Single-plantas, Microcosmos estériles para nodulación y el crecimiento de la planta de la legumbre<em> Medicago truncatula</em> Con el Rhizobial Symbiont<em> Sinorhizobium meliloti</em
Summary
Crecimiento de las plantas de Medicago truncatula en simbiosis con las bacterias que fijan el nitrógeno Sinorhizobium meliloti, en microcosmos estériles individuales a partir de placas estándar de laboratorio permite el examen frecuente de sistemas de raíces y nódulos sin comprometer la esterilidad. Las plantas pueden ser mantenidas en estas cámaras de crecimiento de hasta 9 semanas.
Abstract
Rizobios forman nódulos simbióticos, que fijan el nitrógeno en las raíces de plantas leguminosas huésped compatibles. Uno de los sistemas modelo más bien desarrollados para el estudio de estas interacciones es la planta Medicago truncatula cv. Jemalong A17 y la bacteria rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021. Proyección de imagen repetida de raíces de las plantas y de puntuación de fenotipos simbióticas requiere métodos que son no destructivos para plantas o bacterias. Los fenotipos simbióticas de alguna planta y los mutantes de bacterias se hacen evidentes después de períodos relativamente cortos de crecimiento, y no requieren de la observación a largo plazo de la interacción huésped / simbionte. Sin embargo, las diferencias sutiles en la eficiencia y la senescencia nódulo fenotipos simbióticas que no son aparentes en las primeras etapas del proceso de nodulación requieren períodos de crecimiento relativamente largos antes de que puedan ser marcados. Varios métodos han sido desarrollados para el crecimiento y la observación de este par huésped / simbionte a largo plazo.Sin embargo, muchos de estos métodos requieren riego repetida, lo que aumenta la posibilidad de contaminación por otros microbios. Otros métodos requieren un espacio relativamente grande para el crecimiento de un gran número de plantas. El método descrito aquí, el crecimiento simbiótica de M. truncatula / S. meliloti, en microcosmos de una sola planta estéril, tiene varias ventajas. Las plantas en estos microcosmos tienen humedad y los nutrientes suficientes para garantizar que el riego no se requiere para hasta 9 semanas, evitando la contaminación cruzada durante el riego. Esto permite que los fenotipos que se deben cuantificar que pueden perderse en los sistemas de crecimiento a corto plazo, tales como retrasos sutiles en el desarrollo de nódulos y la senescencia nódulo temprano. Además, las raíces y nódulos en el microcosmos se ven fácilmente a través de la tapa de la placa, por lo que no se requiere up-enraizamiento de las plantas para la observación.
Introduction
La interacción entre la planta huésped leguminosa Medicago truncatula A17 y la bacteria rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021 es uno de los sistemas modelo más manejables para el estudio del desarrollo de nódulos de la raíz y la simbiosis fijadora de nitrógeno. Los genomas de ambos socios simbióticas se han secuenciado 1,2 y tanto la planta y bacteria son susceptibles de 3,4 manipulación genética. El análisis de los fenotipos de ambas plantas y mutantes bacterianas requiere la capacidad de observar las etapas del desarrollo de nódulos y para cuantificar la productividad simbiótica con el tiempo. Aquí se describe un método para la observación del desarrollo de nódulos de la raíz de M. truncatula cv. Jemalong A17 inoculados con S. meliloti 1021 dentro de microcosmos individuales hechas de estándar, redondo 100 mm de diámetro, 15 mm placas de laboratorio profundas (Figura 1A). El rodaje está expuesto y crece a través de un portal de muescas en el lado de la placa (FigurES 1B, 1C, y 1E). Las raíces están contenidos dentro de los microcosmos y mantenerse estéril, al tiempo que permite la observación a través de la tapa de la placa (Figura 1D). Desde el rodaje es accesible, su crecimiento no está limitado y se puede medir a intervalos periódicos sin comprometer la esterilidad de la raíz. El método de creación de microcosmos-de la placa con muescas fue desarrollado originalmente por Leigh, et al. 5 para el cultivo de plantas de alfalfa, pero no fue ampliamente adoptado a pesar de sus muchas ventajas sobre otros métodos. Una variación de este método también fue desarrollado para el análisis de la interacción entre raíces de las plantas y las micorrizas 6. Ahora hemos adaptado y optimizado este método para el crecimiento de M. plantas truncatula. Las ventajas de este protocolo más utilizado más comúnmente métodos se describen a continuación.
Hay varios métodos que están actualmente en uso amplio para los estudios de nodulación de M. truncatula inoculaciónLated con S. meliloti 7. El método más comúnmente utilizado para la preparación a gran escala de las raíces noduladas es el crecimiento en cajones aeropónicos 7. En este método, las plantas se suspenden en un recipiente grande y las raíces se aireó con una mezcla de S. meliloti y solución nutriente 7. Este método es práctico si sólo un genotipo de S. meliloti es hacerse la prueba. Ya que requiere la aerosolización de altas concentraciones de bacterias, hay una alta probabilidad de contaminación cruzada entre cajones inoculados con diferentes cepas bacterianas. Otro método que se utiliza a menudo para preparar grandes cantidades de plantas inoculadas es el crecimiento en las tinas o recipientes de perlita, vermiculita, arena o arcilla calcinada que se infunde con solución nutritiva y se inoculó con S. meliloti 7. Este método requiere el uso de bañeras o macetas abiertas, y requiere de riego y la reposición de la solución de nutrientes. Otra desventaja de macetas es que las plantasdebe ser eliminado de esta matriz de partículas para el examen de las raíces y nódulos. Otro inconveniente de este método es que se requiere una gran área de espacio de la incubadora cuando muchos diferente S. genotipos meliloti se han de comparar, debido a una olla separada debe ser utilizado para cada genotipo bacteriano. El "tarro Leonard" es una variación de este método 8,9. Un tarro de Leonard se compone de dos vasos esterilizados apiladas una encima de la otra y conectadas por una mecha. El medio de crecimiento se coloca en el recipiente inferior y arrastrado a través de la mecha por acción capilar en una matriz de crecimiento de perlita, vermiculita, arena o arcilla calcinada en el recipiente superior. La plántula (s) se colocan en la matriz de crecimiento y se inoculó con S. meliloti. Este método no requiere de riego, pero el examen de las raíces y nódulos requiere que la plántula se retira de la matriz de crecimiento de partículas.
Hay varios métodos que permiten la fácil exploración de roots. Uno de ellos es la "bolsa de crecimiento" de plástico transparente 7. Una desventaja de este método es que se requiere el riego frecuente ya que sólo ≤ 10 ml de medio líquido es óptima para el cultivo de M. truncatula en bolsas de 7. Experimentos bolsa también se limitan generalmente a ~ 2 semanas 7, debido a la ruptura de la mecha de papel dentro de la bolsa. Otros dos métodos que se utilizan comúnmente son similares a nuestro método en el que las plantas se cultivan en agar y las raíces son visibles, pero estos métodos también tienen desventajas que nuestro procedimiento evita. En estos métodos, las plantas están completamente contenidos dentro de 24.5 cm x 24.5 cm de placas de agar sellados alrededor de la parte superior con cinta quirúrgica porosa o cultivadas en tubos de agar inclinado con tapón con tapones de algodón o tapas de plástico 7. Ambos de estos métodos permiten fácil examen de las raíces y se puede mantener estéril. Sin embargo, los tubos inclinados de agar se crecen generalmente con sólo 20 ml de agar de medio 7 y requieren de riego y de nutrientes de unaddition para el crecimiento a largo plazo de las plantas. Las plantas que crecen dentro de los 24.5 cm x 24.5 cm de agar microcosmos placas tienen humedad y nutrientes para el crecimiento a largo plazo suficiente, pero el rodaje creciendo rápidamente se convierte constreñidos dentro del microcosmos placa cerrada y el gas etileno pueden acumularse inhibición de la nodulación 7. En el procedimiento que se describe aquí, la sesión se expone y crece libremente fuera del microcosmos que contiene ~ 70 ml de los medios de comunicación, lo que permite el crecimiento a largo plazo.
El procedimiento descrito aquí puede ser útil no sólo para el estudio de la nodulación de plantas leguminosas, pero también para el estudio de los fenotipos de las raíces de otras plantas de tamaño medio. La diferencia entre estos microcosmos y una planta de policarbonato de cultivo de tejidos tarro tradicional es que las raíces en los microcosmos de la placa descritas aquí crecen en la superficie vertical del agar en lugar de hacia abajo en una capa horizontal de agar en la parte inferior de la jarra. Esto permite que la raíz que se despegó de la superficie de agar con un mínimo de dAmage a pelos de la raíz y una adhesión mínima de agar a la superficie de la raíz, lo que facilita el examen de los pelos radicales por microscopía.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios pasos del protocolo que son críticos para el éxito: 1) La necesidad de utilizar, planta de cultivo celular purificada probado agar no se puede exagerar. Esto no es crítico para las plántulas de alfalfa, pero es crítico para el crecimiento de M. truncatula A17. 2) Es importante para germinar las plantas de semillero en placas de agar verticales como se describe en el Paso 1. La técnica ampliamente utilizada de la germinación de plántulas en una superficie horizontal invertida en un plato hondo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de USDA para la Agricultura y la Alimentación, la Agricultura y la Iniciativa de Investigación de Alimentos de subvención 2010-65.108 – 20.582 a KMJ Agradecemos Brian K. Washburn para la revisión crítica del manuscrito.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
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