Kultur Isoleret gulvplade Tissue og produktion af medium til Vurdere funktionelle egenskaber af bundpladen udgivet Signaler

Summary

Bundpladen er en afgørende struktur i udviklingslandene rygmarven, giver diffusible signaler til stamfædre og differentierende neuroner. Vi beskriver en metode til at producere gulv-plade konditioneret medium, at anvende den på frisk rygmarv væv, og at vurdere konsekvenserne på proteiner af interesse ved biokemi.

Abstract

Under udviklingen stamfædre og post-mitotiske neuroner modtage signaler fra tilstødende områder, der regulerer deres skæbne. Gulvpladen er en gruppe af gliaceller foring ependymal kanalen ved ventral position. Gulvpladen udtrykker centrale morfogeners bidrager til mønstret af celleafstamninger i rygmarven. På senere udviklingsstadier, gulvpladen regulerer sejlads af axoner i rygmarven, som en barriere for at forhindre passage af ipsilaterale axoner og kontrollerende midterlinjen passage af kommissurale axoner ^1. Disse funktioner opnås gennem udskillelsen af ​​forskellige vejlednings-signaler. Nogle af disse signaler fungerer som lokkemidler og afskrækningsmidler til de voksende axoner, mens andre regulerer vejledning receptorer og downstream signalering at modulere følsomheden af axoner til de lokale vejlednings ^2,3 signaler. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der gør det muligt at undersøge egenskaberne af gulvpladen afledte signaler i en række udviklopmental sammenhænge, ​​baseret på produktion af gulvpladen konditioneret medium (FP ^{cm) 4-6.} Vi eksemplificere så brugen af dette FP ^cm i forbindelse med Axon vejledning. Først rygmarven isoleret fra museembryo på E12.5 og gulvpladen dissekeres ud og dyrkes i plasma-thrombin matrix (figur 1). Second to dage senere, er kommissural væv dissekeres ud fra E12.5 embryoer, findelt og udsat for FP ^cm. For det tredje er det væv behandles til Western blot-analyse af kommissurale markører.

Introduction

Gulvpladen er et velkendt mønster centrum for udvikling af rygmarven, spille centrale roller i specifikationen af stamfædre og postmitotiske celleafstamninger og kontrollere Axon navigation ^7,8. Den eksperimentelle procedure beskrevet her til at producere FP ^cm giver efterforskerne at vurdere de funktionelle egenskaber af gulvplade-afledte signaler i en forskellige sammenhænge udviklingsprocesser, fra celle mønstre og overlevelse til celle og Axon migration.

For at illustrere anvendelsen af sådanne FP ^cm, er dorsale rygmarvsbetændelse indeholder kommissurale neuroner dissekeret, dilacerated og stimuleret med FP ^cm. Vævene kan derefter behandles til Western blot-analyse. Dette gør det muligt at undersøge reglerne i Axon vejledning maskiner ved gulv-plade udgivet signaler. Den fremgangsmåde til behandling af dilacerated friskt væv besidder den store fordel at bevare mikromiljøet af celler i the væv. Således konsekvenserne af behandlingen af FP ^cm eller nogen former for behandling, vurderes i en mere fysiologisk måde end i celler og væv dyrkningsbetingelser.

Protocol

DAG 1

1.. Dissektion af rygmarven bundpladen (FP) fra E12.5 musefostre

Bemærk: Hele proceduren kræver brug af sterile forhold. Det er at foretrække at udføre dissektion under en dissektion hætte for at undgå forurening. Overfladen af ​​emhætten bør rengøres med ethanol. Alle Dissektionsinstrumenter skal steriliseres og holdes i en steril petriskål. Væskerne (medium dissektionsmedium) skal holdes lukket og sat i et isbad. Hvert embryon skal indsamles i de enkelte frisk dråbe. Dette er vigtigt for vævskonservering. Dissektion udføres med Dumont # 5 pincet. For at overføre embryoner mellem retter, greb navlestrengen eller hovedet uden nogen skade på baghjerne. Det er afgørende ikke at beskadige rygmarven at fuldføre dissektion. Forbered kold phosphatpufret saltopløsning (PBS), kold Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -6,5% glucose og stuetemperatur neurobasalt medium.

