Одно-растений, Стерильные Микрокосмы для нодуляции и рост бобовых растений<em> Люцерна truncatula</em> С ризобиальных симбионта<em> Sinorhizobium meliloti</em
Summary
Рост Medicago truncatula растений в симбиозе с азотфиксаторов Sinorhizobium meliloti в отдельных стерильных микрокосм, изготовленной из стандартных лабораторных пластин позволяет частое обследование корневых систем и узелков без ущерба стерильности. Растения могут быть сохранены в этих камерах роста до 9 недель.
Abstract
Ризобиальных бактерии образуют симбиотические, азотфиксирующих клубеньков на корнях совместимых хост-бобовых растений. Одним из наиболее хорошо развитых модельных систем для изучения этих взаимодействий является завод Люцерна truncatula резюме. Jemalong A17 и ризобиального бактерия Sinorhizobium meliloti 1021. Повторное изображений корней растений и забил симбиотических фенотипов требуется методы, которые неразрушающего либо к растений или бактерий. Симбиотические фенотипы некоторых основных бактериальных мутантов становятся очевидными после относительно коротких периодов роста, и не требуют долгосрочное наблюдение взаимодействия хост / симбионтов. Тем не менее, тонкие различия в симбиотических эффективности и узелок старением фенотипы, которые не видны на ранних стадиях процесса нодуляции требуют относительно длительные периоды роста, прежде чем они могут быть забил. Некоторые методы были разработаны для долгосрочного роста и наблюдения этого хоста / симбионтов пары.Тем не менее, многие из этих методов требуют неоднократного полив, что увеличивает возможность заражения другими микробами. Другие методы требуют относительно большого пространства для роста большого числа растений. Метод, описанный здесь, симбиотические рост M. truncatula / С. meliloti в стерильных, одного завода микрокосм, имеет ряд преимуществ. Растения в этих микрокосм есть достаточное количество влаги и питательных веществ для того, чтобы полив не требуется на срок до 9 недель, предотвращая перекрестного загрязнения во время полива. Это позволяет фенотипы быть количественно, которые могут быть пропущены в системах роста краткосрочных, таких как тонкие задержки в развитии конкреций и в начале конкреций старения. Кроме того, корни и узелки в микромире легко просматривать через крышку пластины, поэтому до-укоренения растений для наблюдения не требуется.
Introduction
Взаимодействие между бобовых растений-хозяев Medicago truncatula A17 и ризобиальных бактерии Sinorhizobium meliloti 1021 является одним из самых сговорчивых модельных систем для изучения развития узелков корневой и азотфиксирующего симбиоза. Геномы обоих симбиотических партнеров были последовательными 1,2 и оба завода и бактерии поддаются генетической манипуляции 3,4. Анализ фенотипов как основных бактериальных мутантов требуется способность наблюдать этапы развития узелков и количественно симбиотические производительность с течением времени. Здесь мы опишем метод для наблюдения развития клубеньковых М. truncatula резюме. Jemalong A17 инокулированные S. meliloti 1021 в рамках отдельных микрокосм, изготовленных из стандарта, круглый диаметром 100 мм, 15 мм в глубину лабораторных пластин (рис. 1А). Съемки подвергается и растет через зубчатым портала в стороне пластины (FigurES 1B, 1C и 1E). Корни содержатся в микрокосмах и выдерживают стерильный, позволяя при наблюдении через крышку пластины (фиг. 1D). Поскольку съемки доступен, его рост не ограничен и может быть измерена с периодическими интервалами без ущерба стерильность корня. Метод создания зубчатый пластинчатые микрокосм была первоначально разработана Ли и др.. 5 для выращивания растений люцерны, но она не была широко принята, несмотря на его многочисленные преимущества по сравнению с другими методами. Разновидностью этого метода была также разработана для анализа взаимодействия между корнями растений и микоризы 6. Мы теперь адаптирована и оптимизирована этот метод для роста M. truncatula растения. Преимущества этого протокола более наиболее часто используемых методов описаны ниже.
Есть несколько методов, которые в настоящее время в широком использовании для нодуляции исследований М. truncatula inoculated с S. meliloti 7. Наиболее часто используемый способ получения масштабной желвачный корней рост аэропонного кессонов 7. В этом способе растения подвешены на большой емкости и корни газированные смесью S. meliloti и питательный раствор 7. Этот способ является практичным, если только один генотип С. meliloti для которого требуется проверить. Так как это требует аэрозолизации высоких концентраций бактерий, существует высокая вероятность перекрестного загрязнения между кессонов, привитых различных бактериальных штаммов. Другой метод, который часто используется для подготовки большого количества привитых растений является рост в кадках или горшках перлит, вермикулит, песок или кальцинированной глины, которые переплетаются с питательным раствором и инокулированного S. meliloti 7. Этот метод требует использования открытых ваннах или горшках, и требует полива и пополнение питательного раствора. Другим недостатком является то, что горшках растениядолжны быть удалены из этой матрицы макрочастиц для изучения корней и узелков. Другой недостаток этого метода в том, что большая площадь инкубатора пространства требуется при многих различных С. meliloti генотипы должны быть сравнены, потому отдельный горшок должен быть использован для каждого бактериального генотипа. "Леонард банку" является вариацией на этом методе 8,9. Леонард сосуд состоит из двух стерилизованных сосудах уложенных один поверх другого и соединенных фитиль. Среда роста помещается в нижней емкости и втягивается через фитиль под действием капиллярных сил в матрицу роста перлит, вермикулит, песок или прокаленной глины в верхней судна. Рассада (ы) размещаются в матрице роста и инокулировали S. meliloti. Этот метод не требует полива, но исследование корней и узелков требует, чтобы саженец быть удалены из матрицы роста частиц.
Есть несколько методов, которые позволяют легко экспертизу кенгуруц. Одним из них является прозрачным "мешочек рост" пластик 7. Недостатком этого метода является то, что частый полив требуется, так как только ≤ 10 мл жидкой среды является оптимальным для выращивания М. truncatula в мешочках 7. Чехол эксперименты также обычно ограничивается ~ 2 недели 7, в связи с распадом бумаги фитиль в сумке. Два других методов, которые обычно используются похожи на нашего метода в том, что растения, выращенные на агаре и корни видны, но эти способы также имеют недостатки, что наша процедура позволяет избежать. В этих способах растения полностью содержится в пределах 24,5 см х 24,5 см чашках с агаром запечатанных вокруг верхней части с пористой или хирургической лентой, выращенные в агар-уклон труб закрывали пробками хлопка или пластмассовыми крышками 7. Оба этих метода позволяют легко Анализ корней и может быть стерильными. Тем не менее, скошенного агара трубки обычно выращивают только с 20 мл агаровой среде 7 и требуют полива и питательных веществddition для долгосрочного роста растений. Растения, выращенные в пределах 24,5 см х 24,5 см агаром микрокосм есть достаточное количество влаги и питательных веществ для долгосрочного роста, но растет стрелять быстро становится скованным в закрытых пластина микрокосм и газообразный этилен может создать ингибирования нодуляции 7. В процедуре, описанной здесь, стрелять подвергается и растет свободно вне микромира, которая содержит ~ 70 мл средства массовой информации, что позволяет долгосрочного роста.
Процедура, описанная здесь может быть полезен не только для изучения клубеньков бобовых растений, но и для изучения корневых фенотипов других среднего размера растений. Разница между этими микрокосмах и традиционный поликарбонат растительной ткани-культуры в том, что банку корни в пластине микрокосмах описанных здесь расти на вертикальной поверхности агара, а не вниз в горизонтальном слое агара в нижней части банки. Это позволяет корневой быть отходит от поверхности агара с минимальной DAmage для корневых волосков и минимальной адгезией агара к поверхности корня, что облегчает изучение корневых волосков с помощью микроскопа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько шагов, протокола, которые имеют решающее для успеха: 1) Необходимость использования очищенной, завод клеточной культуры проходят агар не может быть переоценена. Это не является критическим для проростков люцерны, но это имеет решающее значение для роста M. truncatula A17. 2) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась по USDA Национального института сельского хозяйства и продовольствия, сельского хозяйства и исследовательской инициативы Еда гранта 2010-65108 – 20582 в KMJ Мы благодарим Брайан К. Washburn для критического обзора рукописи.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
References
- Galibert, F., et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 293, 668-672 (2001).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520-524 (2011).
- Glazebrook, J., Walker, G. C. Genetic techniques in Rhizobium meliloti. Methods Enzymol. 204, 398-418 (1991).
- Cheng, X., Wen, J., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K. S. Reverse genetics in medicago truncatula using Tnt1 insertion mutants. Methods Mol Biol. 678, 179-190 (2011).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6231-6235 (1985).
- Wong, K. K. Y., Fortin, J. A. A Petri Dish Technique for the Aseptic Synthesis of Ectomycorrhizae. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 67, 1713-1716 (1989).
- Barker, D. G., Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W., et al. . The Medicago truncatula handbook. , (2006).
- Leonard, L. T. A Simple Assembly for Use in the Testing of Cultures of Rhizobia. J Bacteriol. 45, 523-527 (1943).
- Trung, B. C., Yoshida, S. Improvement of Leonard jar assembly for screening of effective rhizobium. Soil Sci Plant Nutr. 29, 97-100 (1983).
- Penmetsa, R. V., Cook, D. R. Production and characterization of diverse developmental mutants of Medicago truncatula. Plant Physiol. 123, 1387-1398 (2000).
- Garcia, J., Barker, D. G., Journet, E. P., Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. . The Medicago truncatula handbook. , (2006).
- Vincent, J. M. . A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria. , (1970).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).
- Pladys, D., Vance, C. P. Proteolysis during Development and Senescence of Effective and Plant Gene-Controlled Ineffective Alfalfa Nodules. Plant Physiology. 103, 379-384 (1993).
- Vasse, J., de Billy, F., Truchet, G. Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction. The Plant J. 4, 555-566 (1993).
- Johnson, L. E. B., Vance, C. P. Histological and Biochemical Comparisons of Plant Induced Ineffective Nodules. Phytopathology. 71, 884 (1981).
- Vance, C. P., Johnson, L. E. B., Hardarson, G. Histological Comparisons of Plant and Rhizobium Induced Ineffective Nodules in Alfalfa. Physiological Plant Pathology. 17, 167 (1980).
- Van de Velde, W., et al. Aging in legume symbiosis. A molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula. Plant Physiol. 141, 711-720 (2006).
- Jones, K. M. Increased production of the exopolysaccharide succinoglycan enhances Sinorhizobium meliloti 1021 symbiosis with the host plant Medicago truncatula. J Bacteriol. 194, 4322-4331 (2012).
- Queiroux, C., et al. A comparative genomics screen identifies a Sinorhizobium meliloti 1021 sodM-like gene strongly expressed within host plant nodules. BMC Microbiol. 12, 74 (2012).
