratamento de tecido fresco dilacerada mantém a grande vantagem de preservar o microambiente das células dentro the tecidos. Assim, as conseqüências do tratamento por FP ^cm ou quaisquer tipos de tratamento são avaliados de forma mais fisiológica do que em condições de cultura de tecido celular e.

Protocol

DIA 1

1. Dissecção da medula espinhal Piso Plate (FP) de E12.5 embriões de camundongos

Nota: O procedimento completo requer o uso de condições de esterilidade. É preferível realizar o esvaziamento sob uma capa de dissecação para evitar a contaminação. A superfície da capa deverá ser limpa com etanol. Todos os instrumentos de dissecção devem ser esterilizados e mantidos em uma placa de Petri estéril. Os líquidos (médio, médio dissecção) devem ser mantidas fechadas e colocar num banho de gelo. Cada embrião deve ser coletado em fresco gota individual. Isto é importante para a conservação de tecidos. A dissecção é realizada com Dumont # 5 fórceps. Para transferir os embriões entre pratos, pega o cordão umbilical ou a cabeça sem qualquer prejuízo para a parte posterior do cérebro. É fundamental para não danificar a medula espinhal para concluir com êxito a dissecção. Prepare frio tampão fosfato (PBS), Solução Salina Balanceada frio de Hank (HBSS) -6,5% de glicose e temperatura ambiente média neurobasal.

1.1 Spinal dissecção cabo

Os animais são tratados de acordo com as diretrizes de cuidados de animais do Centre National de la Recherche Scientifique seguintes directivas europeias. O método da eutanásia é deslocamento cervical, que consiste em aplicar pressão para o pescoço e deslocando a coluna vertebral a partir do cérebro. Este método é recomendado para modelos animais de rato, e pode ser realizado de uma forma rápida e eficiente.

1. Euthanize um rato grávida E12.5 de gestação (E0.5 = primeiro dia seguinte esteiras). Posicione o mouse lado ventral para cima.
2. Mergulhe o abdômen com etanol 70%. Aperte a pele do abdômen com uma pinça Adson e cortar através da pele e as camadas peritoneal com uma tesoura cirúrgica. Faça uma incisão e usá-lo para cortar em ambos os lados do mouse para expor a cavidade abdominal.
3. Uma cadeia de embriões está presente em cada um dos lados do rato. Segure um chifre do uterus no tecido entre dois embriões e dissecá-lo para fora a partir da parte exterior. Transferir o útero intacto para uma placa de 100 mm de Petri com PBS frio em gelo.
4. Extrair os embriões a partir de tecidos extra-embrionários. Segure o tecido da placenta (em vermelho escuro) com dois pares de fórceps e puxar suavemente para rasgar o tecido e remover os embriões a partir do saco uterino.

Nota: Para uma melhor conservação, coletar os embriões de sua saída do útero, um por um.

5. Os próximos passos são feitos sob lupa binocular e capuz dissecação. Coloque um embrião em uma queda de glicose frio HBSS-6,5%.
6. Utilizando uma pinça, decapitar o embrião.

Nota: Corte entre a mandíbula inferior ea parte posterior do cérebro, a parte posterior do cérebro posterior é importante para os próximos passos.

7. Coloque a face ventral do embrião para baixo com a parte anterior de frente para o experimentador.
8. Aperte a peledo embrião com um par de pinças e com o outro par de se afastar da pele.

Nota: Este passo tem de ser repetido até que a pele é removida completamente a partir da parte anterior do embrião.

9. Vire o lado anterior do embrião para a esquerda. Com uma pinça de "fechar" o embrião na parte anterior. Com os outros pinça agarre a pele e puxar para o lado rostral do embrião. A medula espinhal é então acessível.
10. Usar um lado da pinça para cortar as meninges que ainda envolver a espinal medula. A medula espinhal está agora aberto.
11. Vire o lado anterior do embrião para a direita.
12. Separe o tecido da medula espinal a partir do lado do colo do útero do embrião. Deslize os fórceps sob a medula espinhal (a pinça deve ser mantido fechado para evitar danos da medula espinhal). A pinça tem de ser visível sob a medula espinhal. Pequenos movimentos rotatórios sob a medula espinhal são suficientes para retirar atecido circundante e os gânglios da raiz dorsal (DRG).

Nota: Partindo tecido circundante ligada adicionar peso à medula espinhal, aumentando assim a probabilidade de quebra-lo durante o passo seguinte.

13. Coloque o isolado medula espinhal em uma nova queda de glicose frio HBSS-6,5%.
14. Coloque a medula espinal na posição plana, as meninges, no lado de topo anterior e longe do experimentador.
15. "Imobilizar" a medula espinhal usando o hindbrain restante com uma pinça, e com o segundo fórceps agarrar as meninges. Retire as meninges a partir do lado rostral da medula espinhal.

Nota: O movimento deve ser lento e constante, para evitar qualquer ruptura da medula espinhal. Movimentos vibratórios pode facilitar a separação das meninges.

1.2 FP dissecção

1. Aperte a parte posterior do cérebro com um fórceps.
2. A FP é o tra centronsparent parte do tecido. Usando um bisturi cortar a placa de fundo.

Nota: Para cortar ambos os lados com a mesma qualidade, que começa no lado rostral e alternadamente cortar o lado direito e do lado esquerdo da placa de fundo.

3. Conserve o FP dissecado em meio Neurobasal à temperatura ambiente.

2. FP Cultura

Nota: Todos os passos devem ser realizados sob condições estéreis, com um capuz de cultura de tecidos. Use meio fresco e suplementos e reagentes recém descongeladas. Prepare lamínulas estéreis de vidro, neurobasal quente + B27, plasma e HBSS-trombina.

2.1 cultura FP

1. Coloque várias lamelas estéreis numa placa de Petri e 100 milímetros de pipeta 20 ul de plasma no centro de cada lamela.
2. Transferir 2-4 FP em cada gota de plasma e adiciona-se 20 ul de HBSS-trombina ao lado da gota de plasma e misturar cuidadosamente. Mantenha as lamelaspor um período mínimo de 10 minutos à temperatura ambiente para permitir a coagulação do plasma.

Nota: Transferência dois PQ em caso de dissecção completa e mais em caso de dissecção parcial. Misture devagar, com uma ponta de pipeta e evitar o contato com os explantes PF.

O coágulo de plasma retrai alguns mM como um sinal da coagulação. A coagulação não deve ser interrompida prematuramente, para evitar a separação do coágulo do plasma.

3. Transferir cada lamela em uma placa de 24 cavidades e adicionar 500 mL de Neurobasal + B27. Incubar 48 horas a 37 ° C.

DIA 3

3. FP condicionado Médio (FP ^cm) Colher

Nota: de colheita deve ser realizada sob condições estéreis, com um capuz de cultura de tecidos. Se o sobrenadante está contaminado ou se as placas de piso são flutuante (o que significa que poderia ter morrido durante os peri culturaod), então não colher o ^cm FP deste poço.

3.1 FP ^cm colheita

1. Colha cuidadosamente o meio de cada poço.

Nota: Não pipetar a mistura de plasma de trombina polimerizado ou quaisquer fragmentos PF.

2. Armazenar aliquotas de 100 uL a -80 ° C.

DIA 4

4. Dissecção da Medula Espinhal comissural Neurônios de E12.5 embriões de camundongos

Nota: A preparação não tem necessariamente de ser realizada sob condições estéreis. Siga o procedimento descrito acima para coletar os embriões. Prepare PBS frio, frio HBSS-6.5% de glicose e neurobasal frio.

4.1 Spinal dissecção cabo

1. Utilizando uma pinça, decapitar o embrião.

Nota: Corte entre o maxilar inferior e da parte posterior do cérebro, a parte posterior da parte posterior do cérebro é importante para opróximos passos.

2. Coloque a face ventral do embrião para baixo em uma nova queda com a parte anterior de frente para o experimentador.
3. Comprima a pele do embrião com um fórceps e com o outro se afastar da pele.

Nota: Este passo tem de ser repetido até que a pele é removida completamente a partir da parte anterior do embrião.

4. Vire o lado anterior do embrião para a esquerda. Com uma pinça de "fechar" o embrião na parte anterior. Com as outras pinças, segure a pele e puxar para o lado rostral do embrião, para expor a medula espinhal.
5. Usar um lado da pinça para cortar as meninges que ainda envolver a espinal medula. A medula espinhal está agora exposta e aberta.
6. Posicione embrião lado do anterior para a direita.
7. Separe o tecido da medula espinal a partir do lado do colo do útero do embrião. Deslize os fórceps sob a medula espinhal (mantenha a pinça fechada). Paraceps deve visível sob a medula espinhal. Pequenos movimentos rotatórios sob a medula espinhal são suficientes para separar o tecido adjacente e os gânglios da raiz dorsal (DRG).
8. Transfira o isolado medula espinhal em uma nova queda de glicose frio HBSS-6,5%.
9. Coloque a medula espinal na posição plana, as meninges, no lado de topo anterior e longe do experimentador.
10. "Imobilizar" a medula espinhal usando o hindbrain restante com um fórceps, com o segundo fórceps agarrar as meninges. Retire as meninges a partir do lado rostral da medula espinhal.

4.2 comissural Neuron dissecção

1. Aperte a parte posterior do cérebro com um fórceps.
2. Os neurônios comissurais estão localizadas na parte mais lateral da espinal-medula (lado dorsal). Recorte esta parte lateral com uma multa bisturi.

Nota: A parte dorsal da espinal-medula pode ser distinguida da parte ventral pela diferença de célula density, a parte ventral sendo mais opaca.

Nota: Para cortar os dois lados com a mesma qualidade, que começa no lado rostral e alternadamente cortar um pequeno comprimento do lado direito e do lado esquerdo.

3. Conserve o tecido dissecado em meio Neurobasal no gelo para uso imediato.

5. O tratamento do tecido com o comissural ^cm FP

Nota: Este procedimento não requer condições estéreis. O tecido deve ser coletado em tubos de 1,5 ml cada. A FP ^cm congelado deve ser usado apenas uma vez. Evite recongelamento múltipla. Prepare quente FP ^cm (37 ° C).

5.1 Tratamentos de neurônios comissurais

1. Dilacerar o tecido comissural com pequenas tesouras.

Nota: Cortar o tecido tão pequeno quanto possível, para potenciar a acessibilidade das células.

2. Distribuir de forma justa o tecido entre a diferença de tratamento experimental e controle condições ^cm tratamento FP.
3. Centrifugar os fragmentos de tecido a 800 xg durante 1 min a 4 ° C.
4. Confira a repartição entre os tubos.

Nota: Se necessário redistribuir e centrifugar novamente até que os fragmentos são igualmente distribuídos.

5. Remover o sobrenadante.
6. Adicionar os ^centímetros e tratamentos de controlo de PF quentes para os tecidos.

Nota: O volume tem de ser ajustada à quantidade de sedimento e deve ser pelo menos duas vezes o volume do pelete.

7. Incubar a 37 ° C durante 30 min.

Nota: Agite cada 10-15 min

8. Centrifugar a 800 xg durante 1 min e remover o tratamento.
9. Adicionar o tampão de lise

Nota: O volume deve ser ajustado à umamontagem da pastilha, e deverá ser, pelo menos, duas vezes o volume do pelete.

10. Pipeta cima e para baixo para voltar a suspender o sedimento.

Nota: Um vórtice também pode ser usado.

11. Incubar 15 minutos em gelo.
12. Centrifugar a 14000 xg durante 15 min a 4 ° C.
13. Manter o sobrenadante e medir a quantidade de proteína com um ensaio de Bradford ^9.
14. Adicionar 6x Laemmli Buffer.
15. Incubar a 95 ° C durante 5 minutos para desnaturar a proteína.

Nota: As amostras podem ser utilizadas imediatamente ou podem ser armazenadas a -80 ° C.

16. Avaliar os efeitos do tratamento por ¹⁰ Western Blot.

Nota: Pelo menos 50 mg de proteínas totais deve ser carregado para cada pista.

Representative Results

Comissurais tecidos foram tratados pelo ^cm PF e as amostras foram processadas para análise de níveis de receptores em Western blot. Aplicação das ^cm FP foi demonstrado que o aumento dos níveis de um receptor de orientação, PlexinA1, que medeia a sensibilidade de axónios comissurais para o repelente Semaphorin3B linha média depois de atravessar (Figura 2). Isto revelou que os sinais liberados pelo FP regular os níveis de PlexinA1 ^4,6.

Figura 1. Esquemas de o procedimento de dissecção para isolar a placa de fundo. As diferentes etapas da dissecção eo procedimento de cultura são ilustrados. 1) cortar a cabeça do embrião; 2-3) retire a pele, 4) abrir as meninges; 5-6) remover a medula espinhal do embrião; 7) remover os homensingestão; 8-9) dissecar a placa de fundo, 10) adicionar a trombina à mistura FP-plasma e esperar 10 a 15 minutos à temperatura ambiente antes da adição do meio de cultura. 11-12) dissecar os neurônios dorsais; 13) dilacera o tecido. A: câmara anterior do embrião. P: pólo posterior do embrião. As setas indicam a direcção do movimento. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. Resultado representativo. A) tecido espinhal dorsal foram coletadas, dilacerada e estimulados com a placa de assoalho condicionado médio e médio controle. As amostras foram lisadas e processadas para a Western blot. As proteínas foram sondadas com anticorpos anti-PlexinA1, e β-actina. O pHoto ilustra o aumento dos níveis de PlexinA1 na amostra estimulada com a laje meio condicionado. B) A mancha de pontos mostra a expressão de GDNF em FP ^centímetros em relação ao que médium controle.

Discussion

A produção de laje meio condicionado oferece uma maneira fácil e eficiente para avaliar as propriedades biológicas dos sinais liberados placa de fundo.

A matriz de plasma de trombina oferece excelentes condições para a sobrevivência dos tecidos. No entanto, este ambiente enriquecido pode ser uma limitação para alguns tipos de experiências. Assim, o tecido de placa de fundo pode também ser cultivadas em matriz de agarose. A qualidade do meio condicionado placa de piso pode ser avaliada através da detecção de sinais libertados andar de placa conhecidos, tais como o GDNF (Figura 2), a Shh e Netrin ^11. A sua presença no meio condicionado pode ser avaliada por Western blot ou dot blot.

Neste método, as células são estudadas no seu microambiente nativo. Isto evita ainda informações sobre o tipo de células no tecido que reagem ao tratamento. Como a placa de piso não é uma estrutura homogénea, a concentração de atoive componentes tais como Wnts pode ser diferente entre as culturas, dependendo da área dissecados ao longo do eixo rostro-caudal.

Bioquímica em tecido dilacerado fresco tem a vantagem de estudar as células em seu microambiente nativa. Assim, os comportamentos de células são investigados em condições que recapitulam tão perto quanto possível do seu contexto nativo ^12. O dorsal da medula espinhal não contém apenas os neurônios comissurais assim os efeitos da FP ^cm também pode ser avaliada em neurônios comissurais cultivadas.

O meio pode ser aplicado a diversos tipos de culturas de células e de tecidos. Uma grande gama de parâmetros, pode ser apreciado, a partir da identidade das células, a sobrevivência das células, a morte das células, e diferenciação celular. As amostras podem ser processadas para proteômica.

Um parâmetro importante na preparação do tecido fresco dilacerada é a repartição do tecido para o controlo e os tratamentos experimentais. É importaçãoformiga para recolher os tecidos primeiro num tubo e dilacerar o tecido conjuntamente antes de separar as amostras. Isto limita a diferença de concentração de proteína detectada após lise entre amostras.

Note-se que HBSS-glicose pode ser armazenado a 4 ° C, durante até um mês. Neurobasal também pode ser mantido por um mês a 4 ° C. Alíquotas B27 pode ser armazenada a -20 ° C durante a longo prazo e a 4 ° C durante até uma semana. Alíquotas de plasma deve ser armazenar a -20 ° C e pode ser congelada novamente após o uso. Alíquotas de trombina podem também ser armazenados a -20 ° C e não pode ser novamente congelado.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents Required
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+- free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1 mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10 mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50x
HEPES (260 g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0.5 M, pH 8
MgCl2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
Distilled H2O
Table 1.Reagents required.
Tools and Materials
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
Microknives	Fine Science Tools	10136-14
Table 2. Tools and materials.
Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18 mm x 18 mm Bunsen gas burner 24-well plate tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge Recipes FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS-thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10 mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH 7,4 HEPES (260 g/mol) 25 mM EDTA (pH 8) 5 mM MgCl2 1 mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1x Sodium Orthovanadate 0.2 M H2O Laemmli Buffer Tris 0.5 M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0.6 M Bromophenol blue H2O