1.1 rygmarven dissektion

Dyrene behandles i overensstemmelse med retningslinjerne dyr pleje af Centre National de la Recherche Scientifique følgende europæiske direktiver. Fremgangsmåden til eutanasi er cervikal dislokation, det består af påføring af tryk på halsen og dislocating rygsøjlen fra hjernen. Denne metode anbefales til mus dyremodeller, og kan udføres på en hurtig og effektiv måde.

1. Aflive en gravid mus ved E12.5 af drægtighed (E0.5 = første dag efter måtter). Placer musen ventrale side op.
2. Soak maven med 70% ethanol. Klem maveskindet med Adson pincet og skære gennem huden og peritoneal lag med kirurgisk saks. Lave et snit og bruge den til at skære på begge sider af musen for at eksponere den abdominale kavitet.
3. En streng af embryoner er til stede på hver side af musen. Tag fat ene horn af uterus i vævet mellem to embryoner og dissekere det ud startende fra den ydre del. Overfør intakt uterus til en 100 mm petriskål med kold PBS på is.
4. Uddrag embryoner fra ekstra-embryonale væv. Tag fat i vævet placenta (i mørk rød) med to par tænger og træk blidt at rive væv og flytte embryoner fra livmoderen Sac.

Bemærk: For en bedre bevaring, indsamle embryoner fra deres livmoder sac én efter én.

5. De næste trin er udført under binokulære forstørrelsesglas og dissektion hætte. Placer den ene foster i en dråbe kold HBSS-6,5% glucose.
6. Ved hjælp af en pincet, halshugge embryoet.

Bemærk: Klip mellem underkæben og baghjerne, den bageste del af baghjerne er vigtig for de næste skridt.

7. Placer embryo ventrale nedad med den forreste del vender forsøgslederen.
8. Klem hudenaf embryo med en tang og det andet par trække væk huden.

Bemærk: Dette trin gentages, indtil huden er fjernet fra den forreste del af embryoet.

9. Vend embryo forreste side til venstre. Med en pincet "pin ned" foster i den forreste del. Med de øvrige pincet fat i huden og trækker i retning af rostrale side af embryoet. Rygmarven er så tilgængelige.
10. Brug den ene side af pincet til at skære meninges, der stadig wrap rygmarven. Rygmarven er nu åben.
11. Drej embryo forreste side til højre.
12. Frigør væv fra rygmarven startende fra cervikal side af embryoet. Skub pincet under rygmarven (tangen bør holdes lukket for at undgå rygmarv skader). Tangen skal være synligt under rygmarven. Små roterende bevægelser under rygmarven er tilstrækkelige til at afmontereomgivende væv og dorsalrodsganglierne (DRG).

Bemærk: Leaving vedhæftet omgivende væv tilføje vægt til rygmarven, og dermed øge sandsynligheden for at bryde det i løbet af det næste trin.

13. Placer den isolerede rygmarv i en frisk dråbe kold HBSS-6,5% glucose.
14. Placer rygmarven i en flad position, hjernehinderne på toppen og forreste side væk fra forsøgslederen.
15. "PIN-ned" rygmarven ved hjælp af resterende baghjerne med en pincet, og med den anden pincet fat meninges. Skrælle meninges startende fra rostralt side af rygmarven.

Bemærk: Bevægelsen skal være langsom og konstant for at undgå enhver afbrydelse af rygmarven. Vibrerende bevægelser kan lette udstationering af meninges.

1.2 FP dissektion

1. Knib baghjerne med en pincet.
2. FP er den centrale transparent del af vævet. Ved hjælp af en skalpel skåret ud bundpladen.

