A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Den nøjagtige funktion af cirkulerende exosomer forblev ukendt for en lang periode. Selv nu den fulde sti mekanisme exosomer er ikke fuldt forstået. Da exosomer bære antigener, proteiner og RNA (mRNA og miRNA), der relaterer dem til deres forældreansvar celle oprindelse, deres funktion som celle-celle signalering sendere er hovedsagelig blevet prioriteret.
Mange forskellige metoder er blevet beskrevet i litteraturen for isoleringen og kvantitativ påvisning af exosomer 1,2. Der er imidlertid ikke enighed om en "gyldne standard" er nået. Imens de fleste forskere er aktive inden for exosom forskning enige om, at en konsekvent metode til isolation er stærkt påkrævet at opnå en højere grad af sammenlignelighed mellem forskellige rapporter og undersøgelser.
Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) er den mest almindelige og udbredt redskab til exosome analyse 3. FACS har benstemt ydelse, der via fluorescensmærkning kan celler fra forskellige oprindelser sammenlignes i et trin. De vigtigste ulemper ved FACS er, at denne metode ikke er tilstrækkelig følsom til at identificere partikler mindre end 0,5 um 4, mens exosomer er generelt mellem 30-120 nm i diameter 5, endnu mindre til at måle deres størrelse.
Scanning elektronmikroskopi (SEM) og transmissionselektronmikroskopi (TEM) er andre værktøjer til analyse af partikelstørrelse og morfologi af exosomer. Men både SEM og TEM har den ulempe, at forberedelsen af prøver er tidskrævende, begge metoder indebærer arbejdskraftintensive skridt og hver har en vis risiko for artefakt generation. Hverken metoden er egnet til høj produktivitet og karakterisering af flere tusinde enkelte partikler i en prøve. Endvidere kan en kvantitativ analyse for klinisk daglige rutine, hvor prøver har ofte analyseres samtidigt eller i det mindste i en meget kort periodevanskelig at udføre. Ny generation teknikker nu muligt for os at analysere exosomer uden forudgående intensivt forberedende arbejde (f.eks miljømæssige SEM). Disse moderne teknikker er stadig temmelig ubelejligt for at analysere store mængder opslæmninger indeholdende exosomer at bestemme deres gennemsnitlige antal og størrelsesfordeling 6.
En anden yderst følsom metode til visualisering og analyse af exosomer er nanopartikel-tracking analyse (NTA). Denne fremgangsmåde drager fordel af to forskellige fysiske principper. Først er partikler detekteres af det spredte lys, når de bestråles med en laserstråle. Det andet fænomen er kendt som Brownsk bevægelse, hvorefter diffusion af forskellige partikler i en flydende suspension er omvendt proportional med deres størrelse. I sidstnævnte tilfælde bevægelsen afhænger også af temperaturen og viskositeten af væsken. Alligevel er denne sats direkte relateret til partikelstørrelse og bruges af NTA. Brug af blødware-baseret analyse, registreres digitale billeder af spredt lys fra enkelte partikler. Plots af spredt lys pletter og deres bevægelseshastighed tilvejebringe de data, der letter bestemmelse af den samlede partikel tæller og størrelsesfordeling. Denne teknik er særlig stærk til at analysere partikler med en gennemsnitlig diameter på mindre end 100 nm.
Størrelsen og koncentrationsmålinger udføres med ZetaView Brownske og elektroforese Motion Video Analysis mikroskop. Dette er en semi-automatiseret desk top nanopartikel analyse instrument til væskeprøver (herefter benævnt partikel sporing instrument). Den består af partiklen sporing analysator samt en bærbar computer med den software, der anvendes til analyse af data. Heterogene biologiske prøver som egnede til denne metode som mere homogene suspensioner af uorganiske partikler. En laser scattering mikroskop med et videokamera anvendes til påvisning af partikler og for observation af deres bevægelse. Mens mikroskop akse er vandret og fokuseret ind i cellen kanal fyldt med en suspension indeholdende exosomer er laserstrålen orienteret lodret. Partiklerne er bestrålet med laser scatter lyset, som registreres under 90 ° med et digitalt videokamera via mikroskop (Figur 1). Intensiteten af det spredte lys muliggør observation af partikler 60 nm diameter. I en sådan lysstyrken af en partikel er ikke den eneste indikation af partikelstørrelse. Når ingen elektrisk felt påføres, partikel bevægelse følger kun Brownsk bevægelse og kan tjene som en indikator for beregning partikelstørrelse. Men instrumentet er også i stand til at påføre et elektrisk felt over cellen kanal. Ved udsættelse for dette område, det potentielle, polaritet og niveauet af ionisk-charge af de suspenderede exosomer bliver yderligere determinanter for retningen af deres bevægelse. Hastighed og retning resulterer i en elektroforetisk mobilitet histogram.
Mens finde en optimal metode til at analysere isolerede exosomer er et problem, en anden ligger i en effektiv isolering af exosomer fra forskellige medier, såsom blod, ascites, urin, mælk, fostervand eller celle medier. Er blevet beskrevet hidtil Forskellige metoder, som er baseret på ultracentrifugering 1, industriel adskillelse reagenser (såsom Exoquick) 7, magnetiske perler for antigen anvender separation 8 eller ultrafiltrering trin 9.
I denne protokol vi demonstrere hele processen med exosom isolation via ultracentrifugering og vise, hvordan man analyserer den resulterende exosom indeholder suspension via partikel sporing instrument. Særlige overvejelser til analyse af humant plasma eller celledyrkningsmedium afledte exosomer leveres.
Vi viser en detaljeret protokol for exosome isolation fra blod og nuværende nanopartikel sporing som en hidtil ukendt og innovativ fremgangsmåde til at måle exosom størrelse og koncentration i en biologisk væske. I de præsenterede forsøg humant perifert blod blev anvendt som oprindelse exosomer. Imidlertid kan andre oprindelser, såsom urin, spyt, cellekultursupernatant, etc., også anvendes som testmateriale.
Baseret på den biologiske variabilitet exosome koncentration i mennesker, kan analyser fra forskellige individer har en bemærkelsesværdig varierende koncentration af exosomer. Koncentrationen af partikler i den biologiske test probe, kan dog have en indvirkning på resultaterne. Derfor er der behov for en pålidelig og standardiseret tilgang til fortynding af sonder. I den foreliggende fremgangsmåde exosome indeholdende plasma blev genereret fra 9 ml perifert fuldblod. Anvendelse af differentiel centrifugering trin en exosome pellet blev isoleret fra1 ml plasma og resuspenderet i 5 ml destilleret vand resulterer i arbejdsmiljøet prøve af suspenderede exosomer. Denne foruddefineret indstilling har givet os en ordentlig koncentration af partikler, dvs passende scatter intensitet under NTA. Ved siden af volumen og fortynding aspekt sammensætningen af de løsninger, der anvendes, er også af betydning. Vi har brugt destilleret vand til den endelige resuspension af exosomer. Selvfølgelig kan forskellige medier til den endelige fortynding trin også anvendes, i overensstemmelse med kravene i den eksperimentelle opsætning. Men i tilfælde af Zetapotential målinger af ioniske-opløsninger, især når der afprøves med en bufferkapacitet, en forsigtig fortynding i turbulens frie betingelser er nyttigt. Til direkte sammenligning af flere prøver anbefaler vi at holde den samme fortynding niveau for alle prøver. Alle indstillinger undtagen følsomheden og videoopløsning kan ændres bagefter ved at bruge ZetaView Analysis software.
<p class="Jove_content"> Selvom forfatterne mener, at heri indførte systemet i øjeblikket Den mest passende instrument, er det ikke den eneste tilgængelige NTA system. En række tidligere rapporter har ansat andre systemer, der anvender de samme NTA principper, men giver et andet instrument design, der går sammen med nogle forskellige funktioner 10. Vi mener, at de praktiske aspekter vedrørende prøvehåndtering og reproducerbarhed af resultaterne er af central betydning i valget af metodologiske sekvens for exosome evaluering. Vi mener også, at en ideel detection system bør fjerne bruger-afhængigt faktorer, der kan påvirke resultaterne af målingerne. Exosomet analysere tilgang, der præsenteres her, opfylder kriteriet for nem håndtering i høj grad. Som en yderligere fordel, er semi-automatiseret analyse af prøverne udføres i en hurtig proces, skabe resultater på kort tid. En online visualisering af exosomer hjælper analysatoren til gai et øjeblik idé om exosom egenskaber, f.eks brutto koncentration.En meget enkel, men elegant tilføjelse til måleteknik præsenteres her er anvendelsen af antistof mærket exosomer og indfangning af det spredte laserstråle ved hjælp af en forudgående filter foran detektoren. På denne måde kan skelnes exosom subpopulationer efter deres overfladeantigener og andre biologisk relevante egenskaber, der er teknisk tilgængelige for en selektiv fluorescerende farvning.
En ulempe ved den nuværende version af vores partikel sporing instrument er, at ved meget høje følsomhedsniveauer artefakter såsom baggrundsstøj kan blive til stede, som er baseret på cellen kanalvæg. En teknisk løsning og forbedring af det nuværende system kan komme til i den nærmeste fremtid. Ved denne fremgangsmåde refleksioner af laser spreder lys på kanalvæggen vil blive reduceret, og derved øge nøjagtigheden af de målte signaler og opnåede data og sænke detektionsgrænsen.
Selvom den aktuelt anvendte protokol til exosom isolation er veletableret og den anvendte partikel sporing instrument har en bemærkelsesværdig præcis opløsning med en lavere størrelsesfordeling på 30 nm, er der ingen garanti for, at de fundne partikler er faktisk helt rigtigt exosomer. Andre partikler, såsom døde cellefragmenter eller større protein-komplekser kan også være til stede i exosomet suspension og føre til falske positive signaler. En pålidelig metode, som sådan "forurening" kan udelukkes, kan være elektronmikroskopi (EM), enten transmission EM eller scanning EM. Desværre ingen generel og specifik markør for exosomer er hidtil identificeret, selv om en række tidligere foreslåede overflademarkører har fået en stigende mængde opmærksomhed, herunder tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9 mv 11.
"> Uanset den fremtidige udvikling af forskning i exosom biologi, navnlig vedrørende exosom specifikke markører, vil den protokol, der præsenteres her giver en kraftfuld metode til isolering og afsløring af exosomer. Koncentration og størrelse kan let bestemmes i en software-støttede ligetil måde. Tilføjelsen af selektive fluorescerende markører eller fluoroforen koblede antistoffer vil sandsynligvis yderligere øge de mulige anvendelser af den præsenterede tilgang NTA.The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Name of the Reagent | |||
Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
Material Name | |||
Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |