واحد النبات، عوالم مصغرة العقيمة لNodulation ونمو النبات البقول<em> Medicago truncatula</em> مع بالريزوبيا المتكافل<em> Sinorhizobium meliloti</em
Summary
نمو النباتات truncatula Medicago في التعايش مع البكتيريا المثبتة للنيتروجين meliloti Sinorhizobium في الفردية، عوالم مصغرة معقمة مصنوعة من لوحات المختبر القياسية يسمح الفحص المتكرر للأنظمة الجذر والعقيدات دون المساس العقم. يمكن الحفاظ على النباتات في هذه الغرف النمو لمدة تصل إلى 9 أسابيع.
Abstract
البكتيريا التكافلية بالريزوبيا تشكل عقيدات المثبتة للنيتروجين على جذور النباتات البقولية المضيف متوافق. أحد أنظمة النموذج الأكثر متطورة لدراسة هذه التفاعلات هو المصنع Medicago truncatula السيرة الذاتية. Jemalong A17 وبالريزوبيا بكتيريا Sinorhizobium meliloti 1021. التصوير المتكرر من جذور النباتات والتهديف من الظواهر التكافلية يتطلب الأساليب التي هي غير مدمرة إما النباتات أو البكتيريا. الظواهر التكافلية من بعض النباتات والمسوخ البكتيرية تصبح واضحة بعد فترات قصيرة نسبيا من النمو، ولا تتطلب مراقبة طويلة الأجل للتفاعل المضيف / المتكافل. ومع ذلك، فإن الاختلافات الطفيفة في تكافلية الكفاءة والعقيدات الشيخوخة الظواهر التي ليست واضحة في المراحل المبكرة من عملية nodulation تتطلب فترات النمو طويلة نسبيا قبل أن يتم وسجل. وقد تم تطوير العديد من الطرق للنمو على المدى الطويل ومراقبة هذا الزوج المضيف / المتكافل.ومع ذلك، فإن العديد من هذه الأساليب تتطلب سقي متكررة، مما يزيد من إمكانية تلوث الميكروبات الأخرى. أساليب أخرى تتطلب مساحة كبيرة نسبيا للنمو أعداد كبيرة من النباتات. وصف الأسلوب هنا، والنمو التكافلية من M. truncatula / س. meliloti في العقيمة، عوالم مصغرة نبات واحد، لديه العديد من المزايا. النباتات في هذه عوالم مصغرة لها الرطوبة والمواد المغذية كافية لضمان ليس مطلوبا أن سقي لمدة تصل إلى 9 أسابيع، ومنع انتقال التلوث أثناء الري. وهذا يسمح الظواهر ليكون كميا التي قد تضيع في أنظمة النمو على المدى القصير، مثل التأخير خفية في التنمية العقيدات العقيدات وأوائل الشيخوخة. أيضا، وينظر إلى جذور والعقيدات في مصغرا بسهولة من خلال لوحة غطاء، لذلك ليس مطلوبا يصل تأصيل النباتات للمراقبة.
Introduction
التفاعل بين النبات العائل البقوليات Medicago truncatula A17 والبكتيريا بالريزوبيا Sinorhizobium meliloti 1021 هو واحد من أنظمة النموذج الأكثر لين العريكة لدراسة جذور التنمية العقيدات والمثبتة للنيتروجين التعايش. وقد تسلسل الجينوم من كلا الشريكين التكافلية 1،2 و كل من النبات والبكتيريا قابلة للتلاعب الجيني 3،4. تحليل الظواهر من بشقيه النباتي والمسوخ البكتيرية تتطلب القدرة على مراقبة مراحل التنمية والعقيدات لقياس الإنتاجية تكافلية مع مرور الوقت. نحن هنا تصف طريقة لمراقبة تطور العقيدات الجذرية للM. truncatula السيرة الذاتية. Jemalong A17 تلقيح مع S. meliloti 1021 ضمن عوالم مصغرة الفردية المقدمة من معيار، على مدار 100 مم، 15 مم لوحات المختبر العميقة (الشكل 1A). يتعرض تبادل لاطلاق النار وينمو من خلال بوابة حقق في الجانب من لوحة (الارقام ..وفاق 1B، 1C، و1E). وترد جذور داخل عوالم مصغرة وأبقى عقيمة، في حين يسمح للمراقبة من خلال غطاء اللوحة (الشكل 1D). منذ تبادل لاطلاق النار يمكن الوصول إليه، ليست مقيدة نموها، ويمكن أن يقاس على فترات دورية دون المساس عقم جذورها. طريقة خلق عوالم مصغرة حقق لوحة وضعت أصلا من قبل لي، وآخرون. 5 لزراعة نباتات البرسيم، ولكن لم يعتمد على نطاق واسع على الرغم من العديد من المزايا على مدى أساليب أخرى. وقد وضعت وهناك تباين على هذا الأسلوب أيضا لتحليل التفاعل بين جذور النباتات وفطر 6. تكيفنا الآن وهذا الأسلوب الأمثل لنمو M. النباتات truncatula. وصفت مزايا هذا البروتوكول على أكثر شيوعا الأساليب أدناه.
هناك العديد من الطرق التي هي حاليا في استخدام واسع للدراسات nodulation من M. truncatula inocuذا الصلة مع S. meliloti 7. الأسلوب الأكثر شيوعا لإعداد واسعة النطاق من جذور nodulated هو النمو في قيسونات aeroponic 7. في هذه الطريقة، يتم تعليق النباتات على سفينة كبيرة وتتم تهوية الجذور مع خليط من S. meliloti والمحلول المغذي 7. هذا الأسلوب هو عملي إذا راثى واحد فقط من S. meliloti هو لفحصها. لأنه يتطلب هباء من تركيزات عالية من البكتيريا، وهناك احتمال كبير للتلوث المتبادل بين قيسونات تلقيح مع سلالات بكتيرية مختلفة. طريقة أخرى التي غالبا ما تستخدم لإعداد كميات كبيرة من النباتات الملقحة هو النمو في أحواض أو أواني من البيرلايت، الخس، والرمل أو الطين المكلس التي غرست مع المحلول المغذي وتلقيح مع S. meliloti 7. يتطلب هذا الأسلوب استخدام أحواض المياه المفتوحة أو الأواني، ويتطلب الري وتجديد المحلول المغذي. وثمة عيب آخر من الأواني هو أن النباتاتيجب إزالة هذه المصفوفة من الجسيمات لفحص الجذور والعقيدات. عيب آخر من هذا الأسلوب هو أن مساحة كبيرة من الفضاء حاضنة مطلوب عند العديد من مختلف S. المورثات meliloti وينبغي مقارنة، لأن وعاء منفصل يجب استخدام لكل الوراثي الجرثومي. في "جرة ليونارد" هو الاختلاف على هذا الأسلوب 8،9. يتكون جرة يونارد سفينتين تعقيمها مكدسة واحدة فوق الأخرى، ومتصلة بواسطة الفتيل. يتم وضع متوسط النمو في السفينة أقل وتعادل عن طريق الفتيل قبل عمل شعري في مصفوفة النمو من البيرلايت، الخس، والرمل أو الطين المكلس في السفينة العلوي. يتم وضع الشتلات (ق) في مصفوفة النمو وتلقيح مع S. meliloti. هذه الطريقة لا تتطلب الري، ولكن فحص الجذور والعقيدات يتطلب أن الشتلات إزالتها من مصفوفة النمو الجسيمات.
هناك العديد من الطرق التي لا يسمح فحص سهل من رونهاية الخبر. واحدة من هذه هي شفافة "الحقيبة النمو" البلاستيك 7. عيوب هذا الأسلوب هو أن سقي متكررة مطلوب فقط منذ ≤ 10 مل المتوسطة السائل هو الأمثل لزراعة M. truncatula في الحقائب 7. والتجارب الحقيبة أيضا عادة ما تقتصر على ~ 2 أسابيع 7، وذلك بسبب انهيار الفتيل ورقة داخل الحقيبة. طريقتين الأخرى التي تستخدم عادة هي مماثلة لطريقتنا في أن النباتات التي تزرع على أجار والجذور واضحة، ولكن هذه الأساليب أيضا أن يتجنب عيوب الإجراء لدينا. في هذه الأساليب، وترد النباتات تماما في غضون 24.5 سم x 24.5 سم لوحات أجار مختومة حول الجزء العلوي مع الشريط الجراحية التي يسهل اختراقها أو تزرع في أنابيب أجار مائل مقفول مع المقابس القطن أو القبعات البلاستيكية 7. كل من هذه الأساليب تسمح الفحص سهلة من الجذور ويمكن أن تظل عقيمة. ومع ذلك، وعادة ما يزرع أنابيب مائل أجار مع 20 مل فقط أجار المتوسطة 7 وتتطلب الري والمغذيات وddition للنمو على المدى الطويل من النباتات. النباتات التي تزرع داخل 24.5 سم x 24.5 سم أجار عوالم مصغرة لوحة لها الرطوبة والمواد المغذية للنمو على المدى الطويل كافية، ولكن تبادل لاطلاق النار ينمو بسرعة ويصبح مقيدا داخل مصغرا لوحة المغلقة وغاز الاثيلين يمكن أن تتراكم تثبيط nodulation 7. في الإجراء وصفها هنا، تتعرض تبادل لاطلاق النار وينمو بحرية خارج مصغرا والذي يحتوي على 70 ~ مل من وسائل الإعلام، مما يتيح النمو على المدى الطويل.
