A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
परिसंचारी exosomes की सटीक समारोह के समय की एक लंबी अवधि के लिए अनजान बने रहे। यहां तक कि अब exosomes का पूरा पथ तंत्र पूरी तरह से समझ नहीं है। Exosomes ले जाने के बाद से एंटीजन, प्रोटीन और मूल के उनके पैतृक सेल, सेल सेल संकेत ट्रांसमीटरों के रूप में उनके कार्य के लिए उन्हें संबंधित है कि शाही सेना (mRNA और miRNA) मुख्य रूप से प्राथमिकता दी गई है।
कई अलग अलग तरीकों अलगाव और exosomes 1,2 के मात्रात्मक पता लगाने के लिए साहित्य में वर्णित किया गया है। हालांकि, एक 'सोने के मानक' पर कोई आम सहमति पर पहुंच गया है। इस बीच exosome अनुसंधान के क्षेत्र में सक्रिय वैज्ञानिकों के बहुमत अलगाव का एक सुसंगत विधि अत्यधिक विभिन्न रिपोर्टों और अध्ययनों के बीच तुलनीयता के एक उच्च डिग्री हासिल करने के लिए warranted है कि सहमत हैं।
प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) exosome विश्लेषण 3 के लिए सबसे आम है और प्रचलित साधन है। FACS के बेन हैप्रतिदीप्ति लेबलिंग के माध्यम से, अलग अलग मूल से कोशिकाओं को एक कदम में तुलना की जा सकती है कि, efit। FACS के बड़े नुकसान भी कम उनके आकार को मापने के लिए, exosomes व्यास 5 में 30-120 एनएम के बीच आम तौर पर कर रहे हैं, जबकि इस विधि, कणों छोटे से अधिक 0.5 माइक्रोन चार की पहचान करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं है कि कर रहे हैं।
स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) कण आकार और exosomes की आकृति विज्ञान के विश्लेषण के लिए अन्य उपकरण हैं। हालांकि, SEM और मंदिर दोनों नमूनों की तैयारी के समय लेने वाली है, दोनों तरीकों श्रम प्रधान कदम शामिल है कि नुकसान है और प्रत्येक विरूपण साक्ष्य पीढ़ी के कुछ जोखिम है। न तो विधि उच्च नमूना throughput और एक नमूना के एकल कणों के कई हजारों के लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, नमूने अक्सर है जहां नैदानिक दैनिक दिनचर्या के लिए एक मात्रात्मक विश्लेषण एक बहुत ही कम अवधि में एक साथ या कम से कम है विश्लेषण करने के लिएप्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है। नई पीढ़ी की तकनीक अब हमें पूर्व गहन प्रारंभिक कार्य (जैसे, पर्यावरण SEM) के बिना exosomes का विश्लेषण करने की अनुमति देते हैं। ये आधुनिक तकनीक अभी भी उनकी औसत संख्या और आकार के वितरण 6 निर्धारित करने के लिए exosomes युक्त बड़ी मात्रा में निलंबन का विश्लेषण करने के लिए नहीं बल्कि असुविधाजनक हैं।
दृश्य और exosomes के विश्लेषण के लिए एक और बेहद संवेदनशील विधि nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) है। इस विधि भौतिकी के दो अलग-अलग सिद्धांतों का लाभ लेता है। सबसे पहले, कणों वे एक लेजर बीम के साथ विकिरणित हैं जब बिखरे हुए प्रकाश से पता चला रहे हैं। दूसरी घटना के अनुसार जो एक तरल निलंबन में अलग कणों के प्रसार उनके आकार के विपरीत आनुपातिक है, ब्राउनियन गति के रूप में जाना जाता है। उत्तरार्द्ध मामले में आंदोलन भी तापमान और तरल की चिपचिपाहट पर निर्भर करता है। फिर भी, इस दर सीधे कण आकार से संबंधित है और NTA के द्वारा किया जाता है। मुलायम का प्रयोगवेयर-आधारित विश्लेषण, एकल कणों से बिखरे हुए प्रकाश के डिजिटल छवियों दर्ज हैं। बिखरे हुए प्रकाश स्पॉट के भूखंडों और गति की अपनी गति कुल कण गिनती और आकार के वितरण का निर्धारण करने की सुविधा है कि डेटा प्रदान करते हैं। इस तकनीक को कम से कम 100 एनएम का एक मतलब व्यास के साथ कणों का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से शक्तिशाली है।
आकार और एकाग्रता माप ZetaView ब्राउनियन और वैद्युतकणसंचलन मोशन वीडियो विश्लेषण खुर्दबीन के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं। यह (इसके बाद कण ट्रैकिंग उपकरण के रूप में करने के लिए कहा गया है) तरल के नमूने के लिए एक अर्ध-स्वचालित डेस्क टॉप nanoparticle विश्लेषण साधन है। यह कण ट्रैकिंग विश्लेषक के रूप में अच्छी तरह से डेटा के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के साथ एक लैपटॉप के होते हैं। विषम जैविक नमूने अकार्बनिक कणों की अधिक सजातीय निलंबन के रूप में इस विधि के लिए के रूप में उपयुक्त हैं। एक वीडियो कैमरे के साथ एक लेजर बिखरने खुर्दबीन के कणों का पता लगाने के लिए और obse के लिए प्रयोग किया जाता हैउनके आंदोलन की rvation। माइक्रोस्कोप अक्ष क्षैतिज और exosomes युक्त निलंबन से भर सेल चैनल में ध्यान केंद्रित किया है, लेजर बीम खड़ी उन्मुख है। माइक्रोस्कोप (चित्रा 1) के माध्यम से एक डिजिटल वीडियो कैमरा से 90 डिग्री नीचे दर्ज की गई है, जो लेजर बिखराव प्रकाश ने किरणित कणों। बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता बड़े कणों 60 एनएम व्यास के अवलोकन की अनुमति देता है। इस तरह के एक सेटिंग में एक कण की चमक कण आकार के ही संकेत नहीं है। कोई बिजली के क्षेत्र लागू किया जाता है, कण आंदोलन केवल ब्राउनियन गति का अनुसरण और कण आकार की गणना के लिए एक संकेतक के रूप में सेवा कर सकता है। हालांकि, साधन भी सेल चैनल पार एक बिजली के क्षेत्र लागू करने के लिए सक्षम है। इस क्षेत्र के अधीन है, जब क्षमता, polarity और निलंबित exosomes की आयनिक प्रभारी के स्तर पर उनके आंदोलन की दिशा के आगे निर्धारकों हो जाते हैं। एक electrophoretic मो में वेग और दिशा परिणामसाख हिस्टोग्राम।
पृथक exosomes का विश्लेषण करने के लिए एक इष्टतम तरीका खोजने एक समस्या है, वहीं एक दूसरे से इस तरह खून, जलोदर, मूत्र, दूध, एमनियोटिक द्रव या सेल मीडिया के रूप में विभिन्न मीडिया से exosomes के प्रभावी अलगाव में निहित है। अलग अलग तरीकों ultracentrifugation एक के आधार पर कर रहे हैं, जो इस प्रकार अब तक वर्णित किया गया है, (जैसे Exoquick के रूप में) औद्योगिक जुदाई अभिकर्मकों 7, जुदाई 8 या ultrafiltration रोजगार प्रतिजन के लिए चुंबकीय मोती 9 कदम।
इस प्रोटोकॉल में हम ultracentrifugation के माध्यम से exosome अलगाव की पूरी प्रक्रिया का प्रदर्शन और कण ट्रैकिंग साधन के माध्यम से निलंबन युक्त जिसके परिणामस्वरूप exosome विश्लेषण करने के लिए कैसे दिखा। मानव प्लाज्मा या सेल संस्कृति के माध्यम से निकाली गई exosomes के विश्लेषण के लिए विशिष्ट कारणों से प्रदान की जाती हैं।
हम एक जैविक तरल पदार्थ में exosome आकार और एकाग्रता को मापने के लिए एक उपन्यास और अभिनव तरीके के रूप में रक्त और वर्तमान nanoparticle ट्रैकिंग से exosome अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है। प्रस्तुत प्रयोगों में मानव परिधीय रक्त exosomes की उत्पत्ति के रूप में इस्तेमाल किया गया था। हालांकि, इस तरह के आदि मूत्र, थूक, सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला, के रूप में अन्य मूल, यह भी परीक्षण सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
मानव में exosome एकाग्रता के जैविक परिवर्तनशीलता के आधार पर अलग-अलग व्यक्तियों से assays के exosomes की एक उल्लेखनीय बदलती एकाग्रता सुविधा हो सकती है। हालांकि, जैविक परीक्षण जांच में कणों की एकाग्रता परिणामों पर एक प्रभाव हो सकता है। इसलिए, जांच के कमजोर पड़ने के लिए एक विश्वसनीय और मानकीकृत दृष्टिकोण की जरूरत है। प्रस्तुत विधि में exosome युक्त प्लाज्मा परिधीय पूरे रक्त के 9 मिलीलीटर से उत्पन्न किया गया। अंतर centrifugation का उपयोग एक exosome गोली से पृथक किया गया कदमों1 मिलीलीटर प्लाज्मा और निलंबित exosomes की कार्यप्रणाली का नमूना में परिणाम के लिए आसुत जल 5 मिलीलीटर में निलंबित कर रहे हैं। यह पूर्व निर्धारित सेटिंग कणों का एक उचित एकाग्रता, NTA के दौरान यानी, उचित बिखराव तीव्रता के साथ हमें प्रदान किया है। मात्रा और कमजोर पड़ने पहलू के अलावा, इस्तेमाल कर रहे हैं कि समाधान की रचना महत्व का भी है। हम exosomes के अंतिम फिर से निलंबन के लिए आसुत जल का इस्तेमाल किया है। बेशक, अंतिम कमजोर पड़ने कदम के लिए विभिन्न मीडिया भी प्रयोगात्मक सेट अप की आवश्यकताओं के अनुसार, इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, एक बफरिंग क्षमता के साथ नमूनों का परीक्षण विशेष रूप से जब आयनिक-समाधान के जीटा संभावित माप, के मामले में, अशांति मुक्त परिस्थितियों में एक विवेकपूर्ण कमजोर पड़ने से उपयोगी है। कई नमूने के प्रत्यक्ष तुलना के लिए हम सभी नमूनों के लिए एक ही कमजोर पड़ने स्तर रखने की सलाह देते हैं। संवेदनशीलता और वीडियो संकल्प को छोड़कर सभी सेटिंग्स ZetaView विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके बाद में बदला जा सकता है।
<p class=लेखकों के साथ साथ शुरू की प्रणाली वर्तमान में सबसे उपयुक्त साधन का प्रतिनिधित्व करता है का मानना है कि "हालांकि jove_content">, यह केवल उपलब्ध NTA व्यवस्था नहीं है। पिछली रिपोर्टों के एक नंबर से एक ही NTA के सिद्धांतों को लागू लेकिन कुछ भिन्न सुविधाओं 10 के साथ चला जाता है कि एक और उपकरण डिजाइन प्रदान करना है कि अन्य प्रणालियों कार्यरत है। हम परिणाम का नमूना हैंडलिंग और reproducibility के विषय में व्यावहारिक पहलुओं exosome मूल्यांकन के लिए पद्धति अनुक्रम को चुनने के लिए केंद्रीय महत्व के हैं कि विश्वास करते हैं। हम यह भी एक आदर्श पहचान प्रणाली के मापन के परिणामों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि उपयोगकर्ता के आधार कारकों को समाप्त करना चाहिए कि विश्वास करते हैं। यहां प्रस्तुत किया है कि exosome विश्लेषण दृष्टिकोण एक उच्च डिग्री करने के लिए आसान से निपटने की कसौटी को पूरा। एक और लाभ के रूप में, नमूनों की अर्ध-स्वचालित विश्लेषण एक कम समय में परिणाम पैदा करने, एक तेजी से प्रक्रिया में किया जाता है। Exosomes की एक ऑनलाइन दृश्य गा करने विश्लेषक एड्सexosome विशेषताओं, जैसे, सकल एकाग्रता के एक पल विचार में।यहाँ प्रस्तुत माप तकनीक के लिए एक बहुत ही सरल लेकिन सुरुचिपूर्ण अलावा एंटीबॉडी में लेबल exosomes के उपयोग और डिटेक्टर के सामने एक पूर्ववर्ती फिल्टर का उपयोग करके बिखरे हुए लेजर बीम का कब्जा है। इस रास्ते में exosome उप-जनसंख्या एक चयनात्मक फ्लोरोसेंट धुंधला करने के लिए तकनीकी रूप से सुलभ हैं कि उनकी सतह एंटीजन और अन्य जैविक रूप से प्रासंगिक विशेषताओं के अनुसार प्रतिष्ठित किया जा सकता है।
हमारे कण ट्रैकिंग साधन के वर्तमान संस्करण का एक नुकसान यह बहुत ही उच्च संवेदनशीलता के स्तर पर इस तरह की पृष्ठभूमि शोर के रूप में कलाकृतियों सेल चैनल दीवार पर आधारित है, जो वर्तमान हो सकता है कि इस तथ्य है। मौजूदा व्यवस्था करने के लिए एक तकनीकी समाधान और सुधार के लिए निकट भविष्य में उपलब्ध हो सकता है। चैनल दीवार पर लेजर बिखराव प्रकाश की इस पद्धति का प्रतिबिंब द्वारा जिससे बढ़ रही है, कम हो जाएगा मापा संकेतों और प्राप्त डेटा और पता लगाने की सीमा को कम करने की सटीकता की।
Exosome अलगाव के लिए वर्तमान में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित और लागू कण ट्रैकिंग साधन 30 एनएम के एक कम आकार के वितरण के साथ एक उल्लेखनीय सटीक संकल्प किया जाता है, पता लगाया कणों वास्तव में पूरी तरह सच exosomes हैं कि वहाँ कोई गारंटी नहीं है। ऐसे मृत सेल टुकड़े या बड़ा प्रोटीन परिसरों के रूप में अन्य कणों भी exosome निलंबन में मौजूद हो सकता है और झूठी सकारात्मक संकेतों को जन्म दे सकती है। इस तरह के "प्रदूषण" इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम), पारेषण ईएम या स्कैनिंग ईएम या तो हो सकता है बाहर रखा जा सकता है जिसके द्वारा एक विश्वसनीय तरीका। पहले से प्रस्तावित सतह मार्करों के एक नंबर tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, आदि के 11 सहित ध्यान की एक बढ़ती हुई राशि, अर्जित किया है, हालांकि दुर्भाग्य से, exosomes के लिए कोई सामान्य और विशिष्ट मार्कर, अब तक पहचान की गई है।
"> चाहे exosome जीव विज्ञान, विशेष रूप से exosome विशिष्ट मार्करों के विषय पर अनुसंधान के भविष्य की प्रगति की है, यहाँ प्रस्तुत किया है कि प्रोटोकॉल अलगाव और exosomes का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करेगा। एकाग्रता और आकार में आसानी से एक सॉफ्टवेयर की मदद से निर्धारित किया जा सकता है सीधा फैशन। चयनात्मक फ्लोरोसेंट मार्करों या फ्लोरोफोरे युग्मित एंटीबॉडी के अलावा आगे जाने की संभावना NTA के प्रस्तुत दृष्टिकोण के संभावित अनुप्रयोगों में वृद्धि होगी।The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Name of the Reagent | |||
Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
Material Name | |||
Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |