Autonomt Bioluminescent däggdjursceller för kontinuerlig och övervakning i realtid av cytotoxicitet
Summary
Däggdjursceller uttrycker bakteriella kassetten mareld gen (<em> Lux</em>) Producera ljus autonomt. De resulterande självlysande dynamik vid kemisk exponering har visat att återspegla effekter av behandlingen på cellulär tillväxt och ämnesomsättning, vilket gör dessa celler en billig, kontinuerlig, i realtid verktyg toxicitet screening som lätt kan anpassas för hög genomströmning automation.
Abstract
Mammaliecell-baserade in vitro-tester har använts i stor utsträckning som alternativ till djurförsök för toxikologiska studier, men har begränsats på grund av de höga monetära och tid kostnaderna för parallella provberedning som är nödvändiga på grund av den destruktiva karaktär eldflugeluciferas-baserade screeningmetoder . Denna video beskriver användningen av autonomt bioluminescerande däggdjursceller, som inte kräver den destruktiva tillsats av en luciferin substrat, som ett billigt och enkel metod för att övervaka de cytotoxiska effekterna av en förening av intresse. Däggdjursceller som stabilt uttrycker den fullständiga bakteriell bioluminescens (luxCDABEfrp) genkassett producera autonomt en optisk signal som toppar vid 490 nm utan tillsats av en dyr och som kan påverka luciferinsubstrat, excitering av en extern energikälla, eller förstörelse av provet som är traditionellt utförs under optisk avbildning förfarandes. Detta oberoende av yttre stimulering lägger bördan för att bibehålla den självlysande reaktionen enbart på cellen, vilket innebär att den resulterande signalen endast upptäcks under aktiv metabolism. Denna egenskap gör det lux-uttryckande cellinje en utmärkt kandidat för användning som en biosentinel mot cytotoxiska effekter eftersom förändringar i självlysande produktionen tyder på negativa effekter på cellulär tillväxt och ämnesomsättning. Likaså medger självständiga karaktär och brist på erforderliga prov förstörelse upprepad avbildning av samma prov i realtid under hela giftet exponering och kan utföras på flera prover med befintlig utrustning för bildåtergivning på ett automatiserat sätt.
Introduction
I USA, läkemedel och andra produkter avsedda som livsmedel kräver omfattande bedömning innan de godkänns för konsumentbruk av Food and Drug Administration. Den ekonomiska bördan för att utföra detta test placeras på utvecklarens 1, vilket väsentligt ökar kostnaderna för ny förening utveckling och därför leder till en ökad kostnad för konsumenterna. Medan traditionellt mycket av denna screening har utnyttjat djurförsök att agera som ombud för mänskliga värdar, har detta visat sig vara en stor ekonomisk börda, med uppskattningsvis $ 2800000000 årligen spenderas på ADME / Tox (adsorption, distribution, metabolism, utsöndring, och toxicitet ) screening ensam 2 och fler bevis som tyder på att djurmodeller inte säkert kan förutsäga mänskliga toxikologiska reaktioner 3. Därför har in vitro human cellkultur-baserad testning vunnit popularitet under de senaste två decennierna på grund av dess relativt lägrekostnader, högre genomströmning och bättre representation av mänsklig biotillgänglighet och toxikologi 4. Aktuella cellen kultur-baserade toxicitet screeningmetoder använda olika ändpunkter, såsom mätning av ATP-nivåer, screening av aktiviteten av endogent tillgängliga cytoplasma enzymer, sondera integritet cellmembranet, eller spåra nivån på mitokondriell aktivitet, för att utvärdera cellulär viabilitet 5 , 6. Men oavsett den valda slutpunkten, dessa metoder kräver all destruktion av proverna innan mätningar kan utföras, vilket bara producerar data med en enda tidpunkt. Som ett resultat, ett stort antal prover behöver vara förberedd och behandlas parallellt för grundläggande toxikologiska kinetiska studier, återigen lägga till kostnader och arbete som krävs för ny förening utveckling. Alternativt, analyser som använder utsöndras luciferas såsom Gaussia luciferas 7, Vargula luciferas 8, och Metridia luciferas 9har utvecklats till att eliminera behovet av cell-lys och kräver en bråkdel av media för resultatmåttsmätningen, dock är de fortfarande begränsade till provtagning vid förutbestämda tidpunkter och också kräver tillsats av exogena ljus-aktiverande substrat.
För att undvika skada för erforderlig prov förstörelse samt att eliminera kostnaderna för substrat, har en human cellinje varit utformad som uttrycker hela bakteriella mareld (lux) genkassett (luxCDABEfrp) för att möjliggöra kontinuerlig övervakning av levande celler som liknar till fluorescerande färgämne baserade levande cell imaging, men utan de ytterligare photon-aktiverande och mikroskopisk undersökning förfaranden. Denna cellinje har förmåga att konstitutivt producera en optisk signal för kontinuerlig, direkt detektion utan behov av yttre stimulering och därmed undvika destruktion av proverna. Mekanistiskt den självlysande signalen genereras från dessa celler leders när luxAB bildade luciferas enzymet katalyserar oxidationen av en långkedjig fettsyra aldehyd (syntetiserad och regenereras genom de luxCDE genprodukter med hjälp av endogena substrat) i närvaro av minskad Riboflavinfosfat (FMNH 2, som recirkuleras från FMN av FRP-genen produkt) och molekylärt syre 10. Redovisning av lux kassetten i värdcellen kan därför lätt att produceras och detekteras utan celldöd eller exogena substrat tillägg. Likaså ser samspelet mellan de lux gener och endogent tillgängliga FMN, och O 2 samsubstrat, och kraven på underhåll av en miljö som kan stödja omställningen av FMN till FMNH 2, att den resulterande självlysande signalen endast kan upptäckas från att leva , metaboliskt aktiva celler.
Dessa krav har tidigare utnyttjats för att visa att lux-based självlysande effekt korrelerar starkt med cellulär befolkningens storlek 11 och att toxisk förening exponering försämrar autobioluminescent produktion i en dos-respons mode 12. Här använder vi en tidigare karaktäriserat autobioluminescent humana embryonala njur (HEK293) cellinje 11 för att visa den automatiserade toxikologisk screening av ett antibiotikum av bleomycin familjen med kända DNA-skadande aktivitet som ett representativt exempel för att validera ansökan om autobioluminescent däggdjursceller för toxicitetstester.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod visar användningen av autonomt bioluminescerande däggdjursceller som en in vitro cytotoxicitet screeningsanalys som tillåter levande celler övervakas kontinuerligt under sin livstid. Detta protokoll är flexibel och kan modifieras för att tillgodose specifika experimentella betingelser efter behov. Till exempel presenterade experimentet här är lämplig för att spåra akuta toxiska effekter, men kan anpassas för att bedöma tröga eller långsiktiga effekter genom att upprepade gånger avbil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dessa forskningsinsatser stöddes av National Science Foundation Division of Chemical, bioteknik, miljö och transport (CBET) System under utmärkelsen siffror CBET-0.853.780 och CBET-1.159.344 och National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) enligt utmärkelse nummer 1R43ES022567-01, och National Cancer Institute, Cancer Imaging program inom utmärkelse nummer CA127745-01. IVIS Lumina instrument som används i detta arbete erhölls från amerikanska armén Defense University Research Instrumentation Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comment |
| IVIS Lumina | PerkinElmer | Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used | |
| Living Imaging 2.0 | PerkinElmer | Newer updates of this software is available | |
| 75 cm2 cell culture treated flasks | Corning | 430641 | |
| 6-well tissue culture-treated plates | Costar | 07-200-83 | |
| Black 24-well plate | Greiner Bio-One | 662174 | 96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications |
| Phosphate buffered saline | Hyclone | SH30910 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free | Hyclone | SH30284 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH3091003 | |
| Nonessential amino acids, 100x | Life Technologies | 11140050 | |
| Antibiotic-antimycotic, 100x | Life Technologies | 15240062 | |
| Sodium pyruvate, 100mM | Life Technologies | 11360070 | |
| Zeocin, 100 mg/ml | Life Technologies | R25001 | |
| Tripsin, 0.05% | Life Technologies | 25300062 |
References
- U.S. Food and Drug Administration. Is it really FDA approved?. FDA Consumer Health Information. 2, (2009).
- Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharmacol. 32, 56-67 (2000).
- Stacey, G. Current developments in cell culture technology. Adv. Exp. Med. Biol. 745, 1-13 (2012).
- Li, A. P. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov. Today. 6, 357-366 (2001).
- Li, A. P. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr. Top. Med. Chem. 4, 701-706 (2004).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat. Protoc. 4, 582-591 (2009).
- Thompson, E. M., Nagata, S., Tsuji, F. I. Cloning and expression of cDNA for the luciferase from the marine ostracod Vargula hilgendorfii. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6567-6571 (1989).
- Lupold, S. E., Johnson, T., Chowdhury, W. H., Rodriguez, R. A real time Metridia luciferase based non-invasive reporter assay of mammalian cell viability and cytotoxicity via the beta-actin promoter and enhancer. PLoS ONE. 7, (2012).
- Meighen, E. A. Molecular biology of bacterial bioluminescence. Microbiol. Rev. 55, 123-142 (1991).
- Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS ONE. 5, e12441 (2010).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Determining toxicant bioavailability using a constitutively bioluminescent human cell line. , 1-4 (2011).
- Oliva-Trastoy, M., Defais, M., Larminat, F. Resistance to the antibiotic Zeocin by stable expression of the Sh ble gene does not fully suppress Zeocin-induced DNA cleavage in human cells. Mutagenesis. 20, 111-114 (2005).
- Close, D. M., Webb, J. D., Ripp, S. A., Patterson, S. S., Sayler, G. S. Remote detection of human toxicants in real time using a human optimized bioluminescent bacterial luciferase gene cassette bioreporter. Proc. SPIE 8371, Sensing Technologies for Global Health, Military Medicine, Disaster Response, and Environmental Monitoring II; and Biometric Technology for Human Identification IX. 837117, (2012).
- Close, D. M., Hahn, R. E., Patterson, S. S., Ripp, S. A., Sayler, G. S. Comparison of human optimized bacterial luciferase, firefly luciferase, and green fluorescent protein for continuous imaging of cell culture and animal models. J. Biomed. Opt. 16, e12441 (2011).
