Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En innovativ metode til exosome Kvantificering og størrelse måling

doi: 10.3791/50974 Published: January 17, 2015

Introduction

Den nøjagtige funktion af cirkulerende exosomer forblev ukendt for en lang periode. Selv nu den fulde sti mekanisme exosomer er ikke fuldt forstået. Da exosomer bære antigener, proteiner og RNA (mRNA og miRNA), der relaterer dem til deres forældreansvar celle oprindelse, deres funktion som celle-celle signalering sendere er hovedsagelig blevet prioriteret.

Mange forskellige metoder er blevet beskrevet i litteraturen for isoleringen og kvantitativ påvisning af exosomer 1,2. Der er imidlertid ikke enighed om en "gyldne standard" er nået. Imens de fleste forskere er aktive inden for exosom forskning enige om, at en konsekvent metode til isolation er stærkt påkrævet at opnå en højere grad af sammenlignelighed mellem forskellige rapporter og undersøgelser.

Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) er den mest almindelige og udbredt redskab til exosome analyse 3. FACS har benstemt ydelse, der via fluorescensmærkning kan celler fra forskellige oprindelser sammenlignes i et trin. De vigtigste ulemper ved FACS er, at denne metode ikke er tilstrækkelig følsom til at identificere partikler mindre end 0,5 um 4, mens exosomer er generelt mellem 30-120 nm i diameter 5, endnu mindre til at måle deres størrelse.

Scanning elektronmikroskopi (SEM) og transmissionselektronmikroskopi (TEM) er andre værktøjer til analyse af partikelstørrelse og morfologi af exosomer. Men både SEM og TEM har den ulempe, at forberedelsen af ​​prøver er tidskrævende, begge metoder indebærer arbejdskraftintensive skridt og hver har en vis risiko for artefakt generation. Hverken metoden er egnet til høj produktivitet og karakterisering af flere tusinde enkelte partikler i en prøve. Endvidere kan en kvantitativ analyse for klinisk daglige rutine, hvor prøver har ofte analyseres samtidigt eller i det mindste i en meget kort periodevanskelig at udføre. Ny generation teknikker nu muligt for os at analysere exosomer uden forudgående intensivt forberedende arbejde (f.eks miljømæssige SEM). Disse moderne teknikker er stadig temmelig ubelejligt for at analysere store mængder opslæmninger indeholdende exosomer at bestemme deres gennemsnitlige antal og størrelsesfordeling 6.

En anden yderst følsom metode til visualisering og analyse af exosomer er nanopartikel-tracking analyse (NTA). Denne fremgangsmåde drager fordel af to forskellige fysiske principper. Først er partikler detekteres af det spredte lys, når de bestråles med en laserstråle. Det andet fænomen er kendt som Brownsk bevægelse, hvorefter diffusion af forskellige partikler i en flydende suspension er omvendt proportional med deres størrelse. I sidstnævnte tilfælde bevægelsen afhænger også af temperaturen og viskositeten af ​​væsken. Alligevel er denne sats direkte relateret til partikelstørrelse og bruges af NTA. Brug af blødware-baseret analyse, registreres digitale billeder af spredt lys fra enkelte partikler. Plots af spredt lys pletter og deres bevægelseshastighed tilvejebringe de data, der letter bestemmelse af den samlede partikel tæller og størrelsesfordeling. Denne teknik er særlig stærk til at analysere partikler med en gennemsnitlig diameter på mindre end 100 nm.

Størrelsen og koncentrationsmålinger udføres med ZetaView Brownske og elektroforese Motion Video Analysis mikroskop. Dette er en semi-automatiseret desk top nanopartikel analyse instrument til væskeprøver (herefter benævnt partikel sporing instrument). Den består af partiklen sporing analysator samt en bærbar computer med den software, der anvendes til analyse af data. Heterogene biologiske prøver som egnede til denne metode som mere homogene suspensioner af uorganiske partikler. En laser scattering mikroskop med et videokamera anvendes til påvisning af partikler og for observation af deres bevægelse. Mens mikroskop akse er vandret og fokuseret ind i cellen kanal fyldt med en suspension indeholdende exosomer er laserstrålen orienteret lodret. Partiklerne er bestrålet med laser scatter lyset, som registreres under 90 ° med et digitalt videokamera via mikroskop (Figur 1). Intensiteten af ​​det spredte lys muliggør observation af partikler 60 nm diameter. I en sådan lysstyrken af ​​en partikel er ikke den eneste indikation af partikelstørrelse. Når ingen elektrisk felt påføres, partikel bevægelse følger kun Brownsk bevægelse og kan tjene som en indikator for beregning partikelstørrelse. Men instrumentet er også i stand til at påføre et elektrisk felt over cellen kanal. Ved udsættelse for dette område, det potentielle, polaritet og niveauet af ionisk-charge af de suspenderede exosomer bliver yderligere determinanter for retningen af ​​deres bevægelse. Hastighed og retning resulterer i en elektroforetisk mobilitet histogram.

Mens finde en optimal metode til at analysere isolerede exosomer er et problem, en anden ligger i en effektiv isolering af exosomer fra forskellige medier, såsom blod, ascites, urin, mælk, fostervand eller celle medier. Er blevet beskrevet hidtil Forskellige metoder, som er baseret på ultracentrifugering 1, industriel adskillelse reagenser (såsom Exoquick) 7, magnetiske perler for antigen anvender separation 8 eller ultrafiltrering trin 9.

I denne protokol vi demonstrere hele processen med exosom isolation via ultracentrifugering og vise, hvordan man analyserer den resulterende exosom indeholder suspension via partikel sporing instrument. Særlige overvejelser til analyse af humant plasma eller celledyrkningsmedium afledte exosomer leveres.

Protocol

BEMÆRK: Forsøgene præsenteres i dette arbejde er blevet godkendt af den institutionelle etiske bestyrelsen for Düsseldorf Universitet.

1. exosome Forberedelse

  1. Saml fuldblod i 3 citrat rør via venepunktur (i alt 9 ml). Hæld blod i et 15 ml Falcon-rør.
  2. Centrifugeres prøven ved 1500 xg i 20 minutter ved 4 ° C for at initiere adskillelsen af ​​celler fra plasma. Supernatanten overføres til et nyt 15 ml Falcon-rør.
  3. Centrifugeres prøven ved 2.800 xg i 20 minutter ved 4 ° C for at fjerne alle celler fra plasma (cellefri plasma FFP). Overfør den fælles fiskeripolitik til ultracentrifugering rør, 1 ml pr rør.
  4. Centrifugeres ved 100.000 xg i 90 min ved 4 ° C for at udtømme exosomer. Fjern 900 pi supernatant. Re-suspendere pellet i de resterende 100 ul i ultracentrifugering røret. Tilføj 900 pi PBS.
  5. Centrifugeres igen ved 100.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C. Fjern 900 pi supernatant. Re-suspendere pellet med de resterende 100 ul.
  6. Overførsel 5 til 20 pi resuspension i 40 ml destilleret vand. Filtreres suspensionen gennem et 450 nm filter for at adskille exosomer fra større partikler. Brug denne endelige suspension til måling partikel.

2. Startup forretningsordenen for Den Particle Tracking Instrument

  1. Start programmet ved at dobbeltklikke på den software-ikonet. Klik på de forskellige software faner ("Cell Check", "måling", "Analyse") for at skifte mellem dem i hele protokollen.
  2. Følg vejledningen på skærmen for en automatiseret implementering af startproceduren. Vælg de bokse til både celle kvalitetskontrol og auto justering.
    BEMÆRK: Begge disse trin kan gentages hver for om nødvendigt ved at trykke på knap (A) eller (B) på fanen "celle kontrol".
  3. Åbn ind- og udløb havn NTA instrumentet og injicere 10 ml destilleret vand med en sprøjte ind i cellen kanal, gennem indløbsporten. Luk udløbsporten som den sidste mængde vand der injiceres. Placer et bæger under udløbet port til at indsamle affald løsning. Kontroller, at målecellen er fri for luftbobler og ikke sprøjte luftbobler i systemet. Luk indløbsporten straks.
  4. Udfør cellen kvalitetskontrol ved at klikke på "OK". Softwaren vil vise celle kvalitet resultater efter et par sekunder.
  5. Hvis partikler stadig visualiseres i live-view skærm af softwaren eller hvis resultatet af kvalitetskontrollen er kun godt eller dårlig, er gentage trin 2.3, indtil de resterende partikler fjernet fra målingen celle. Også gentage trin 2.3 efter hver måling at undgå akkumulering af partikler. Hvis gentage destilleret vandinjektion og celle kontrol ikke producerer en "god" resultat, gå videre til 2.9.
  6. Forbered en kontrol suspension indeholdende ensartet 200 nm størrelse polystyrene partikler, der skal anvendes til at tilpasse foci af laseren og mikroskop. Tilsæt en dråbe af suspensionskoncentrat, fra instrumentets fabrikant, til 500 ml destilleret vand for at opnå den ønskede koncentration, således at 600 ± 100 partikler vises per skærm i live-view.
  7. Sprøjt tilpasningen suspension i NTA instrument som beskrevet i trin 2.3. Tryk på "OK" for at starte den automatiske justering, en automatiseret rutine hvorigennem systemet automatisk finde den optimale position af de to foci.
  8. Når en prompt vises med angivelse af systemet er nu klar til eksperimenter, skal du klikke på OK for at starte målingen.
  9. Lejlighedsvis, rense cellen kanal manuelt mellem eksperimenter ved at skylle cellen med en 30% opløsning af ethanol. Rengør kanalen, når softwaren viser en automatisk fejlrapport.

3. Måling af prøve

  1. Skyl kanal med destilleret vand forud for eaCH måling prøve (som beskrevet i trin 2.3).
  2. Injicer exosom suspension (fremstillet i afsnit 1) i til kanalen, som beskrevet i trin 2.3.
  3. Juster følgende vigtige parametre i softwaren efter behov:
    1. Følsomhed. For at finde den optimale følsomhedsområde, klik på knappen "antal partikler vs. følsomhed" for at vise en kurve for målte partikler pr skærmen for forskellige følsomhed niveauer. Valgte en følsomhed niveau, før den maksimale hældning af kurven. Et højere følsomhed muliggør visualisering af flere små partikler, men øger også spørgsmål vedrørende baggrundsstøj.
    2. Minimum lysstyrke. Valgte en start lysstyrke på 20 for exosom måling for at bruge denne funktion som et filter. Regulere dette parameter op til blanke ud stærkt lys-sprednings- partikler. Regulere den ned til at forstærke svagt spredende artefakter. Varier lysstyrke efter behov under hele forsøget.
      BEMÆRK: Partikler der lys-scatter for stærkt overlapper hinanden og kan udelukkes fra analysen ved en fejl.
    3. Min og max størrelse. Sæt et digitalt filter for at fjerne pixel støj og uønsket spredning fra store partikler ved at regulere det minimale og maksimale størrelse. Brug en række 10 til 500 pixels til måling af exosomer.
    4. Shutter. Juster den tidsperiode, at kameraet er åbent for 1/300 sek.
  4. Lev læst ud parametre:
    1. Skift mellem en digital og en analog visning modus på ethvert punkt ved at klikke på "Live-image" knappen.
    2. Gennem eksperimentet overvåge spredningsintensitet bar, som viser mætning status af prøven som en farvekodet indikator. Må ikke analysere exosomer hvis spredningen er rød. I et sådant tilfælde yderligere fortynde prøven for at undgå dette fænomen. Hvis den eksperimentelle betingelse forbyder en manipulation af prøven suspension nedregulere følsomhed eller op-regulere lysstyrken i softwaren-sNDSTILLINGER at forbedre måleresultaterne.
      BEMÆRK: Når prøver med en ekstremt høj koncentration af partikler analyseres scatter vil smelte enkelte partikler, og de regnes som en enkelt partikel.
    3. Bemærk at antallet af partikler talt i synsfeltet fra displayet.
  5. Klik på fanebladet "måling".
  6. Vælg indstillinger i "RUN indstillinger" array.
    1. Før hver erhvervelse, skal du vælge "Check bevægelse 'for en gentagen kontrol partikel afdrift test. Udfør testen mindst én gang, før du starter hele analysen. Hvis drift er højere end 20 um / sek, vent, før du fortsætter målingen, således at prøven stopper flyder.
    2. Vælg antallet af forsøg (5), og tidsforsinkelsen mellem dem (0).
    3. Udfør en "stikprøvekontrol", hvis det er nødvendigt. Denne test er en del af den automatiske justering i startproceduren og kan gentages bagefter efter behov.
    4. Klik til sidst på "køre video erhvervelse" -knappen. I det nye vindue, definere antallet af cykler (15) og antallet af målepositioner (11).
      BEMÆRK: laserhovedet og mikroskopet kan bevæges til at analysere partikelantal på 11 forskellige positioner. Afhængig af den eksperimentelle efterspørgsel, beslutte, om forsøget skal udføres på en enkelt position eller på forskellige positioner.
      1. Bekræft minimal tid varighed en partikel skal spores at blive regnet som en enkelt partikel ved at indstille videoopløsning (lav). En lavere opløsning giver en kortere sporing varighed.
      2. Vælg en fil-navn, og klik på "OK" for at starte målingen.

    4. Fortolkning af resultaterne

    1. Se følgende resultater og parametre, der vises efter måling på fanebladet "resultater": (1) det samlede antal partikler spores, (2) gennemsnitligt antal delkel pr position, og (3) koncentration partikel.
      1. Se resultatet gennemsnitlige tabel for numeriske forhold af partikelstørrelse (diameter, overflade og volumen) til den procentdel af partikelantal, samt værdier af gennemsnit og standard differentiering.
      2. Brug peak analyse tabellen, hvis der findes mere end en top i grafisk analyse. Denne tabel viser fordelingen af ​​partikler, der er mindre end den første eller respektivt anden top.
    2. Se grafen beregnet efter målingen for at se en fordeling af partikler efter størrelse. Brug ikonerne i displayet mode og over grafen for at ændre indstillingerne.

Representative Results

Prøven, der anvendes til denne demonstration viser en optimal indstilling for måling med en følsomhed på 85%, før den største hældning af følsomheden kurven (figur 2). Lysstyrken er min / max værdier blev valgt som anbefalet i protokollen. En koncentration på 5,3 partikler / ml x 10 6 blev målt, mens den gennemsnitlige størrelse af partiklerne var 0,149 um, de fleste af dem var 0,137 um.

De modtagne efter målingen værdier kan gemmes i en rapport med et filformat for .pdf eller som en .txt til eksport i en database. Grafen kan justeres efter foretrukket som beskrevet i protokollen (afsnit 4). Videosekvensen gemmes også og kan bruges til senere off-line re-analyse. Men i sådan en off-line analyse, indstillinger overtagelsesbalancen på kameraet kan ikke ændres med tilbagevirkende kraft.

For at finde den optimale parameterindstillinger for en måling, vi her beskriver the optimering af indstillinger instrumentet på eksempel på en 100 nm polystyren størrelse standard. Indflydelsen af ​​to parametre, følsomhed og min / max størrelse på videobilledet og partikelstørrelsesfordeling diskuteres i detaljer. Alle andre parametre er opsummeret i tabel 1.

Et visuelt indtryk af virkningen af følsomhed (intervallet fra 50 til 94) på analoge og digitale billeder visualiseres i figur 3. De kvantitative oplysninger stammer fra billederne er præsenteret i figur 4, er baseret på indstillingerne i tabel 1, Min Størrelse = 5 og Max Størrelse = 200. En typisk forhold mellem antallet af detekterede partikler vs. følsomhed er vist i figur 4A. Mellem 50 og 90, at antallet af fundne partikler øges med følsomhed og steg dramatisk for følsomheder> 90. Blev fundet et optimalt område for følsomhed mellem 66 og 86 (A). Partikelstørrelsesfordelinger opnået med difskellige lysfølsomhedsindstilling er vist i figur 4B. Partikelstørrelsesfordelingerne repræsenterer middelværdien af ​​tre individuelle målinger. For en for lav følsomhed (følsomhed = 62, rød kurve) kun få partikler blev analyseret resulterede i temmelig dårlige statistik. Antallet af analyserede partikler øges med følsomhed og nåede en optimal mellem 70 (gul kurve) og 86 (tan kurve). Yderligere øgede følsomhed føre til en forringelse af partikelstørrelsesfordelingen med antallet af partikler slippe og størrelsesfordeling skiftende retning af mindre størrelser (følsomhed = 94, blå kurve). Figur 4C viser udviklingen i antallet baseret x50 diameter (50% af partiklerne er mindre end denne diameter) som en funktion af følsomhed. I beige interval, RSD partikel størrelse var mindre end 8% og svarer til det optimale interval i A. De røde områder angiver RSD> 8% som følge af dårlige statistikker (sensitivitet for lav) eller bred distridrag med skift til mindre størrelser (følsomhed for høj).

Indstillingerne i Min Størrelse og max størrelse er filtre, der anvendes til digitale billeder for at fjerne partikler med spot størrelser mindre end Min størrelse og større end max størrelse. På grund af evnen til at sprede lys, en partikel skaber en plet af en vis størrelse på et digitalt billede. Størrelsen af ​​stedet måles som antallet af pixels (px). Når en partikel spreder lys meget godt (fx partikler> 200 nm eller aggregater), stedet størrelse er ganske store, fx> 500 px. Pletstørrelsen er ganske lille (f.eks <10 px) for små partikler (f.eks <20 nm), afhængigt af partikelmaterialet. Spot størrelse (px) kan ikke ombyttes med partikelstørrelse (nm), da de ikke er identiske, og der er ingen direkte sammenhæng mellem disse to variabler. En optimering af min og max størrelse giver brugeren mulighed for at bortfiltrere uønskede objekter såsom agglomerater (max størrelse) eller lillegenstande såsom baggrundsstøj (Min størrelse). Indflydelsen af Min / max størrelse på partikelstørrelsesfordelingen af en 100 nm størrelse standard er vist i Figur 4D (følsomhed = 82). Når intervallet er indstillet til små spot størrelser (fx min = 1, max = 52; appelsin kurve), at antallet af analyserede partikler reduceres og antallet baseret x50 diameter lidt forskudt mod mindre størrelser. En indstilling til større lokationer (min = 40, max = 1.000; røde kurve) resulterer i en bred partikelstørrelsesfordeling skiftet til større størrelser. For at opnå lige store samlede antal partikler, blev interval grænser både orange og rødt fordelinger justeret til at matche 80 partikler. Fordelingen med optimale indstillinger (min = 5, max = 200; tan kurve) består af 360 partikler.

En række vellykkede eksperimenter blev udført med exosomer isoleret ved ultracentrifugering og målt ved hjælp af NTA præsenterede system. De resulterende data blev megetkonsekvent og bekræftet et højt reproducerbarhed. Andre isoleringsmetoder skal vise lignende resultater. Imidlertid blev fortyndingstrinnet identificeret som en særlig kritisk skridt og dens indvirkning på de beregnede samlede antal partikler skal revurderes.

Figur 1
Figur 1. Skematisk af opsætningen af den nye transatlantiske dagsorden. Mikroskopet / video akse og laserstrålen er orienteret vinkelret på hinanden, krydser hinanden i cellen kanal tværsnit. Spredt lys fra partiklerne vises i "live-view" vindue af softwaren. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Virkningerne af følsomhed på analog og digitalt billede. Visualisering af partikler på Live View-skærmen vises for følsomheder mellem 50 og 94 for både analoge (øverste række) end digitale (nederste række) synspunkter. Når følsomheden er for lav, detekteres kun et par partikler (venstre). Ved optimal følsomhed partiklerne fremstår som enkelte prikker godt isoleret fra hinanden (i midten). Ved en forholdsvis høj følsomhed partikler smelte sammen fører til dårlig billedkvalitet (til højre). Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Påvirkning af følsomhed min og max indstillinger størrelse for en kontrol 100 nm polystyren partikel prøve (A) Plot af følsomhed versus detekteret antal partikler.; det optimale interval er 66-86, før den maksimale hældning af kurven. Distributioner (B) Partikel størrelse opnås med flere følsomhed indstillinger (62-94); grafer for for lavt (62) eller for høj (94) følsomhed ikke fange partikelstørrelsesfordelingen for 100 nm polystyren kontrolprøve. (C) Antal baseret x50 diameter versus følsomhed; fejlen af x50 i beige intervallet er mindre end 8%, optimal interval er fra 66 til 86. (D) Virkningen af min og max størrelse på partikelstørrelsesfordelingen; optimale parametre (min = 5 og max = 200) fange den rigtige fordeling for kontrolprøven. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Før overtagelsen parametre
Følsomhed variabel
Shutter 40
Frame rate 30 fps
Opløsning Hejgh
Cykler 10
Flere Acquisitions 3
Position 1
Efter overtagelsen parametre
Min lysstyrke 30
Max størrelse variabel
Min Størrelse variabel

Tabel 1. Oversigt over før og efter overtagelsen parametre til indstilling af partikel sporing instrument.

Discussion

Vi viser en detaljeret protokol for exosome isolation fra blod og nuværende nanopartikel sporing som en hidtil ukendt og innovativ fremgangsmåde til at måle exosom størrelse og koncentration i en biologisk væske. I de præsenterede forsøg humant perifert blod blev anvendt som oprindelse exosomer. Imidlertid kan andre oprindelser, såsom urin, spyt, cellekultursupernatant, etc., også anvendes som testmateriale.

Baseret på den biologiske variabilitet exosome koncentration i mennesker, kan analyser fra forskellige individer har en bemærkelsesværdig varierende koncentration af exosomer. Koncentrationen af ​​partikler i den biologiske test probe, kan dog have en indvirkning på resultaterne. Derfor er der behov for en pålidelig og standardiseret tilgang til fortynding af sonder. I den foreliggende fremgangsmåde exosome indeholdende plasma blev genereret fra 9 ml perifert fuldblod. Anvendelse af differentiel centrifugering trin en exosome pellet blev isoleret fra1 ml plasma og resuspenderet i 5 ml destilleret vand resulterer i arbejdsmiljøet prøve af suspenderede exosomer. Denne foruddefineret indstilling har givet os en ordentlig koncentration af partikler, dvs passende scatter intensitet under NTA. Ved siden af ​​volumen og fortynding aspekt sammensætningen af ​​de løsninger, der anvendes, er også af betydning. Vi har brugt destilleret vand til den endelige resuspension af exosomer. Selvfølgelig kan forskellige medier til den endelige fortynding trin også anvendes, i overensstemmelse med kravene i den eksperimentelle opsætning. Men i tilfælde af Zetapotential målinger af ioniske-opløsninger, især når der afprøves med en bufferkapacitet, en forsigtig fortynding i turbulens frie betingelser er nyttigt. Til direkte sammenligning af flere prøver anbefaler vi at holde den samme fortynding niveau for alle prøver. Alle indstillinger undtagen følsomheden og videoopløsning kan ændres bagefter ved at bruge ZetaView Analysis software.

10. Vi mener, at de praktiske aspekter vedrørende prøvehåndtering og reproducerbarhed af resultaterne er af central betydning i valget af metodologiske sekvens for exosome evaluering. Vi mener også, at en ideel detection system bør fjerne bruger-afhængigt faktorer, der kan påvirke resultaterne af målingerne. Exosomet analysere tilgang, der præsenteres her, opfylder kriteriet for nem håndtering i høj grad. Som en yderligere fordel, er semi-automatiseret analyse af prøverne udføres i en hurtig proces, skabe resultater på kort tid. En online visualisering af exosomer hjælper analysatoren til gai et øjeblik idé om exosom egenskaber, f.eks brutto koncentration.

En meget enkel, men elegant tilføjelse til måleteknik præsenteres her er anvendelsen af ​​antistof mærket exosomer og indfangning af det spredte laserstråle ved hjælp af en forudgående filter foran detektoren. På denne måde kan skelnes exosom subpopulationer efter deres overfladeantigener og andre biologisk relevante egenskaber, der er teknisk tilgængelige for en selektiv fluorescerende farvning.

En ulempe ved den nuværende version af vores partikel sporing instrument er, at ved meget høje følsomhedsniveauer artefakter såsom baggrundsstøj kan blive til stede, som er baseret på cellen kanalvæg. En teknisk løsning og forbedring af det nuværende system kan komme til i den nærmeste fremtid. Ved denne fremgangsmåde refleksioner af laser spreder lys på kanalvæggen vil blive reduceret, og derved øge nøjagtigheden af ​​de målte signaler og opnåede data og sænke detektionsgrænsen.

Selvom den aktuelt anvendte protokol til exosom isolation er veletableret og den anvendte partikel sporing instrument har en bemærkelsesværdig præcis opløsning med en lavere størrelsesfordeling på 30 nm, er der ingen garanti for, at de fundne partikler er faktisk helt rigtigt exosomer. Andre partikler, såsom døde cellefragmenter eller større protein-komplekser kan også være til stede i exosomet suspension og føre til falske positive signaler. En pålidelig metode, som sådan "forurening" kan udelukkes, kan være elektronmikroskopi (EM), enten transmission EM eller scanning EM. Desværre ingen generel og specifik markør for exosomer er hidtil identificeret, selv om en række tidligere foreslåede overflademarkører har fået en stigende mængde opmærksomhed, herunder tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9 mv 11.

"> Uanset den fremtidige udvikling af forskning i exosom biologi, navnlig vedrørende exosom specifikke markører, vil den protokol, der præsenteres her giver en kraftfuld metode til isolering og afsløring af exosomer. Koncentration og størrelse kan let bestemmes i en software-støttede ligetil måde. Tilføjelsen af ​​selektive fluorescerende markører eller fluoroforen koblede antistoffer vil sandsynligvis yderligere øge de mulige anvendelser af den præsenterede tilgang NTA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Citrate tube BD 364305 BD Vacutainer
Distilled water Braun 3880087 Aqua ad iniectabilia
Falcon tube Greiner Bio One 188271 PP Tube, Steril 15 ml
Ultracentrifugation tube Beckman 357448 Microfuge Tube Polyallomer 1.5 ml
Polybead Polysciences, Inc. 07304 2.6% Solids-Latex
Alignment Solution
Syringe (Filter) Braun 4617053V 5 ml
Syringe (ZetaView) Braun 4606051V 5 ml
Needle BD 305180 BD Blunt Fill Needle
Filter Sartorius Stedim 16555 Syringe filter, hydrophilic, 450 µm
Ultracentrifuge Beckman L8-M Rotor: 70Ti Ser. No E21078
ZetaView Particle Metrix PMX 100, Type 101
Centrifuge Eppendorf 5804R Rotor: A-4-44

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. (3.22), (2006).
  2. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).
  3. Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. e3037 (2012).
  4. Konokhova, A. I., et al. Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles. Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).
  5. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).
  6. Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).
  7. Exoquick, ExoQuick-TC and ExoQuick-LP. Polymer-based exosome preciption. System Biosciences. Available from: http://www.systembio.com/microrna-research/exoquick-exosomes/overview (2015).
  8. Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).
  9. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).
  10. Carr, B., Warren, J. Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology. Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).
  11. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. International immunology. 17, 879-887 (2005).
En innovativ metode til exosome Kvantificering og størrelse måling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mehdiani, A., Maier, A., Pinto, A., Barth, M., Akhyari, P., Lichtenberg, A. An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement. J. Vis. Exp. (95), e50974, doi:10.3791/50974 (2015).More

Mehdiani, A., Maier, A., Pinto, A., Barth, M., Akhyari, P., Lichtenberg, A. An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement. J. Vis. Exp. (95), e50974, doi:10.3791/50974 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter