Obtención de imágenes de las proteínas de Drosophila centrosomales durante la espermatogénesis es un método poderoso para identificar nuevas proteínas críticas para la biología del centrosoma, así como para dilucidar la función particular de los jugadores conocidos en este proceso.
Los centrosomas se conservan orgánulos a base de microtúbulos cuya estructura y el cambio de forma espectacular durante todo el ciclo celular y la diferenciación celular de función. Los centrosomas son esenciales para determinar el eje de la división celular durante la mitosis y para nuclear cilios durante la interfase. La identidad de las proteínas que median estos cambios dinámicos sigue siendo sólo parcialmente conocida, y la función de muchas de las proteínas que han sido implicados en estos procesos es todavía rudimentaria. Trabajos recientes han demostrado que la Drosophila espermatogénesis proporciona un sistema eficaz para identificar nuevas proteínas críticas para la función del centrosoma y la formación, así como para comprender mejor la función particular de los jugadores conocidos en los procesos relacionados con el centrosoma. Drosophila es un organismo establecido modelo genético donde los mutantes en los genes centrosomales se pueden obtener fácilmente y analizar fácilmente. Por otra parte, los recientes avances en la sensibilidad y la resolución de la microscopía de luz y ladesarrollo de robustos marcadores centrosomales etiquetados genéticamente han transformado la capacidad de utilizar testículos de Drosophila como un sistema de modelo simple y accesible para estudiar los centrosomas. Este artículo describe el uso de marcadores centrosomal genéticamente etiquetados-para realizar cribados genéticos para los nuevos mutantes centrosomal y para obtener una perspectiva de la función específica de los genes recientemente identificados.
Testículos de Drosophila son un sistema de órgano adecuado para estudiar una variedad de procesos celulares y de desarrollo y se han revisado ampliamente en los años 1-9. Este manuscrito se centra en el uso de los testículos de Drosophila para estudiar el centrosoma, un orgánulo celular conservada. Al igual que en otros sistemas, el centrosoma de los testículos función de Drosophila en la mitosis, meiosis, y ciliogenesis 10. Los centrosomas se componen de un par de estructuras a base de microtúbulos conocidos como centriolos rodeados por una red compleja de proteínas que se refiere al material como pericentriolar (PCM). El par de centríolos se compone de un centríolo madre mayor y un centríolo hija menor. A medida que la célula progresa hacia la mitosis, ambos centriolos se separan, por duplicado, y adquirir una gran cantidad de PCM que finalmente forman dos centrosomas distintas. El centrosoma que contiene el centríolo madre original se conoce como el centrosoma madre y el CentrOsome que contiene el centríolo hija original se conoce como el centrosoma hija.
Testículos de Drosophila son ideales para el estudio de las bases moleculares de la biología del centrosoma por microscopía de fluorescencia para una variedad de razones.
En conjunto, las características arriba indicadas de Drosophila testículos proporciona un modelo en el que el centrosoma se puede estudiar por imágenes de fácil, rápida y detallada. Las técnicas descritasen este trabajo se han aplicado a investigar muchos aspectos de la biología del centrosoma, incluyendo la formación centríolo 11, duplicación centríolo 15, el reclutamiento PCM 16, regulación centrosoma 17 y ciliogenesis 18. Estas técnicas también se han aplicado para estudiar el centrosoma en otras áreas de la biología, tales como la regulación meiótica 19, conjunto de husillo 20, y la actividad del centrosoma en la división de células madre asimétrica 21 entre muchos otros.
Imágenes de los testículos en los arranques centrosoma con la obtención de las moscas que expresan proteínas centrosomal genéticamente etiquetados y aislar los testículos de larvas macho, pupas o moscas adultas. Estas moscas son disponibles a partir de varios grupos de investigación 1,11,15,22-25. Los testículos contienen larvas de todas las etapas de la espermatogénesis antes de la meiosis y son útiles en el análisis de las mutaciones que son letales en la pupa o adulto. Sin embargo, pupa Tarde o jóvenes adult testículos son las más robustas y contienen todos los pre-y post-meióticas etapas de la espermatogénesis, con lo que serían preferibles para su análisis. Dado que el número de células de esperma disminuye a medida que las edades de la mosca, el uso de los testículos adultos también es apropiado para el estudio de la centrosoma en el contexto del envejecimiento. 26. Un método de aislamiento testículo de moscas adultas se ha descrito previamente 27.
Imágenes de centrosomas y su función en los testículos de Drosophila se puede lograr a través de tres vías relacionadas que se presentan aquí (Figura 3). La selección de la pista que es el más apropiado depende de la naturaleza de la pregunta del investigador está abordando.
Track A implica imágenes de los testículos en vivo. Es el más rápido de los tres temas, pero sólo se puede aplicar cuando las muestras no necesitan ser preservados y no es necesario si la inmunotinción. En la pista A, los testículos están montados (intacta, traspasado o corte) en las diapositivasy cuidadosamente aplastado bajo un cubreobjetos para formar una sola capa de células fácilmente identificables. Las células se visualizaron utilizando tanto microscopía de contraste de fases y microscopía de fluorescencia. El uso de contraste de fase es particularmente importante para el análisis de los testículos de Drosophila porque revela información celular que no es visible con otras formas de iluminación transmitida y por lo tanto permite la identificación rápida de diferentes etapas de desarrollo de los espermatozoides 28,29. Sin embargo, la pista A tiene dos desventajas principales. En primer lugar, la integridad morfológica de las células se compromete a menudo una vez se rompen los testículos. En segundo lugar, las células no fijadas a veces se mueven dentro de la muestra, por lo que la obtención de imágenes de múltiples capas confocal dentro de una región determinada difícil. Para promover el análisis de tipos de células específicas, testículos pueden ser perforados o cortados con el fin de dirigir la forma en que las rupturas de testículo de tal modo que el aplastamiento bajo el cubreobjetos mínimamente afecta a la morfología del tipo celular de interés.
Track B implica la fijación química de los testículos. Esta pista requiere una cantidad intermedia de tiempo para la preparación de la muestra y tiene la ventaja de que las muestras fijadas se pueden guardar para su posterior análisis. Además, la fijación sirve para hacer estructuras celulares más rígida, lo que minimiza el movimiento de la muestra durante la formación de imágenes. Sin embargo, la microscopía de contraste de fase se convierte en mucho menos informativo después de la fijación química, por lo que algunas etapas de desarrollo difíciles de identificar espermatozoides.
Pista C es la más intensiva de tiempo, pero tiene la ventaja añadida de que las estructuras celulares son fijos y inmunotiñeron, lo que permite la visualización de las proteínas que no están disponibles con las etiquetas de genética apropiadas. Hay muchos anticuerpos disponibles comercialmente y de varios grupos de investigación para la inmunotinción centrosomas y estructuras relacionadas centrosoma en los testículos de Drosophila.
El estudio de la biología del centrosoma en los testículos de la mosca utilizando marcadores centrosomal genéticamente etiquetados-es un método útil para evaluar la función y la actividad del centrosoma en un contexto tanto de tipo salvaje y mutante. En particular, pista A es adecuado para la detección rápida de anomalías centrosomales tales como malformación, misegregation, inestabilidad, o la longitud anormal en un esfuerzo para identificar nuevos mutantes. Además, los cilios espermátide en preparaciones en vivo conservaron la movilidad durante aproximadamente 15 min después de la disección y el uso de los testículos en vivo en la canción A también permite la motilidad de los espermatozoides para ser fácilmente dirigida. Dado que la actividad de los espermatozoides cilios móviles está directamente relacionada con la función del centrosoma, ensayos se pueden realizar para determinar los efectos de diversas mutaciones centrosomales sobre la función ciliar. Pista B se puede utilizar para las observaciones más específicas, especialmente cuando se necesitan datos estadísticos tales como para contar el número de centríolos por célula y o el número de células por quiste. Track C es más useful para observaciones detalladas que requieren tinción con anticuerpos. Los ejemplos incluyen el etiquetado de un determinado tipo de células, como las células madre, la tinción de una proteína que no tiene una etiqueta disponible, como la tubulina acetilada, o para comprobar la ausencia o mislocalization de una proteína en un mutante.
Al obtener imágenes centrosomas y estructuras relacionadas centrosoma, utilizando marcadores genéticamente con etiquetas en lugar de anticuerpos no sólo experimentalmente más fácil, pero también proporciona resultados más robustos y reproducibles. Por lo tanto, el uso de proteínas centrosomal genéticamente etiquetados-es un enfoque fiables para los análisis mecanicistas y cuantitativos que requieren un conjunto de datos de gran tamaño. Por ejemplo, el uso de marcadores centrosomales genéticamente etiquetados-ha sido particularmente valiosa para la cuantificación de la longitud del centríolos. Este análisis ha puesto de manifiesto que diversas mutaciones se pueden clasificar en dos categorías basadas en la variabilidad de longitud centríolos. Una categoría incluye mutaciones que ChanGE longitud centriolo pero no afectan a la desviación estándar 1 y la otra categoría incluye mutaciones que afectan tanto a la longitud centriolo y la desviación estándar de longitud 11. Tales datos cuantitativos pueden proporcionar información útil sobre la función de genes particulares centrosomal. Centrosomales mutantes que exhiben longitud centriolo defectuoso con un aumento en la desviación estándar puede ser debido a una desestabilización de la estructura centriolar. Sin embargo, la longitud centriolo defectuoso con un error estándar normal puede indicar que la mutación no desestabiliza el centriolo estructuralmente y es más probable que sea debido a un cambio en el mecanismo de regulación que controla la longitud centríolos. Debido a las inconsistencias en la inmunotinción, análisis cuantitativos son difíciles con el uso de marcadores de anticuerpos solo.
