Her beskriver vi de eksperimentelle prosedyrer involvert i to-foton avbildning av mus cortex under atferd i en virtuell virkelighet miljø.
I de senere årene, har to-foton bildebehandling blitt et uvurderlig verktøy i nevrovitenskap, som gjør det mulig for kronisk måling av aktiviteten til genetisk identifiserte celler under atferd 1-6. Her beskriver vi metoder for å utføre to-foton bildebehandling i mus cortex mens dyret navigerer en virtuell virkelighet miljø. Vi fokuserer på de aspektene av de eksperimentelle prosedyrer som er nøkkelen til bildebehandling i en oppfører dyret i en sterkt opplyst virtuelt miljø. De viktigste problemene som oppstår i denne eksperimentelle oppsett som vi her adresse er: minimere hjernebevegelsesrelaterte gjenstander, minimere lys lekkasje fra den virtuelle virkeligheten projeksjonssystem, og minimere laser indusert vevsskade. Vi tilbyr også prøve programvare for å styre den virtuelle virkeligheten miljøet og å gjøre elev sporing. Med disse fremgangsmåter og ressurser bør det være mulig å konvertere en konvensjonell to-foton mikroskop for bruk i oppfører mus.
To-foton avbildning av kalsium indikatorer (genetisk kodet som GCaMP5 7 eller R-GECO 8, eller syntetiske fargestoffer som OGB eller Fluo4) har dukket opp som en kraftig metode for å måle nerveaktiviteten i oppfører mus 1-6. Det muliggjør den samtidige måling av aktiviteten til flere hundre celler ved nær-enkeltaksjonspotensial-oppløsning, opp til om lag 800 mikrometer under hjernen overflaten 9,10. Dessuten, ved hjelp av genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs) neuronal aktivitet kan måles kronisk 5,11,12, og genetisk definerte celletyper 13.. Sammen utgjør disse metoder gir en grad av tidsmessig og romlig oppløsning som kan åpnes opp en rekke nye muligheter i studiet av neuronal beregning in vivo.
Kirurgiske inngrep er nødvendig for å avdekke og merke musen hjernen for bildebehandling. Cellene er vanligvis tilført ved hjelp av en rekombinant adeno-assosiert vir oss (AAV) system for Geci levering og et kranie vindu er implantert over injeksjonsstedet for å få optisk tilgang til hjernen. Et hode linje er da festet til skallen for hodefikseringen i henhold til to-foton mikroskop. Utformingen og gjennomføringen av disse trinnene er avgjørende som de fleste av problemene med våken bildebehandling oppstå ustabilitet i utarbeidelsen. Ideelt sett den fremgangsmåte som er beskrevet her bør tillate kronisk avbildning av inntil flere måneder etter operasjonen.
Slik aktiverer visuelt guidet oppførsel under to-foton bildebehandling, sitter hodet fast mus på en luft støttet sfærisk tredemølle, som den kan bruke til å navigere en virtuell virkelighet miljø. Locomotion av musen på tredemølle er koblet til bevegelse i det virtuelle miljøet som vises på en toroidal skjermen rundt muse 14,15. Behavioral variabler som bevegelse, visuell stimulans, og elev posisjon kan registreres seks.
t "> Vi beskriver prosedyrene involvert i kronisk to-foton bildebehandling i mus utforske en virtuell virkelighet miljø De viktigste punktene som tas opp er:. reduksjon av bevegelse gjenstander, reduksjon av lys lekkasje, maksimering av antall samtidig registrert celler, og minimering av bilde skade. Vi gir også informasjon om hvordan du setter opp den luft støttet tredemølle, elev sporing, og den virtuelle virkeligheten miljø. Prosedyrene som beskrives her kan brukes for å avbilde fluorescensmerkede cellepopulasjoner i hodet faste mus i et potensielt bredt spekter av atferds paradigmer .Nøkkelen til suksess for atferds to-foton avbildning er stabiliteten av preparatet på to måter:
For å holde den inflammatoriske immunre…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Max Planck Society, og Human Frontiers Science Program.
cover slips (d = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
12kHz resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
Controller for piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
Objective 16x, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |