गिरहदार और फली संयंत्र के विकास के लिए एकल संयंत्र, बाँझ लघु<em> Medicago truncatula</em> Rhizobial Symbiont साथ<em> Sinorhizobium meliloti</em
Summary
मानक प्रयोगशाला प्लेटों से बना व्यक्ति, बाँझ लघु में नाइट्रोजन फिक्सिंग बैक्टीरिया Sinorhizobium meliloti साथ सहजीवन में Medicago truncatula पौधों के विकास में कोई समझौता बाँझपन बिना जड़ प्रणालियों और पिंड की लगातार परीक्षा परमिट. संयंत्र स्थापित करने के लिए 9 सप्ताह के लिए इन विकास कक्षों में रखा जा सकता है.
Abstract
Rhizobial बैक्टीरिया संगत मेजबान फली पौधों की जड़ों पर सहजीवी, नाइट्रोजन फिक्सिंग पिंड के रूप में. इन मुलाकातों के अध्ययन के लिए सबसे अच्छी तरह से विकसित मॉडल प्रणालियों में से एक है Medicago CV truncatula संयंत्र है. Jemalong A17 और rhizobial जीवाणु Sinorhizobium 1021 meliloti. पौधे की जड़ों और सहजीवी phenotypes की स्कोरिंग की दोहराया इमेजिंग पौधों या बैक्टीरिया या तो गैर विनाशकारी हैं कि तरीकों की आवश्यकता है. कुछ संयंत्र और बैक्टीरियल म्यूटेंट की सहजीवी phenotypes विकास की अपेक्षाकृत कम समय के बाद स्पष्ट हो गया है, और मेजबान / symbiont बातचीत की लंबी अवधि के अवलोकन की आवश्यकता नहीं है. वे रन बनाए जा सकते हैं हालांकि, इससे पहले गिरहदार प्रक्रिया के प्रारंभिक दौर में स्पष्ट नहीं हैं कि सहजीवी दक्षता और गुत्थी वार्धक्य phenotypes में सूक्ष्म अंतर अपेक्षाकृत लंबे समय तक विकास समय की आवश्यकता. कई तरीकों लंबी अवधि के विकास और इस मेजबान / symbiont जोड़ी के अवलोकन के लिए विकसित किया गया है.हालांकि, इन तरीकों से कई अन्य रोगाणुओं के संक्रमण की संभावना बढ़ जाती है, जो दोहराया पानी की आवश्यकता होती है. अन्य तरीकों पौधों की बड़ी संख्या के विकास के लिए एक अपेक्षाकृत बड़ी जगह की आवश्यकता होती है. विधि, यहां एम. के सहजीवी विकास वर्णित truncatula / एस बाँझ, एकल संयंत्र लघु में meliloti, कई फायदे हैं. इन लघु में पौधे कि पानी में पानी के दौरान पार संदूषण को रोकने, अप करने के लिए 9 सप्ताह के लिए आवश्यक नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त नमी और पोषक तत्वों है. इस phenotypes ऐसी गुत्थी विकास और जल्दी गुत्थी वार्धक्य में सूक्ष्म देरी के रूप में अल्पकालिक वृद्धि प्रणाली, में याद किया जा सकता है कि मात्रा निर्धारित किया जा करने की अनुमति देता है. ऊपर से पक्ष अवलोकन के लिए पौधों की आवश्यकता नहीं है तो भी, सूक्ष्म जगत में जड़ों और पिंड आसानी से, थाली ढक्कन के माध्यम से देखा जाता है.
Introduction
फली मेजबान संयंत्र Medicago truncatula A17 और Sinorhizobium 1021 meliloti rhizobial जीवाणु के बीच बातचीत जड़ गुत्थी विकास और नाइट्रोजन फिक्सिंग सहजीवन के अध्ययन के लिए सबसे विनयशील मॉडल प्रणालियों में से एक है. दोनों सहजीवी भागीदारों के जीनोम 1,2 अनुक्रम निर्धारण किया गया है और संयंत्र और जीवाणु दोनों आनुवंशिक हेरफेर 3,4 करने के लिए उत्तरदायी हैं. संयंत्र और बैक्टीरियल म्यूटेंट दोनों के phenotypes का विश्लेषण गुत्थी विकास के चरणों का पालन करने के लिए और समय के साथ सहजीवी उत्पादकता यों की क्षमता की आवश्यकता है. यहाँ हम एम. के रूट गुत्थी विकास के अवलोकन के लिए एक विधि का वर्णन CV truncatula. एस के साथ inoculated Jemalong A17 मानक, गोल 100 मिमी व्यास, 15 मिमी गहरी प्रयोगशाला प्लेट (चित्रा 1 ए) से बने व्यक्ति लघु भीतर meliloti 1021. शूटिंग के प्लेट के पक्ष में एक नोकदार पोर्टल (के माध्यम से संपर्क में है और बढ़ता है Figurतों 1 बी, 1C, और 1E). जड़ें लघु भीतर निहित और प्लेट (चित्रा -1) के ढक्कन के माध्यम से अवलोकन की अनुमति है, जबकि बाँझ रखा जाता है. शूटिंग के लिए सुलभ है, इसके विकास के लिए विवश नहीं किया जाता है और इसे जड़ से बाँझपन समझौता किए बिना आवधिक अंतराल पर मापा जा सकता है. नोकदार प्लेट लघु बनाने की विधि मूल रूप से अल्फला पौधे उगाने के लिए लेह, एट अल. 5 द्वारा विकसित किया गया था, लेकिन यह व्यापक रूप से अन्य तरीकों पर इसके कई फायदे के बावजूद नहीं अपनाया गया था. इस विधि पर एक बदलाव भी पौधे की जड़ों और mycorrhizae 6 के बीच बातचीत के विश्लेषण के लिए विकसित किया गया था. अब हम एम के विकास के लिए अनुकूल है और इस विधि अनुकूलित है truncatula पौधों. और आमतौर पर इस्तेमाल के तरीकों पर इस प्रोटोकॉल का लाभ नीचे वर्णित हैं.
एम. के गिरहदार अध्ययन के लिए व्यापक प्रयोग में है कि कई तरीके हैं truncatula inocuएस के साथ lated meliloti 7. गांठदार जड़ों की बड़े पैमाने पर तैयारी के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि aeroponic caissons 7 में वृद्धि है. इस विधि में, पौधों के एक बड़े पोत पर निलंबित कर रहे हैं और जड़ों एस का एक मिश्रण के साथ वातित कर रहे हैं meliloti और पोषक तत्व समाधान 7. इस विधि व्यावहारिक है अगर एस के ही एक जीनोटाइप meliloti परीक्षण किया जाना है. यह बैक्टीरिया की उच्च सांद्रता के aerosolization की आवश्यकता है, विभिन्न जीवाणु उपभेदों के साथ inoculated caissons के बीच पार संदूषण की प्रबल संभावना है. अक्सर टीका पौधों की बड़ी मात्रा में तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक अन्य विधि के टब या perlite, vermiculite, रेत या पोषक तत्व समाधान के साथ संचार और एस के साथ inoculated हैं कि कैलक्लाइंड मिट्टी के बर्तन में वृद्धि है meliloti 7. इस विधि खुला टब या बर्तन का उपयोग आवश्यक है, और पोषक तत्व समाधान के पानी और पुनःपूर्ति की आवश्यकता है. बर्तन का एक और नुकसान है कि पौधोंजड़ों और पिंड की परीक्षा के लिए इस कण मैट्रिक्स से हटा दिया जाना चाहिए. इस पद्धति का एक और दोष जब कई अलग अलग एस इनक्यूबेटर अंतरिक्ष के एक बड़े क्षेत्र के लिए आवश्यक है कि है meliloti जीनोटाइप एक अलग बर्तन प्रत्येक बैक्टीरियल जीनोटाइप के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, क्योंकि तुलना में किया जाना है. "लियोनार्ड जार" इस विधि 8,9 पर एक भिन्नता है. एक लियोनार्ड जार दूसरे के ऊपर एक खड़ी है और एक बाती से जुड़े दो निष्फल जहाजों से बना है. मध्यम विकास कम पोत में रखा और perlite, vermiculite, रेत या ऊपरी पोत में कैलक्लाइंड मिट्टी की वृद्धि मैट्रिक्स में केशिका क्रिया द्वारा बाती के माध्यम से तैयार किया जाता है. अंकुर (ओं) विकास मैट्रिक्स में रखा और एस के साथ inoculated हैं meliloti. इस विधि में पानी की आवश्यकता नहीं है, लेकिन जड़ों और पिंड की परीक्षा अंकुर कण विकास मैट्रिक्स से हटा दिया जाना चाहिए.
Roo के लिए आसान परीक्षा की अनुमति नहीं देते कि कई तरीके हैंटीएस. इनमें से एक पारदर्शी प्लास्टिक "विकास थैली" 7 है. इस पद्धति का एक नुकसान यह है कि लगातार पानी तरल माध्यम एम. उगाने के लिए इष्टतम है केवल ≤ 10 मिलीलीटर के बाद आवश्यक है पाउच 7 में truncatula. पाउच प्रयोगों को भी आमतौर पर कारण थैली के भीतर कागज बाती के टूटने के लिए, ~ 2 सप्ताह 7 तक सीमित हैं. आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं कि दो अन्य विधियों पौधों अगर पर हो और जड़ों दिखाई दे रहे हैं जो में हमारे विधि के समान हैं, लेकिन इन तरीकों में भी हमारे प्रक्रिया से बचा जाता है कि नुकसान है. इन तरीकों में, पौधों को पूरी तरह से 24.5 सेमी झरझरा सर्जिकल टेप के साथ ऊपर चारों ओर से सील या कपास प्लग या प्लास्टिक की टोपियां 7 के साथ stoppered अग्रवाल तिरछा ट्यूबों में उगाई X 24.5 सेमी अगर प्लेटों के भीतर समाहित कर रहे हैं. इन दोनों पद्धतियों के जड़ों की आसान परीक्षा की अनुमति और बाँझ रखा जा सकता है. हालांकि, अगर तिरछा ट्यूब आमतौर पर मध्यम 7 अगर केवल 20 मिलीग्राम के साथ बड़े हो रहे हैं और पानी और पोषक तत्व एक आवश्यकतापौधों की लंबी अवधि के विकास के लिए ddition. 24.5 सेमी भीतर बड़े पौधों 24.5 सेमी अगर प्लेट लघु पर्याप्त नमी और दीर्घकालिक विकास के लिए पोषक तत्वों है, लेकिन बढ़ती शूट जल्दी से संलग्न थाली सूक्ष्म जगत और ethylene गैस गिरहदार 7 बाधा का निर्माण कर सकते हैं के भीतर विवश हो जाता है एक्स. यहाँ वर्णित प्रक्रिया में, शूटिंग के संपर्क में है और लंबी अवधि के विकास की अनुमति, ~ मीडिया के 70 मिलीलीटर होता है जो सूक्ष्म जगत के बाहर स्वतंत्र रूप से बढ़ता है.
यहाँ वर्णित प्रक्रिया फली पौधों की गिरहदार के अध्ययन के लिए, लेकिन यह भी अन्य मध्य आकार के पौधों की जड़ phenotypes के अध्ययन के लिए न केवल उपयोगी हो सकता है. इन लघु और एक पारंपरिक पॉली कार्बोनेट संयंत्र ऊतक संस्कृति जार के बीच अंतर यहाँ वर्णित थाली लघु में जड़ें नीचे जार के तल पर अगर की एक क्षैतिज परत में अगर की ऊर्ध्वाधर सतह पर बढ़ने के बजाय है. इस रूट न्यूनतम डी के साथ अगर सतह के बंद उठाया जा करने की अनुमति देताजड़ बाल और माइक्रोस्कोपी द्वारा जड़ बाल की परीक्षा की सुविधा जो जड़ सतह, अगर की न्यूनतम आसंजन को amage.
Protocol
Representative Results
Discussion
सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं कि प्रोटोकॉल के कई चरण हैं: 1) शुद्ध, संयंत्र सेल संस्कृति का उपयोग करने की आवश्यकता अगर overemphasized नहीं किया जा सकता का परीक्षण किया. इस अल्फला seedlings के लिए महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए ब्रायन के वॉशबर्न धन्यवाद एम जे के लिए 20,582 – यह काम यूएसडीए राष्ट्रीय खाद्य एवं कृषि संस्थान, कृषि और खाद्य अनुसंधान पहल अनुदान 2,010-65,108 द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
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