Einzel-Anlage, steril Mikrokosmen für Knöllchenbildung und des Wachstums der Pflanze Hülsenfrucht<em> Medicago truncatula</em> Mit dem Rhizobia Symbiont<em> Sinorhizobium meliloti</em
Summary
Wachstum von Medicago truncatula Pflanzen in Symbiose mit der Stickstoff-fixierenden Bakterien Sinorhizobium meliloti einzeln steril Mikrokosmen von Standard-Laborplatten ermöglicht häufige Prüfung der Wurzelsysteme und Knötchen, ohne Sterilität. Pflanzen in den Wachstumskammern für bis zu 9 Wochen aufrechterhalten werden.
Abstract
Rhizobia Bakterien bilden symbiotische, Stickstoff-fixierende Knöllchen an den Wurzeln der Leguminosen-kompatible Host-Pflanzen. Einer der gut entwickelten Modellsysteme für die Untersuchung dieser Wechselwirkungen ist die Pflanze Medicago truncatula cv. Jemalong A17 und die rhizobial Bakterium Sinorhizobium meliloti 1021. Wiederholte Bildgebung von Pflanzenwurzeln und Scoring von symbiotischen Phänotypen erfordert Methoden, die nicht-destruktive entweder Pflanzen oder Bakterien sind. Die symbiotische Phänotypen von einigen pflanzlichen und bakteriellen Mutanten offensichtlich nach relativ kurzer Perioden des Wachstums und haben langfristige Beobachtung der Wirt / Symbionten Interaktion erfordert. , Feine Unterschiede in der Effizienz und symbiotische Knoten Seneszenz Phänotypen, die in den frühen Stadien der Knöllchen Verfahren ersichtlich sind, erfordern jedoch relativ lange Wachstumsperioden, bevor sie bewertet werden können. Mehrere Verfahren wurden für langfristiges Wachstum und Beobachtung dieser Wirt / Symbionten Paar entwickelt.Viele dieser Verfahren erfordern jedoch wiederholt Wässern, die die Möglichkeit der Verunreinigung durch andere Mikroorganismen erhöht. Andere Verfahren erfordern einen relativ großen Raum für das Wachstum einer großen Zahl von Pflanzen. Die hier beschriebene Methode, symbiotische Wachstum von M. truncatula / S. meliloti in sterilen Einweg-Anlage in Mikrokosmen, hat mehrere Vorteile. Pflanzen in diesen Mikrokosmen ausreichend Feuchtigkeit und Nährstoffe, um sicherzustellen, dass die Bewässerung nicht bis zu 9 Wochen erforderlich, eine Kreuzkontamination verhindert wird beim Gießen. Dies ermöglicht Phänotypen zu quantifizieren, die in kurzfristigen Wachstumssysteme, wie subtile Verzögerungen bei der Entwicklung und Knötchen Knötchen frühen Seneszenz verpasst werden könnte. Auch werden die Wurzeln und Knollen im Mikro leicht durch die Deckelplatte betrachtet, so up-Verwurzelung der Pflanzen für die Beobachtung ist nicht erforderlich.
Introduction
Die Interaktion zwischen der Hülsenfrüchte Wirtspflanze Medicago truncatula A17 und dem Bakterium rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021 ist eine der am meisten gefügig Modellsysteme für die Untersuchung von Knöllchenentwicklung und Stickstoff-fixierenden Symbiose. Die Genome der beiden Symbiosepartnern wurden sequenziert 1,2 und sowohl Pflanzen-und Bakterium sind zugänglich für genetische Manipulation 3,4. Analyse der Phänotypen von sowohl pflanzlichen und bakteriellen Mutanten erfordert die Fähigkeit, die Stufen des Knotens Entwicklung zu beobachten und die symbiotische Produktivität über die Zeit quantifiziert. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Beobachtung der Knöllchen Entwicklung M. truncatula cv. Jemalong A17 mit S. geimpft meliloti 1021 innerhalb der einzelnen Mikrokosmen von Standard, rund 100 mm Durchmesser, 15 mm tief Laborplatten (1A) gemacht. Das Shooting wird durch eine Kerböffnung an der Seite der Platte (ausgesetzt und wächst Figurn 1B, 1C und 1E). Wurzeln in den Mikrokosmen enthalten und steril gehalten, während eine Beobachtung durch den Deckel der Platte (Fig. 1D). Da die Aufnahmen zugänglich ist, wird sein Wachstum nicht eingeschränkt und es können in periodischen Zeitabständen, ohne die Sterilität des Wurzel gemessen werden. Das Verfahren zum Erzeugen von Kerbplatte Mikrokosmen wurde ursprünglich von Leigh et al. 5 für wachsende Alfalfa-Pflanzen entwickelten, aber es war nicht weit trotz seiner vielen Vorteile gegenüber anderen Verfahren angewandt. Eine Variante dieses Verfahrens wurde auch für die Analyse der Wechselwirkung zwischen Pflanzenwurzeln und Mykorrhiza 6 entwickelt. Wir haben nun eingerichtet und für das Wachstum von M. optimiert dieses Verfahren truncatula Pflanzen. Die Vorteile dieses Protokolls über häufigsten verwendeten Verfahren sind nachstehend beschrieben.
Es gibt mehrere Methoden, die derzeit im breiten Einsatz für Knöllchen Studien von M. truncatula inokuliertlated mit S. meliloti 7. Das am häufigsten verwendete Verfahren für die großtechnische Herstellung von knotige Wurzeln ist das Wachstum in aeroponischen Senkkästen 7. Bei diesem Verfahren werden die Pflanzen in einem großen Gefäß suspendiert und Wurzeln werden mit einer Mischung aus S. belüftet meliloti-und Nährstofflösung 7. Diese Methode ist praktisch, wenn nur ein Genotyp von S. meliloti getestet werden. Da es Aerosolisierung von hohen Konzentrationen von Bakterien erfordert, gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination zwischen den Kästen mit verschiedenen Bakterienstämmen beimpft. Ein weiteres Verfahren, das oft verwendet wird, um große Mengen von inokulierten Pflanzen herzustellen, ist das Wachstum in Kübeln oder Töpfen, Perlit, Vermiculit, Sand oder calcinierten Ton, die mit Nährstofflösung infundiert werden und mit S. inokuliert meliloti 7. Diese Methode erfordert die Verwendung von offenen Kübeln oder Töpfen und erfordert Bewässerung und die Wiederauffüllung der Nährlösung. Ein weiterer Nachteil ist, dass Pflanzen Töpfemuss dieses teilchenförmige Matrix zur Prüfung der Wurzeln und Knollen entfernt werden. Ein weiterer Nachteil dieser Methode ist, dass ein großer Bereich der Inkubator Platz benötigt, wenn viele verschiedene S. meliloti Genotypen zu vergleichen sind, weil ein separater Topf muss für jeden Bakterien Genotyp verwendet werden. Die "Leonard jar" ist eine Variante dieser Methode 8,9. Ein Leonard Glas besteht aus zwei sterilisierte Gefäße übereinander gestapelt der anderen und durch einen Docht verbunden sind. Wachstumsmedium ist in dem unteren Gefäß gegeben und durch den Docht durch Kapillarwirkung in eine Wachstumsmatrix von Perlit, Vermiculit, Sand oder calcinierten Ton im oberen Gefäß gezogen. Der Keimling (s) in der Wachstumsmatrix eingebracht und mit S. inokuliert meliloti. Dieses Verfahren erfordert keine Bewässerung, aber Prüfung der Wurzeln und Knollen erfordert, dass der Keimling aus dem teilchenförmigen Wachstumsmatrix entfernt werden.
Es gibt mehrere Methoden, die einfach nicht zulassen Prüfung roots. Eine davon ist die transparente Kunststoff "Wachstumsbeutel" 7. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist, dass häufige Bewässerung da nur ≤ 10 ml flüssiges Medium ist optimal für wachsende M. erforderlich truncatula in Beuteln 7. Pouch Experimente sind in der Regel auch nach ~ 2 Wochen 7 begrenzt, bedingt durch den Zerfall des Papiers Docht in dem Beutel. Zwei weitere Methoden, die üblicherweise verwendet werden, sind ähnlich unserer Verfahren, daß die Pflanzen auf Agarplatten gezüchtet und die Wurzeln sichtbar sind, aber diese Verfahren weisen Nachteile auf, die unserem Verfahren vermeidet. Bei diesen Verfahren werden die Pflanzen vollständig in 24,5 cm x 24,5 cm Agar-Platten um die Spitze mit porösen chirurgischen Band versiegelt oder in Agar-Schrägröhrchen mit Baumwolle Topfen oder Kunststoffkappen verschlossen gewachsen 7 enthalten. Beide Methoden ermöglichen eine einfache Prüfung der Wurzeln und steril gehalten werden. Jedoch werden die Agar-Schrägröhrchen in der Regel mit 20 ml Agarmedium gewachsen 7 und erfordern eine Bewässerung und Nährstoffddition für langfristige Wachstum der Pflanzen. Pflanzen innerhalb der 24,5 cm x 24,5 cm gewachsen Agar-Platte Mikrokosmen ausreichend Feuchtigkeit und Nährstoffe, die für langfristiges Wachstum, aber die wachsende Shooting wird schnell in die geschlossene Platte Mikrokosmos und Ethylengas aufbauen kann Hemmung Nodulation 7 eingeschränkt. In dem hier beschriebenen Verfahren wird der Shooting ausgesetzt und wächst frei außerhalb des Mikrokosmos, der ~ enthält 70 ml Medium, so dass langfristige Wachstum.
Das hier beschriebene Verfahren kann nicht nur für die Untersuchung der Nodulation von Hülsenfruchtpflanzen, aber auch für die Untersuchung der Wurzel Phänotypen anderen mittelgroßen Anlagen nützlich sein. Der Unterschied zwischen diesen Mikrokosmen und einem traditionellen Polycarbonat Pflanzengewebe-Kulturgefäß ist, dass Wurzeln in den hier beschriebenen Platten Mikrokosmen wachsen auf der vertikalen Oberfläche des Agars anstatt nach unten in eine horizontale Schicht aus Agar am Boden des Glases. Dies ermöglicht die Wurzel aus der Agar-Oberfläche mit minimaler d angehoben werdenAmage Wurzelhaare und minimale Haftung Agar zu der Wurzeloberfläche, der die Prüfung der Wurzelhaare durch Mikroskopie ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere Schritte des Protokolls, die kritisch für den Erfolg sind: 1) die Notwendigkeit der Verwendung von gereinigtem, Pflanzenzellkultur getestet Agar kann nicht überbetont werden. Dies ist nicht kritisch für Alfalfa Keimlingen, aber es kritisch für das Wachstum von M. ist truncatula A17. 2) Es ist wichtig, um Setzlinge auf vertikalen Agarplatten keimen wie in Schritt 1 beschrieben. Die weit verbreitete Technik der keimenden Sämlinge auf einem invertierten horizontalen Fläche in einer 1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der USDA National Institute of Food and Agriculture, Landwirtschaft und Nahrungsmittelforschung Initiative 2010-65108 Zuschuss finanziert – 20582 zu KMJ Wir danken Brian K. Washburn für kritische Durchsicht des Manuskripts.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
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