الإجراء الموضح هنا قد يكون مفيدا ليس فقط لدراسة nodulation من النباتات البقولية، ولكن أيضا لدراسة الظواهر جذور النباتات الأخرى متوسطة الحجم. الفرق بين هذه عوالم مصغرة ومصنع البولي التقليدية الأنسجة الثقافة جرة هو أن جذور في عوالم مصغرة لوحة الموصوفة هنا تنمو على السطح الرأسي للأجار بدلا من أسفل إلى طبقة الأفقي للأجار في الجزء السفلي من الجرة. وهذا يسمح الجذر إلى أن يرفع من على سطح أجار مع الحد الأدنى من دamage إلى جذور الشعر، والحد الأدنى التصاق أجار إلى سطح الجذر، مما يسهل فحص جذور الشعر بواسطة المجهر.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من الخطوات من البروتوكول التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق النجاح: 1) اختبار ضرورة استخدام النقى النبات خلية ثقافة لا يمكن المبالغة أجار. هذه ليست حرجة لشتلات البرسيم، ولكن من الأهمية بمكان لنمو M. truncatula A17. 2) ومن المهم أن تنبت شتلة على لوحات أجار الرأسي ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للوزارة الزراعة الأميركية للأغذية والزراعة، الزراعة ومنحة مبادرة بحوث الأغذية 2010-65108 – 20582 لKMJ نشكر بريان K. اشبورن للمراجعة نقدية للمخطوطة.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
References
- Galibert, F., et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 293, 668-672 (2001).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520-524 (2011).
- Glazebrook, J., Walker, G. C. Genetic techniques in Rhizobium meliloti. Methods Enzymol. 204, 398-418 (1991).
- Cheng, X., Wen, J., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K. S. Reverse genetics in medicago truncatula using Tnt1 insertion mutants. Methods Mol Biol. 678, 179-190 (2011).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6231-6235 (1985).
- Wong, K. K. Y., Fortin, J. A. A Petri Dish Technique for the Aseptic Synthesis of Ectomycorrhizae. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 67, 1713-1716 (1989).
- Barker, D. G., Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W., et al. . The Medicago truncatula handbook. , (2006).
- Leonard, L. T. A Simple Assembly for Use in the Testing of Cultures of Rhizobia. J Bacteriol. 45, 523-527 (1943).
- Trung, B. C., Yoshida, S. Improvement of Leonard jar assembly for screening of effective rhizobium. Soil Sci Plant Nutr. 29, 97-100 (1983).
- Penmetsa, R. V., Cook, D. R. Production and characterization of diverse developmental mutants of Medicago truncatula. Plant Physiol. 123, 1387-1398 (2000).
- Garcia, J., Barker, D. G., Journet, E. P., Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. . The Medicago truncatula handbook. , (2006).
- Vincent, J. M. . A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria. , (1970).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).
- Pladys, D., Vance, C. P. Proteolysis during Development and Senescence of Effective and Plant Gene-Controlled Ineffective Alfalfa Nodules. Plant Physiology. 103, 379-384 (1993).
- Vasse, J., de Billy, F., Truchet, G. Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction. The Plant J. 4, 555-566 (1993).
- Johnson, L. E. B., Vance, C. P. Histological and Biochemical Comparisons of Plant Induced Ineffective Nodules. Phytopathology. 71, 884 (1981).
- Vance, C. P., Johnson, L. E. B., Hardarson, G. Histological Comparisons of Plant and Rhizobium Induced Ineffective Nodules in Alfalfa. Physiological Plant Pathology. 17, 167 (1980).
- Van de Velde, W., et al. Aging in legume symbiosis. A molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula. Plant Physiol. 141, 711-720 (2006).
- Jones, K. M. Increased production of the exopolysaccharide succinoglycan enhances Sinorhizobium meliloti 1021 symbiosis with the host plant Medicago truncatula. J Bacteriol. 194, 4322-4331 (2012).
- Queiroux, C., et al. A comparative genomics screen identifies a Sinorhizobium meliloti 1021 sodM-like gene strongly expressed within host plant nodules. BMC Microbiol. 12, 74 (2012).