El centrosoma es una estructura proteica grande, compleja y muchas de sus proteínas sólo se encuentran en su interior. Usando centrosomal genéticamente con etiquetasmarcadores más bien los anticuerpos permite a uno para etiquetar consistentemente componentes internos del centrosoma cuyos epítopos pueden ser de otra manera inaccesibles para los marcadores de anticuerpos. Por ejemplo, los estudios de localización de BLD10 utilizando anticuerpos encuentra la proteína a ser enriquecido en los extremos distal y proximal de la centriolo 13, mientras que BLD10-GFP muestra una distribución más uniforme 1. Sin embargo, también es importante considerar el nivel de expresión de una proteína genéticamente-etiquetados en particular, ya que esto puede afectar a la distribución de proteínas. La localización de Sas-4-GFP y SAS-6-GFP expresada bajo su endógena se limita a los extremos proximales de la centriolo 1,16,35 Por otro lado, Sas-4-GFP y SAS-6-GFP expresado bajo el fuerte promotor de la ubiquitina se localizan a lo largo de toda la longitud de la centriolo 12,14. Otra consideración importante es el efecto de la etiqueta genética en función de la proteína. Analizar si las proteínas genéticamente etiquetados-son funcionales puede ser tested mediante la introducción de la proteína transgénica en un mutante de fondo y examinar si la proteína transgénica rescata el fenotipo mutante.
Fijación de los testículos de Drosophila se puede realizar utilizando una variedad de fijadores químicos. Aquí se describe la fijación con tanto formaldehído (Área B) y metanol-acetona (Ciclo C). Sin embargo, ya sea fijador se puede utilizar de forma intercambiable y desde diversos fijadores pueden alterar químicamente epítopos de anticuerpo nativo, la selección del fijador apropiado para la inmunotinción se debe determinar experimentalmente. Los siguientes fijadores y condiciones de incubación son comúnmente empleadas: 3,7% de formaldehído, 5 min a temperatura ambiente; metanol, 15 min a -20 ° C; acetona, 10 min a -20 ° C; metanol, 15 min a -20 ° C. seguido de acetona, 30 segundos a -20 ° C; etanol, 20 min a -20 ° C. Aunque la fijación con acetona, metanol, etanol y no requieren un paso de permeabilización extendida para la inmunotinción, WI fijaciónª formaldehído debe ser seguido por una incubación de 1 hora en PBST-B a temperatura ambiente para permeabilizar las membranas celulares y permitir el acceso del anticuerpo a epítopos intracelulares. Además, ciertos fijadores son más adecuados para antígenos particulares. Por ejemplo, las funciones de formaldehído bien para la fijación de las proteínas pequeñas, mientras que el metanol y acetona son muy adecuados para la fijación de grandes complejos moleculares 36.
La inmunotinción de Drosophila testículos se ha descrito anteriormente para la observación de estructuras de la cromatina y el citoesqueleto de microtúbulos 29,37. Aquí (Ciclo C), el procedimiento ha sido optimizado para el análisis de estructuras centrosomal contienen proteínas genéticamente etiquetados. Proporcionamos una descripción detallada de este procedimiento para guiar a las personas que no tienen experiencia en trabajar en los testículos de Drosophila. Este procedimiento también incluye modificaciones para mejorar la conservación y la morfología de los testículos, tales como mediante el uso de siliconized cubreobjetos y portaobjetos de vidrio con carga positiva.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por una beca (R01GM098394) de los NIH y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales, así como la concesión 1.121.176 de la Fundación Nacional de Ciencia.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Positively Charged Slides | AZER Scientific | EMS200A+ | |
Feather Microscalpel | Electron Microscopy Sciences | 72045-30 | |
37% Formaldehyde or Paraformaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Boston Bioproducts | BM-220 | |
18×18 mm coverslips number 1.5 | VWR | 48366 205 | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100 ml | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T9284-100ML | |
BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
RNAse A | 5 prime | 2900142 | |
Filter paper | Whatman | 1001-055 | |
Glass engraver | Dremel | 290-01 | |
TCS SP5 confocal microscope | Leica | ||
Mounting Media | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
Immuno Stain Moisture Chamber, Black | Electron Microscopy Sciences | 62010-37 | |
Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 |