Bemærk: For at skære på begge sider med samme kvalitet, starte fra rostral side og skiftevis skære i højre side og venstre side af bundpladen.

3. Bevare det dissekerede FP i Neurobasal medium ved stuetemperatur.

2. FP Kultur

Bemærk: Alle trin skal udføres under sterile forhold i en vævskultur hætte. Brug frisk medium og frisk optøede kosttilskud og reagenser. Fremstille sterile dækglas, varm Neurobasal + B27, plasma og HBSS-thrombin.

2.1 FP kultur

1. Placere flere sterile dækglas i en 100 mm petriskål og pipette 20 ul plasma i midten af ​​hver dækglas.
2. Overfør 03:58 FP i hver enkelt plasma-drop og tilsættes 20 ul HBSS-thrombin ved siden af ​​plasma drop og omhyggeligt blandes. Hold dækglasi mindst ti minutter ved stuetemperatur for at tillade koagulation af plasma.

Bemærk: Overførsel to rammeprogrammer i tilfælde af fuldstændig dissektion og mere i tilfælde af delvis dissektion. Bland langsomt med en pipettespids og undgå kontakt med FP eksplantaterne.

Den plasmaprop trækker et par mM som et tegn på koagulering. Koaguleringen må ikke stoppes for tidligt, for at undgå løsgørelse af plasmaclot.

3. Overfør hver dækglas i en 24-brønds plade, og der tilsættes 500 pi Neurobasal + B27. Inkuber 48 timer ved 37 ° C.

DAG 3

3. FP konditioneret medium (FP ^cm) Høst

Bemærk: Høst bør udføres under sterile forhold i en vævskultur hætte. Hvis supernatanten er forurenet eller hvis gulvplader er flydende (hvilket betyder at de måske har mistet livet under kultur period) så skal du ikke høste FP ^cm fra dette godt.

3.1 FP ^cm høst

1. Harvest forsigtigt mediet fra hver brønd.

Bemærk: Du må ikke pipetteres den polymeriserede plasma-thrombin mix eller nogen FP fragmenter.

2. Opbevar 100 pi alikvoter ved -80 ° C.

DAG 4

4.. Dissektion af Spinal Cord kommissurale neuroner fra E12.5 museembryoner

Bemærk: Dette præparat indeholder ikke skal udføres under sterile betingelser. Følg proceduren beskrevet ovenfor til at indsamle fostre. Forbered kold PBS, kold HBSS-6.5% glucose og koldt Neurobasal.

4.1 rygmarven dissektion

1. Ved hjælp af en pincet, halshugge embryoet.

Bemærk: Skær mellem den nederste kæbe og baghjerne, den bageste del af baghjerne er vigtig fornæste skridt.

2. Placer embryo ventrale nedad i en frisk dråbe med den forreste del vender forsøgslederen.
3. Klem huden på embryo med en pincet og med den anden trække væk huden.

Bemærk: Dette trin gentages, indtil huden er fjernet fra den forreste del af embryoet.

4. Vend embryo forreste side til venstre. Med en pincet "pin ned" foster i den forreste del. Med andre pincet fat i huden og trække mod rostralt side af embryonet, for at blotlægge rygmarven.
5. Brug den ene side af pincet til at skære meninges, der stadig wrap rygmarven. Rygmarven er nu udsat og åben.
6. Placer embryo forreste side til højre.
7. Frigør væv fra rygmarven startende fra cervikal side af embryoet. Skub pincet under rygmarven (holde tangen lukket). Forceps skal synligt under rygmarven. Små roterende bevægelser under rygmarven er tilstrækkelige til at frigøre det tilstødende væv og dorsalrodsganglierne (DRG).
8. Overfør det isolerede rygmarven i en ny dråbe kold HBSS-6.5% glucose.
9. Placer rygmarven i en flad position, hjernehinderne på toppen og forreste side væk fra forsøgslederen.
10. "PIN-ned" rygmarven ved hjælp af resterende baghjerne med en pincet, med den anden pincet fat meninges. Skrælle meninges startende fra rostralt side af rygmarven.

4.2 kommissurale Neuron dissektion

1. Knib baghjerne med en pincet.
2. De kommissural neuroner er beliggende i den mest laterale del af rygmarven (rygsiden). Klip denne laterale del med en fin skalpel.

Bemærk: Den dorsale del af rygmarven kan skelnes fra den ventrale del af forskellen i celle density, den ventrale del er mere uigennemsigtig.

Bemærk: For at skære på begge sider med samme kvalitet, starte fra rostral side og skiftevis skære en lille længde på højre side og venstre side.

3. Bevare det dissekerede væv i Neurobasal medium på is til umiddelbar brug.

5.. Behandling af kommissural Tissue med FP ^cm

Bemærk: Denne procedure kræver ikke sterile forhold. Vævet skal opsamles i individuelle 1,5 ml rør. Det frosne FP ^cm bør kun bruges én gang. Undgå flere genindfrysning. Forbered varm FP ^cm (37 ° C).

5.1 Behandlinger af kommissurale neuroner

1. Dilacerate den kommissurale væv med en lille saks.

Bemærk: Skær væv så lille som muligt, for at forstærke tilgængeligheden af cellerne.

2. Fordel temmelig vævet mellem de forskellige eksperimentelle betingelser kontrol behandling og FP ^cm behandling.
3. Centrifugere vævsfragmenter ved 800 xg i 1 min ved 4 ° C.
4. Tjek fordelingen mellem rør.

Bemærk: Hvis det er nødvendigt omfordeler og centrifuger igen, indtil fragmenter er ligeligt fordelt.

5. Supernatanten fjernes.
6. Tilsæt varme FP ^cm og kontrol behandlinger til vævene.

Bemærk: Mængden skal tilpasses til mængden af pelleten og bør være mindst det dobbelte volumen af bundfaldet.

7. Inkuberes ved 37 ° C i 30 min.

Bemærk: Ryst forsigtigt hver 10-15 min

8. Centrifuger ved 800 x g i 1 min og fjern behandling.
9. Tilsæt lysisbuffer

Bemærk: Lydstyrken skal indstilles til etmount pelletvægt og bør være mindst det dobbelte volumen af ​​bundfaldet.

10. Pipettere op og ned for at resuspendere pelleten.

Bemærk: En hvirvel kan også anvendes.

11. Inkuber 15 minutter på is.
12. Centrifuger ved 14.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
13. Opbevar supernatanten og måling af mængden af protein med et Bradford-assay ^9.
14. Tilføj 6x Laemmli puffer.
15. Inkuber ved 95 ° C i 5 minutter for at denaturere proteinindholdet.

Bemærk: Prøver kan straks anvendes eller kan opbevares ved -80 ° C.

16. Vurdere effekten af behandlingen med Western blot ^10.

Bemærk: Mindst 50 ug totale proteiner skal indlæses for hver bane.

Representative Results

Kommissurale væv blev behandlet af FP ^cm og prøverne blev forarbejdet til analyse af receptor-niveauer i Western blot. Anvendelsen af FP ^cm viste sig at øge niveauet af en vejledning receptor PlexinA1, som medierer følsomhed kommissurale axoner med midterlinjen repellent Semaphorin3B efter passage (figur 2). Det fremgik, at signaler, udgivet af FP regulere PlexinA1 niveauerne ^4,6.

Figur 1. Ordninger af dissektion procedure til at isolere bundpladen. De forskellige trin i dissektion og proceduren kultur illustreret. 1) afbrød embryo hovedet, 2-3) fjerne huden, 4) åbner hjernehinden, 5-6) fjerne rygmarven fra foster; 7) fjerne mændeneInges; 8-9) dissekere ud bundpladen 10) tilføj thrombin til FP-plasma mix og vent 10 til 15 minutter ved stuetemperatur, før du tilføjer dyrkningsmediet. 11-12) dissekere de dorsale neuroner 13) dilacerate vævet. A: forreste pol af embryoet. P: bageste pol af embryoet. Pilene viser retningen af bevægelsen. Klik her for at se større figur .

Figur 2. Repræsentativt resultat. A) Dorsal spinal væv blev indsamlet, dilacerated og stimuleret med Gulvplade konditioneret medium og kontrol medium. Prøverne blev lyseret og behandlet til Western blot. Proteiner blev probet med antistoffer anti-PlexinA1 og β-actin. Poto illustrerer stigningen i PlexinA1 niveauet i prøven stimuleret med gulvpladen konditioneret medium. B) Den dot blot viser ekspressionen af GDNF i FP ^cm i forhold til den kontrol medium.

Discussion

Produktionen af ​​gulv-plade medium giver en effektiv og nem måde for at vurdere de biologiske egenskaber af gulv plade udgivet signaler.

Plasma-thrombin matrix giver fremragende betingelse for væv overlevelse. Alligevel kan denne beriget miljø være en begrænsning for nogle typer af eksperimenter. Således kan bundpladen væv også dyrkes i agarosematrix. Kvaliteten af bundpladen konditionerede medium kan vurderes ved påvisning af kendte gulvplade frigivne signaler, såsom GDNF (fig. 2), Shh og Netrin ^11. Deres tilstedeværelse i det konditionerede medium kan vurderes ved Western blot eller dot-blot.

I denne procedure celler er undersøgt i deres native mikromiljø. Dette forhindrer yderligere oplysninger om den type af celler i væv, der reagerer på behandlingen. Da bundpladen ikke er en homogen struktur, koncentrationen af ​​aktive komponenter såsom Wnts kan være forskellig mellem kulturerne afhængigt af dissekerede området langs Rostro-caudale akse.

Biokemi på frisk dilacerated væv besidder den fordel at studere celler i deres oprindelige mikromiljø. Således er celle adfærd undersøgt i forhold, der rekapitulere så tæt som muligt deres oprindelige kontekst ^12. Den dorsale rygmarv ikke kun indeholde kommissurale neuroner, så virkningerne af FP ^cm også kan vurderes i dyrkede kommissurale neuroner.

Mediet kan anvendes til forskellige typer af celle-og vævskulturer. Et stort udvalg af parametre kan vurderes fra celle identitet, celleoverlevelse, celledød og celledifferentiering. Prøver kan behandles for proteomics.

En vigtig parameter i forberedelsen af ​​den dilacerated frisk væv er fordelingen af ​​vævet for kontrol og eksperimentelle behandlinger. Det er important at indsamle væv først i et enkelt rør og dilacerate vævet kollektivt forud at adskille prøverne. Dette begrænser forskellen i proteinkoncentration påvises efter lysis mellem prøverne.

Bemærk, at HBSS-glucose kan opbevares ved 4 ° C i op til en måned. Neurobasal kan også holdes i en måned ved 4 ° C. B27 alikvoter kan opbevares ved -20 ° C til langsigtet og ved 4 ° C i op til én uge. Plasma prøver bør opbevares ved -20 ° C og kan fryses igen efter brug. Thrombin portioner kan også opbevares ved -20 ° C og kan ikke genfryses.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents Required
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+- free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1 mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10 mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50x
HEPES (260 g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0.5 M, pH 8
MgCl2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
Distilled H2O
Table 1.Reagents required.
Tools and Materials
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
Microknives	Fine Science Tools	10136-14
Table 2. Tools and materials.
Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18 mm x 18 mm Bunsen gas burner 24-well plate tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge Recipes FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS-thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10 mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH 7,4 HEPES (260 g/mol) 25 mM EDTA (pH 8) 5 mM MgCl2 1 mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1x Sodium Orthovanadate 0.2 M H2O Laemmli Buffer Tris 0.5 M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0.6 M Bromophenol blue H2O