Une seule usine, microcosmes stériles pour la nodulation et la croissance de la plante des légumineuses<em> Medicago truncatula</em> Avec le Rhizobiennes Symbiont<em> Sinorhizobium meliloti</em
Summary
Croissance des plantes de Medicago truncatula en symbiose avec la bactérie fixatrice d'azote Sinorhizobium meliloti dans des microcosmes individuels stériles fabriqués à partir de plaques de laboratoire standard permet un examen fréquent des systèmes de racines et de nodules sans compromettre la stérilité. Les plantes peuvent être maintenues dans ces chambres de croissance pour un maximum de 9 semaines.
Abstract
Bactéries rhizobium forment symbiotiques, nodules fixateurs d'azote sur les racines des légumineuses hôtes compatibles. L'un des systèmes les modèles les plus développés pour l'étude de ces interactions est la plante Medicago truncatula cv. Jemalong A17 et la bactérie rhizobium Sinorhizobium meliloti 1021. Imagerie répétée des racines des plantes et la notation des phénotypes symbiotiques exige des méthodes qui sont non destructif soit à des plantes ou des bactéries. Les phénotypes symbiotiques de certaines plantes et mutants bactériens deviennent apparents après des périodes relativement courtes de la croissance, et ne nécessitent pas d'observation à long terme de l'interaction hôte / symbiote. Cependant, des différences subtiles dans l'efficacité et la sénescence des nodosités phénotypes symbiotiques qui n'apparaissent pas dans les premiers stades du processus de nodulation nécessitent des périodes de croissance relativement longue avant de pouvoir être reçu. Plusieurs méthodes ont été développées pour la croissance à long terme et de l'observation de ce couple hôte / symbiote.Cependant, beaucoup de ces méthodes nécessitent l'arrosage répété, ce qui augmente la possibilité de contamination par d'autres microbes. D'autres méthodes nécessitent un espace relativement important pour la croissance d'un grand nombre de plantes. La méthode décrite ici, la croissance symbiotique de M. truncatula / S. meliloti dans des microcosmes seule usine stériles, présente plusieurs avantages. Plantes à ces microcosmes ont humidité et les éléments nutritifs suffisants pour assurer que l'arrosage n'est pas nécessaire pour jusqu'à 9 semaines, prévenir la contamination croisée lors de l'arrosage. Cela permet phénotypes à être quantifiés qui pourraient manquer dans les systèmes de croissance à court terme, tels que les retards subtiles dans le développement de nodules et au début de la sénescence des nodosités. En outre, les racines et les nodules dans le microcosme sont facilement visualisables à travers le couvercle de la plaque, de sorte déracinement des plantes pour l'observation n'est pas obligatoire.
Introduction
L'interaction entre la plante hôte de légumineuse Medicago truncatula A17 et la bactérie rhizobium Sinorhizobium meliloti 1021 est l'un des systèmes modèles les plus dociles de l'étude de développement des racines des nodules et symbiose fixatrice d'azote. Les génomes des deux partenaires symbiotiques ont été séquencés et 1,2 fois l'usine et de la bactérie se prêtent à la manipulation génétique 3,4. L'analyse des phénotypes de deux plantes et mutants bactériens nécessite la capacité à observer les étapes du développement de nodules et de quantifier la productivité symbiotique avec le temps. Ici, nous décrivons une méthode pour l'observation du développement de nodules de racines de M. truncatula cv. Jemalong A17 inoculées avec S. meliloti 1021 dans des microcosmes individuels fabriqués à partir de standard, diamètre rond de 100 mm, 15 mm plaques de laboratoire profondes (figure 1A). Le tournage est exposée et se développe par le biais d'un portail à encoches dans le côté de la plaque (Figures 1B, 1C, et 1E). Les racines sont contenus dans les microcosmes et maintenues stériles, tout en permettant une observation à travers le couvercle de la plaque (figure 1D). Etant donné que le tournage est accessible, sa croissance n'est pas limitée et elle peut être mesurée à des intervalles périodiques, sans compromettre la stérilité de la racine. La méthode de création de microcosmes-plaque crantée a été initialement développé par Leigh, et al. 5 pour la culture de plants de luzerne, mais il n'a pas été largement adopté en dépit de ses nombreux avantages par rapport aux autres méthodes. Une variante de cette méthode a également été développé pour l'analyse de l'interaction entre les racines des plantes et des mycorhizes 6. Nous avons maintenant conçu et optimisé cette méthode pour la croissance de M. centrales truncatula. Les avantages de ce protocole sur les plus couramment utilisés méthodes sont décrites ci-dessous.
Il existe plusieurs méthodes qui sont actuellement largement utilisés pour les études de nodulation de M. truncatula inoculationlated avec S. meliloti 7. La méthode la plus couramment utilisée pour la préparation à grande échelle de racinaires est la croissance dans des caissons aéroponique 7. Dans ce procédé, des plantes sont suspendus au-dessus d'un grand récipient et des racines sont aérées avec un mélange de S. meliloti et solution nutritive 7. Cette méthode est pratique si un seul génotype de S. meliloti est à tester. Etant donné qu'il nécessite l'aérosolisation des concentrations élevées de bactéries, il existe une forte probabilité de contamination croisée entre les caissons inoculés avec différentes souches bactériennes. Un autre procédé qui est souvent utilisé pour préparer de grandes quantités de plantes inoculées est une croissance dans des bacs ou des pots de la perlite, de la vermiculite, du sable ou de l'argile calcinée qui sont perfusée avec une solution nutritive et on l'inocule avec S. meliloti 7. Cette méthode nécessite l'utilisation de cuves ouvertes ou des pots, et nécessite un arrosage et de reconstitution de la solution nutritive. Un autre inconvénient de pots est que les plantesdoivent être retirés de cette matrice particulaire à l'examen des racines et des nodules. Un autre inconvénient de cette méthode est qu'une grande partie de l'espace de l'incubateur est nécessaire quand beaucoup différente S. génotypes meliloti sont à comparer, à cause d'un pot séparé doit être utilisé pour chaque génotype bactérien. Le "pot de Leonard" est une variante de cette méthode 8,9. Un pot Leonard est composé de deux récipients stérilisés empilés l'un au-dessus de l'autre et reliés par une mèche. Le milieu de croissance est placé dans la cuve inférieure et aspiré à travers la mèche par action capillaire dans une matrice de perlite, de la vermiculite, du sable ou de l'argile calcinée dans le récipient supérieur croissance. La plantule (s) sont placés dans la matrice de croissance et inoculées avec S. meliloti. Cette méthode ne nécessite pas d'arrosage, mais l'examen des racines et des nodules exige que la plantule être retiré de la matrice de croissance de particules.
Il existe plusieurs méthodes qui ne permettent examen facile de roots. L'un d'entre eux est la "poche de croissance" de matière plastique transparente 7. Un inconvénient de cette méthode est que l'arrosage fréquent est nécessaire étant donné que seule ≤ 10 ml de milieu liquide est optimale pour la croissance de M. truncatula dans des sachets 7. expériences de poche sont également généralement limités à ~ 2 semaines 7, suite à une panne de la mèche de papier dans la poche. Deux autres méthodes qui sont couramment utilisés sont similaires à notre méthode en ce que les plantes sont cultivées sur gélose et les racines sont visibles, mais ces méthodes ont aussi des inconvénients que notre procédure évite. Dans ces procédés, les plantes sont entièrement contenues dans 24,5 cm x 24,5 cm plaques d'agar scellés autour du sommet avec du ruban adhésif chirurgical poreux ou cultivés dans des tubes de gélose-pente bouchés avec des bouchons de coton ou de bouchons en plastique 7. Ces deux méthodes permettent examen facile des racines et peut être maintenu stérile. Cependant, les tubes inclinés d'agar-agar sont généralement cultivées avec seulement 20 ml de gélose à moyen 7 et nécessitent un arrosage et un nutrimentJOUT pour la croissance à long terme des plantes. Les plantes cultivées dans les 24,5 cm x 24,5 cm agar microcosmes de la plaque ont l'humidité et nutriments pour la croissance à long terme suffisant, mais le tournage de plus en plus devient rapidement limités dans le microcosme de la plaque ci-joint et de l'éthylène gazeux peuvent s'accumuler inhiber la nodulation 7. Dans la procédure décrite ici, le tournage est exposée et se développe librement en dehors du microcosme qui contient ~ 70 ml de milieu, permettant une croissance à long terme.
Le procédé décrit ici peut être utile non seulement pour l'étude de la nodulation de légumineuses, mais également pour l'étude des phénotypes de racines d'autres plantes de taille moyenne. La différence entre ces microcosmes et un pot traditionnel de culture tissulaire végétale de polycarbonate est que les racines dans des microcosmes de plaques décrits ici se développent sur la surface verticale de l'agar-agar, plutôt que vers le bas dans une couche horizontale de gélose au fond du pot. Cela permet à la racine de se dégager de la surface de la gélose avec un minimum dAMAGE de poils absorbants et l'adhérence de la gélose minimale à la surface de la racine, ce qui facilite l'examen de poils absorbants par microscopie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il ya plusieurs étapes du protocole qui sont essentiels pour le succès: 1) La nécessité d'utiliser, plante de culture cellulaire purifié testé agar ne peut pas être surestimée. Ce n'est pas critique pour plantules de luzerne, mais il est essentiel pour la croissance de M. truncatula A17. 2) Il est important de faire germer les semis sur des plaques d'agar vertical, comme décrit à l'étape 1. La technique largement utilisée de la germination des plants sur une surface horizontale inver…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par l'Institut national de l'USDA pour l'alimentation et l'agriculture, de l'agriculture et de l'Initiative de recherche alimentaire subvention 2010-65108 – 20582 à KMJ Nous remercions Brian K. Washburn examen critique du manuscrit.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
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