Single-anlæg, Sterile mikrokosmos for rodknolddannelse og vækst af bælgplanter Plant<em> Medicago truncatula</em> Med Rhizobial Symbiont<em> Sinorhizobium meliloti</em

Summary

Vækst af Medicago truncatula planter i symbiose med kvælstoffikserende bakterier Sinorhizobium meliloti i individuelle, sterile mikrokosmos fremstillet standardlaboratoriemetoder plader tillader hyppig undersøgelse af rodsystemer og knuder uden at kompromittere sterilitet. Planter kan opretholdes i disse vækstkamre i op til 9 uger.

Abstract

Rhizobial bakterier danner symbiotiske, kvælstoffikserende knuder på rødderne af kompatible vært bælgplanter. En af de mest veludviklede modelsystemer til at studere disse interaktioner er planten Medicago truncatula cv. Jemalong A17 og rhizobial bakterie Sinorhizobium meliloti 1021. Gentagen billeddannelse af planterødder og scoring af symbiotiske fænotyper kræver metoder, der er ikke-destruktiv til enten planter eller bakterier. Det symbiotiske fænotyper af nogle plante-og bakterielle mutanter blive synlige efter relativt korte perioder med vækst, og ikke kræver langvarig observation af vært / symbionten interaktion. Men subtile forskelle i symbiotiske effektivitet og knuder degeneration fænotyper, der ikke er synlige i de tidlige stadier af rodknolddannelse proces kræver relativt lange vækstperioder, før de kan blive scoret. Der er udviklet flere metoder til langsigtet vækst og observation af denne vært / symbionten par.Men mange af disse metoder kræver gentagen vanding, hvilket øger muligheden for kontamination med andre mikrober. Andre fremgangsmåder kræver en relativt stor plads til vækst af et stort antal planter. Fremgangsmåden beskrives her, symbiotisk vækst M. truncatula / S. meliloti i sterile, single-plant mikrokosmer har flere fordele. Planter i disse mikrokosmos har tilstrækkelig fugt og næringsstoffer for at sikre, at vanding er ikke påkrævet for op til 9 uger, forhindrer krydskontaminering under vanding. Dette giver fænotyper skal kvantificeres, der måtte blive savnet i kortsigtede vækst-systemer, såsom subtile forsinkelser i knude udvikling og tidlig knude ældning. Også, rødder og knuder i mikrokosmos let ses gennem pladen låget, så op-forankring af planterne til observation er ikke påkrævet.

Introduction

Samspillet mellem bælgplanter værtsplante Medicago truncatula A17 og rhizobial bakterie Sinorhizobium meliloti 1021 er en af de mest medgørlige modelsystemer til studiet af roden knude udvikling og kvælstof-fixing symbiose. Genomer af både symbiotiske partnere er blevet sekventeret ^1,2 og både plante-og bakterie er modtagelig for genetisk manipulation ^3,4. Analyse af fænotyper af både plante-og bakterielle mutanter kræver evnen til at iagttage stadier af knuden udvikling og for at kvantificere det symbiotiske produktivitet over tid. Her beskriver vi en metode til observation af rod knude udvikling af M. truncatula cv. Jemalong A17 inokuleret med S. meliloti 1021 inden for de enkelte mikrokosmos lavet af standard, rund Ø 100 mm, 15 mm dybe laboratorie-plader (figur 1A). Optagelserne er blotlagt og vokser gennem et hak portal i den side af pladen (Figures 1B, 1C og 1E). Rødder er indeholdt i mikrokosmos og holdes steril, samtidig med at observation gennem låget af pladen (figur 1D). Da skyde er tilgængelig, er dens vækst ikke begrænset, og det kan måles ved regelmæssige intervaller, uden at kompromittere steriliteten af ​​roden. Den metode til at skabe hak-plade mikrokosmos blev oprindeligt udviklet af Leigh, et ​​al. ⁵ for dyrkning lucerneplanter, men det var ikke udbredt på trods af sine mange fordele i forhold til andre metoder. En variation af denne metode blev også udviklet til analyse af samspillet mellem planternes rødder og mykorrhiza ^6. Vi har nu tilpasset og optimeret denne fremgangsmåde til væksten af M. truncatula planter. Fordelene ved denne protokol end mere almindeligt anvendte metoder er beskrevet nedenfor.

Der er flere metoder, der i øjeblikket bred anvendelse til rodknolddannelse studier af M. truncatula inoculerede med S. meliloti ^7.. De hyppigst anvendte metode til fremstilling af nodulated rødder storstilet er vækst i aeroponic sænkekasser ^7. I denne metode, er planter ophængt over et stort fartøj og rødder beluftet med en blanding af S. meliloti og næringsstof løsning ^7. Denne metode er praktisk, hvis kun en genotype S. meliloti skal testes. Da det kræver aerosolisering af høje koncentrationer af bakterier, der er en høj sandsynlighed for krydskontaminering mellem sænkekasser inokuleret med forskellige bakteriestammer. En anden metode, der ofte bruges til at forberede store mængder af podede planter, er væksten i krukker eller potter af perlit, vermiculit, sand eller brændt ler, der er tilført med næringsstof løsning og podet med S. meliloti ^7.. Denne metode kræver brug af åbne baljer eller potter, og kræver vanding og opfyldning af næringsstof løsning. En anden ulempe ved potter er, at planterskal fjernes fra denne partikelmatrix til undersøgelse af rødder og knuder. En anden ulempe ved denne metode er, at et stort område af inkubatoren plads er påkrævet, når mange forskellige S. meliloti genotyper skal sammenlignes, fordi en separat pulje skal anvendes til hver bakteriel genotype. Den "Leonard krukke" er en variation af denne metode ^8,9. En Leonard krukke består af to steriliserede fartøjer stablet oven på den anden og er forbundet af en væge. Vækstmedium er placeret i den nederste beholder og trækkes gennem vægen ved kapillarvirkning ind i en vækstfase matrix af perlit, vermiculit, sand eller kalcineret ler, i den øverste beholder. Kimplante (r) anbringes i væksten matrix og inokuleret med S. meliloti. Denne metode kræver ikke vanding, men undersøgelse af rødder og knuder kræver, at sætteplante fjernes fra det partikulære vækst matrix.

Der er flere metoder, der tillader let undersøgelse af roots. En af disse er den gennemsigtig plast "vækst pose" ^7.. En ulempe ved denne fremgangsmåde er, at hyppig vanding er nødvendig, da kun ≤ 10 ml flydende medium er optimal for voksende M. truncatula i poser ^7. Pouch eksperimenter er også normalt begrænset til ~ 2 uger ^7, på grund af nedbrydning af papiret væge i posen. To andre metoder, der er almindeligt anvendt svarer til vores metode i at planterne dyrkes på agar og rødderne er synlige, men disse metoder har også ulemper, at vores fremgangsmåde undgår. I disse metoder, er planter fuldstændig indeholdt i 24,5 cm x 24,5 cm agarplader forseglet omkring toppen med porøse kirurgisk tape eller dyrkes i agar-skrå rør tilproppet med bomuld stik eller plastiklåg ^7. Begge disse metoder tillader let undersøgelse af rødder og kan holdes steril. Imidlertid er de agarskråkultur rør almindeligvis dyrkes med kun 20 ml agar medium ⁷ og kræver vanding og næringsstof addition for langsigtet vækst af planter. Planter dyrket inden for de 24,5 cm x 24,5 cm agarplade mikrokosmos har tilstrækkelig fugt og næringsstoffer for vækst på lang sigt, men den voksende skyde hurtigt bliver hæmmet i den medfølgende plade mikrokosmos og ethylen gas kan opbygge hæmme rodknolddannelse ^7. I proceduren er beskrevet her, er shoot eksponeret og vokser frit udenfor mikrokosmos, der indeholder ~ 70 ml medier, så den langsigtede vækst.

Den her beskrevne fremgangsmåde kan være nyttig ikke kun for undersøgelse af rodknolddannelse i bælgplanter, men også til undersøgelse af grundlæggende fænotyper af andre mid-size planter. Forskellen mellem disse mikrokosmer og en traditionel polycarbonat plante cellekultur krukke er, at rødderne i pladen mikrokosmer beskrevet her vokse på den lodrette overflade af agar i stedet for ned i vandret lag af agar i bunden af ​​krukken. Dette gør det muligt roden til at blive løftet ud af den agaroverfladen med minimal dAmage til rodhår og minimal vedhæftning af agar til roden overflade, hvilket letter undersøgelsen af ​​rodhår ved mikroskopi.

Protocol

Udførelse af trin 1, 2, 4 og 6 i en steril laminar flow hætte anbefales. 1.. Fremstilling af M. truncatula A17 stiklinger Bemærk: M. truncatula A17 frø, der anvendes i disse undersøgelser er produceret under afkølede drivhusforhold ved ~ 22 ° C, eller i et plantevækst rum holdes ved 22-26 ° C med ~ 150-400 mmol / m -2 s -1 lys. Hæld frøspiring plader: Brug 100 mm kvadratiske plader (15 mm dyb) og hæld…

Representative Results

Forberedelsen og podning af disse plade mikrokosmos er forholdsvis enkel i forhold til de fleste andre metoder, der er beskrevet i indledningen. Brug af disse mikrokosmos tillader også forlænget plantevækst (op til 9 uger), uden vanding eller næringsstof tilskud, vedligeholdelse af rod sterilitet, både let undersøgelse af rødder og beskyttelse af rødder fra lys, uhindret vækst af planten skyder, let adgang til shoot for længde måling, og fjernelse af planter fra mikrokosmos med minimal skade på rodhår. <str…

Discussion

Der er flere trin i den protokol, som er afgørende for succes: 1) Nødvendigheden af ​​at anvende renset, plantecelle-kultur testede agar kan ikke understreges nok. Dette er ikke kritisk for lucerne planter, men det er af afgørende betydning for væksten af M. truncatula A17. 2) Det er vigtigt at spire kimplanter på lodrette agarplader som beskrevet i trin 1. Den udbredte teknik med spirende kimplanter på en inverteret vandret overflade i en 15 mm dyb tallerken ⁷ er ikke anbefales til denne p…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar purified, plant cell culture-tested	Sigma	A7921