中心体蛋白的果蝇中精子成像是一种功能强大的方法来识别中心体生物学重要的新蛋白质以及阐明已知的玩家在这个过程中的特定功能。
中心体是保守的基于微管的细胞器,其结构和功能的变化显着地在整个细胞周期和细胞分化。中心体是必不可少的有丝分裂过程中,以确定细胞分裂轴和间期成核纤毛。介导这些动态变化的蛋白质的身份仍只是部分已知的,并且许多已牵涉在这些过程中的蛋白质的功能仍是基本的。最近的研究表明, 果蝇精子发生过程提供了一个强大的系统,以确定中心体的功能和形成的关键新的蛋白质,以及深入了解已知的球员 在中心体有关的过程的特定功能。 果蝇是一个既定的遗传模型有机体突变的地方在中心体的基因可以很容易地获得和容易地进行分析。此外,在光学显微镜的灵敏度和分辨率的最新进展和健壮的遗传标记的中心体标记的发展已经改变了使用果蝇睾丸作为一种简单方便的模型系统,研究中心体的能力。本文介绍了利用遗传标记的中心体标记为新的中心体突变体进行遗传筛选,并深入了解新发现的基因的具体功能。
果蝇睾丸是一个合适的器官系统来研究各种细胞和发育过程,并进行了审查,多年来1-9广泛。这篇稿子的重点是利用果蝇睾丸学习中心体,一个保守的细胞器。如在其它系统中,在有丝分裂,减数分裂,并ciliogenesis 10 果蝇睾丸功能的中心体。中心体是由一对被称为中心粒由称为pericentriolar材料(PCM)的复杂蛋白质网络包围的微管为基础的结构中的。中心粒对由高龄产妇中心粒和小女儿中心粒的。随着细胞的进行对有丝分裂,无论是中心粒分离,复制,并获得了大量的PCM,最终形成两种截然不同的中心体。包含原始母中心粒的中心体被称为母中心体和离心泵含原子中心粒osome被称为子中心体。
果蝇睾丸是理想的学习中心体生物学的分子基础,荧光显微镜用于各种原因。
一起, 果蝇睾丸的上述特性提供了其中中心体可以通过简便,快速,和详细的成像进行研究的模型。所描述的技术在本文中已被应用到调查中心体生物学的许多方面,包括中心粒形成11,中心粒复制15,PCM招募16,中心体17调节,并ciliogenesis 18。这些技术也被应用到研究中心体在生物学的其他领域,如减数分裂第19,主轴组件20,而在非对称干细胞分裂21在许多其他中心体的活动。
成像在中心体开始与苍蝇获得表达基因标记的中心体蛋白和隔离从雄性幼虫,蛹或成蝇睾丸睾丸。这些苍蝇都可以从几个研究小组1,11,15,22-25。幼虫睾丸生精功能包含前减数分裂各阶段和分析突变是致死的蛹或成人时是有用的。然而,后期蛹或年轻的阿杜LT睾丸最健壮和含有精子发生的所有预处理和后减数分裂的阶段,从而使它们优选用于分析。由于精子细胞的数量会随着年龄的苍蝇,使用成年睾丸也适合研究中心体在老化26的上下文中。从成蝇睾丸分离法已如前所述27。
可以通过在此处( 图3)提出了三个相关的轨道实现中心体和它们在果蝇睾丸功能成像。选择哪一个磁道是最合适的是依赖于问题的研究者正在处理的性质。
跟踪A涉及现场睾丸成像。它是最快速的三个磁道,但只能应用时试样不需要予以保留,并进行免疫染色时是不需要的。在课程A,睾丸安装(完好,刺穿或切割)在载玻片上和下一个盖玻片小心压扁以形成易于识别的细胞单层。然后将细胞同时使用相位对比显微镜和荧光显微镜观察。使用相衬是果蝇睾丸的分析特别重要,因为它表明,不与其他形式的透射照明的可见光,从而允许快速识别精子发育28,29的各阶段的细胞的信息。然而,轨道A有两个主要的缺点。首先,细胞的形态学完整性常常受到损害一旦睾丸破裂。第二,未定影的细胞有时移动样品内,使得在指定的区域内难以多个共焦层的成像。促进特定细胞类型的分析,睾丸可刺穿或切割,以直接的方式,睾丸破裂,使得下盖玻片最低限度地影响挤压感兴趣的细胞类型的形态。
通道B涉及睾丸化学固定。这条赛道需要的时间,样品制备的中间量,并且具有固定的标本可以保存供以后分析的优势。此外,固定供应,使细胞结构更坚固,在成像过程中最大限度地减少样品的运动。然而,相衬显微术变得非常少翔实化学固定后,使精子发育难以识别的某些阶段。
轨道C是最耗时的,但有额外的好处,细胞结构是固定的免疫染色,允许蛋白质,是无法用适当的遗传学标记的可视化。有用于免疫染色中心体和中心体有关的结构在果蝇精巢提供许多抗体两种商业和来自不同研究组。
研究中心体生物学中使用基因标记的中心体标志物蝇睾丸是用于评估在两个野生型和突变型的上下文中心体功能和活性的有效方法。特别是,跟踪A是适合于中心体异常,如畸形,misegregation,不稳定,或在努力寻找新的异常突变体长度的快速筛查。此外,在现场准备精子细胞的纤毛运动型保持解剖后约15分钟,并在通道A中使用活的睾丸也允许精子活力可以很容易地解决。由于精子运动纤毛的活性直接相关,中心体功能,测定可以被执行以确定对纤毛功能的各种中心体的突变的影响。跟踪B可用于特别是当统计数据是必需的,例如,用于计数每个细胞和或每囊肿细胞的数目中心粒的数目更具体的观测。轨道C是最useful对于需要染色的抗体详细的观察。实例包括特定的细胞类型,例如干细胞,不具有可用的标签,例如微管蛋白乙酰化,或者验证一个蛋白质中的突变的缺失或错误定位的蛋白质染色的标记。
当成像中心体和中心体有关的结构,使用基因标记的标记物,而不是抗体不仅实验更容易,而且提供了更可靠的和可重现的结果。因此,利用基因标记的中心体蛋白的是,需要一个大的数据集机械和定量分析的可靠方法。例如,使用基因标记的中心体标志物一直是中心粒长度的量化特别有价值。这样的分析表明,各突变可以根据在中心粒的长度的可变性可以分为两类。一类包括基因突变,陈GE中心粒的长度,但不影响标准偏差为1,而另一类别包括同时影响中心粒长度和长度为11的标准偏差的突变。这种定量的数据可以提供有用的洞察特定的中心体基因的功能。表现出与增加的标准偏差有缺陷的中心粒长度的中心体的突变体可能是由于中心粒结构的不稳定。然而,有缺陷的中心粒长度与正常标准错误可能表明该突变不会在结构上不稳定的中心粒和更可能是由于在调节机制控制中心粒的长度的变化。由于染色的不一致性,定量分析是很难与使用抗体标记孤单。
中心体是一个大型的,复杂的蛋白质结构和它的许多蛋白质仅在其内部找到。使用基因标记的中心体而标记的抗体允许一个统一标记的抗原决定簇可能是其它方法无法抗体标记的中心体的内部组件。例如,使用抗体BLD10的定位研究发现该蛋白在中心粒13的远端和近端富集,而BLD10-GFP显示了更均匀的分布1。但是,同样重要的是考虑一个特定的遗传标记的蛋白质的表达水平,因为这会影响蛋白质的分布。 SAS-4-GFP和SAS-6-GFP的定位在其内源性表达被限制在中心粒1,16,35的近端另一方面,SAS-4-GFP和SAS-6-GFP下的表达强大的泛素启动子沿的中心粒12,14的整个长度本地化。另一个重要的考虑是对蛋白质功能的遗传标记的效果。如果基因标记的蛋白质是功能分析可以工商业污水附加费特德通过引入转基因蛋白进入一个突变的背景和检查,如果转基因蛋白抢救突变表型。
可以使用各种化学固定剂来进行果蝇睾丸固定。在这里,我们描述了与两个甲醛(轨迹B)和甲醇 – 丙酮(课程C)固定。然而,无论是固定剂可以互换使用,并且由于各种固定剂可以化学破坏天然抗体的表位,适当的固定剂对免疫染色的选择必须通过实验确定。下面的固定剂和培养条件,通常采用:3.7%甲醛,5分钟,在室温下的甲醇,15分钟,在-20℃;丙酮,10分钟,在-20℃;甲醇,15分钟,于-20℃。接着用丙酮,30秒,在-20℃;乙醇,20分钟,于-20℃下虽然固定用丙酮,甲醇,乙醇和不需要对免疫染色,固定无线网络的扩展透化步骤第甲醛时,应遵循由1小时温育在PBST-B在室温下透化细胞膜,允许抗体进入细胞内的抗原决定簇。此外,某些固定剂更适合于特定的抗原。例如,甲醛的功能以及用于小蛋白的固定,而甲醇和丙酮是非常适合的大分子复合物36的固定。
果蝇睾丸的免疫染色也观察染色质结构和微管骨架29,37已如前所述。这里(课程C),程序已被优化,含有基因标记的中心体蛋白质结构的分析。我们提供这个程序来指导个人谁是经验不足在果蝇精巢工作的详细说明。此过程还包括修改通过使用s到改善睾丸,如保存和形态学iliconized盖玻片和带正电的显微镜玻片上。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由一个赠款(R01GM098394)由美国国立卫生研究院和国家普通医学科学研究所以及发放1121176从美国国家科学基金会的支持。
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
18×18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |