Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En innovativ metode for Exosome Kvantifisering og størrelse måling

doi: 10.3791/50974 Published: January 17, 2015

Introduction

Den nøyaktige funksjon av sirkulerende exosomes forble ukjent for en lang tidsperiode. Selv nå den fullstendige banen mekanisme exosomes ikke er fullt ut forstått. Siden exosomes bære antigener, proteiner og RNA (mRNA og miRNA) som knytter dem til deres foreldre celle av opprinnelse, deres funksjon som celle-cellesignale sendere har hovedsakelig vært prioritert.

Mange forskjellige fremgangsmåter er blitt beskrevet i litteraturen for isolering og kvantitativ påvisning av exosomes 1,2. Imidlertid er nådd ingen enighet om en "gullstandard". Imens de fleste forskere aktive innen exosome forskning er enige om at en konsekvent metode for isolasjon er sterkt garanteres å oppnå en høyere grad av sammenlignbarhet mellom ulike rapporter og studier.

Fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) er den mest vanlige og utbredt verktøy for analyse exosome 3. FACS har benEFIT at via fluorescens merking, kan celler fra forskjellige steder sammenlignes i ett trinn. De største ulempene ved FACS er at denne metoden ikke er følsom nok til å identifisere partikler mindre enn 0,5 um 4, mens exosomes er generelt mellom 30-120 nm i diameter 5, enda mindre for å måle deres størrelse.

Scanning elektronmikroskopi (SEM) og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) det andre verktøy for analyse av partikkelstørrelse og morfologi exosomes. Men både SEM og TEM har den ulempe at fremstillingen av prøvene er tidkrevende, begge metoder involverer arbeidskrevende trinn, og hver har en viss risiko for artefakt generasjon. Hverken fremgangsmåten er egnet for høy prøvekapasitet og karakterisering av flere tusen enkeltpartikler av en prøve. Videre er en kvantitativ analyse for klinisk daglige rutine hvor prøver må ofte bli analysert samtidig eller i det minste i en svært kort periodevanskelig å utføre. Ny generasjon teknikker nå tillate oss å analysere exosomes uten forutgående intensive forberedende arbeid (for eksempel miljø SEM). Disse moderne teknikker er fortsatt ganske upraktisk for å analysere store volum suspensjoner som inneholder exosomes å fastslå gjennomsnittlig antall og størrelsesfordeling 6.

En annen meget følsom metode for visualisering og analyse av exosomes er nanopartikkel-sporing analyse (NTA). Denne fremgangsmåten utnytter to forskjellige prinsipper for fysikk. Først blir partikler detektert av lys som spres når de blir bestrålt med en laserstråle. Det andre fenomen er kjent som Brownske bevegelser, i henhold til hvilken diffusjon av forskjellige partikler i en væskesuspensjon er omvendt proporsjonal med deres størrelse. I det sistnevnte tilfelle bevegelsen avhenger også av temperaturen og viskositeten av væsken. Likevel er denne frekvensen er direkte relatert til partikkelstørrelse, og brukes av NTA. Ved hjelp av mykeware basert analyse, er digitale bilder av spredt lys fra enkeltpartikler registrert. Plott av spredt lys flekker og deres hastighet av bevegelse tilveiebringe de data som til rette for bestemmelse av totalt partikkelantall og størrelsesfordeling. Denne teknikken er spesielt kraftig for å analysere partikler med en midlere diameter på mindre enn 100 nm.

Størrelses- og konsentrasjonsmålinger utføres med ZetaView Brownske og Elektroforese Motion Video Analysis mikroskop. Dette er en semi-automatisert desk top nanopartikkelanalyseapparatet for væskeprøver (heretter referert til som partikkel-sporings instrument). Den består av partikkelsporings analysatoren, samt en bærbar datamaskin med programvare for dataanalyse. Heterogene biologiske prøver er som egner seg for denne fremgangsmåte som mer homogene suspensjoner av uorganiske partikler. En lasersprednings mikroskop med et videokamera anvendes for deteksjon av partikler og for observation av deres bevegelse. Mens mikroskopet aksen er horisontal og fokusert inn i cellen kanal fylt med en suspensjon inneholdende exosomes, blir laserstrålen orientert vertikalt. Partiklene bestrålt av laser scatter lyset, som er ført under 90 ° ved et digitalt videokamera via mikroskop (figur 1). Intensiteten av det spredte lys tillater observasjon av partikler som er større 60 nm i diameter. I en slik innstilling lysstyrken for en partikkel er ikke den eneste indikasjon av partikkelstørrelse. Når ingen elektriske felt påtrykkes bare følger partikkelbevegelse Brownske bevegelser, og kan tjene som en indikator for beregning av partikkelstørrelse. Imidlertid er instrumentet også i stand til å påtrykke et elektrisk felt på tvers av cellekanalen. Når den utsettes for dette feltet, potensialet, polaritet og nivå av ionisk-ladning for suspenderte exosomes bli ytterligere faktorer som bestemmer retningen av deres bevegelse. Fart og retning resultat i et elektro moheten histogram.

Mens å finne en optimal metode for å analysere isolerte exosomes er ett problem, ligger en annen i effektiv isolering av exosomes fra ulike medier, for eksempel blod, ascites, urin, melk, fostervann eller celle media. Forskjellige metoder er blitt beskrevet så langt, som er basert på ultrasentrifugering 1, 7, trinn industrielle separasjons reagenser (for eksempel Exoquick) magnetiske kuler for antigen ved anvendelse av separasjons 8 eller 9 ultrafiltrering.

I denne protokollen viser vi hele prosessen med exosome isolasjon via ultrasentrifugering og viser hvordan å analysere den resulterende exosome inneholder suspensjon via partikkel sporing instrument. Spesielle hensyn analyse av humant plasma eller cellekultur mellom avledet exosomes er gitt.

Protocol

MERK: Forsøkene som presenteres i dette arbeidet har blitt godkjent av den institusjonelle etisk styret for Universitetet i Düsseldorf.

1. Exosome Forberedelse

  1. Samle helblod i 3 citrat rør via venepunktering (totalt 9 ml). Hell blod inn i et 15 ml Falcon-rør.
  2. Sentrifugere prøven ved 1500 xg i 20 min ved 4 ° C for å initiere separering av celler fra plasma. Overfør supernatanten til et nytt 15 ml Falcon-rør.
  3. Sentrifugere prøven ved 2800 xg i 20 min ved 4 ° C for å fjerne alle celler fra plasma (cellefritt plasma, CFP). Overfør CFP ultrasentrifugering rør, 1 ml per rør.
  4. Sentrifuger ved 100 000 xg i 90 min ved 4 ° C for å utarme exosomes. Fjern 900 mL av supernatant. Re-suspendere pellet i de resterende 100 pl i ultracentrifugation tube. Legg 900 mL PBS.
  5. Sentrifuger på nytt ved 100.000 xg i 30 min ved 4 ° C. Fjern 900 mL av supernatant. Re-suspendere pellet med de resterende 100 mL.
  6. Transfer 5 til 20 mL av re-suspensjon i 40 ml destillert vann. Filtrere suspensjonen gjennom et 450 nm filter for å separere exosomes fra større partikler. Bruk denne endelige suspensjon for partikkelmåling.

2. Oppstart Prosedyre for Particle Tracking Instrument

  1. Start programmet ved å dobbeltklikke på programvare-ikonet. Klikk på de ulike programvare faner ("Cell Check", "Måling", "Analysis") for å bytte mellom dem hele protokollen.
  2. Følg instruksjonene på skjermen for en automatisert gjennomføring av oppstartsprosessen. Velg boksene for både cellekvalitetssjekk og auto justering.
    MERK: Hver av disse trinnene kan gjentas separat om nødvendig ved å trykke på knappen (A) eller (B) på "celle check" -kategorien.
  3. Åpne innløps- og utløpssiden av NTA instrument og injisere 10 ml destillert vann ved å sprøyte inn i cellen kanalen gjennom innløpsporten. Lukke utløpsporten som den siste mengden av vann som blir injisert. Plassere et begerglass under utløpsåpningen for å samle avfall løsning. Kontroller at målecellen er fri for luftbobler og ikke sprøyte luftbobler inn i systemet. Lukke innløpsporten umiddelbart.
  4. Utføre cellen kvalitetskontroll ved å klikke på "OK". Programvaren vil vise celle kvalitet resultater etter et par sekunder.
  5. Hvis noen partikler er fortsatt visualisert i live-view skjermen av programvaren eller hvis resultatet av kvalitetskontrollen er bare bra eller dårlig, er gjenta trinn 2,3 inntil de resterende partikler fjernes fra målecellen. Gjentar også trinn 2.3 etter hver måling for å unngå opphopning av partikler. Hvis gjenta destillert vann injeksjon og celle sjekk produserer ikke en "god" utfallet, fortsett til 2.9.
  6. Forberede en kontroll suspensjon inneholder uniform 200 nm størrelse polystyrene partikler som skal brukes for å justere foci av laseren og mikroskop. Tilsett en dråpe suspensjonskonsentratet, levert av instrumentprodusenten, til 500 ml destillert vann for å få den nødvendige konsentrasjonen slik at 600 ± 100 partikler vises per skjerm i live-view.
  7. Injiser innretting suspensjonen inn i NTA instrument som beskrevet i trinn 2.3. Trykk "OK" for å starte automatisk justering, en automatisert rutine der vil systemet automatisk finne den optimale plasseringen av de to brennpunktene.
  8. Når det vises en melding som sier at systemet er nå klar for eksperimenter, klikk på OK for å starte målingen.
  9. Av og rengjøre celle kanal manuelt mellom eksperimenter ved å spyle cellen med en 30% oppløsning av etanol. Rengjør kanalen når programvaren viser en automatisk feilrapport.

3. Måling av Sample

  1. Skyll kanal med destillert vann før each prøvemåling (som beskrevet i trinn 2.3).
  2. Injiser exosome suspensjon (fremstilt i avsnitt 1) ​​i den kanal, som beskrevet i trinn 2.3.
  3. Juster følgende hovedparametrene i programvaren som trengs:
    1. Følsomhet. For å finne den optimale følsomhetsområde, klikk på knappen "Antall Partikler vs. Sensitivity" for å vise en kurve for målte partikler per skjermbilde for ulike følsomhetsnivåer. Valgte en følsomhetsnivå før den maksimale helningen på kurven. En høyere følsomhet nivå tillater visualisering av flere små partikler, men øker også spørsmål knyttet til bakgrunnsstøy.
    2. Minimum lysstyrke. Valgte en start lysstyrke på 20 for exosome måling for å bruke denne funksjonen som et filter. Regulere denne parameteren opp til tomme ut sterkt lys-spredning partikler. Regulere det ned til å forsterke svakt spredning gjenstander. Variere lysstyrken etter behov gjennom hele eksperimentet.
      MERK: Partikler som lys-Scatter for sterkt overlapper og kan bli ekskludert fra analysen ved en feiltakelse.
    3. Min og Maks størrelse. Still et digitalt filter for å eliminere støy og piksel uønsket spredning av overdimensjonerte partikler ved å regulere de minimums- og maksimumsstørrelse. Bruke et utvalg av 10 til 500 piksler for måling av exosomes.
    4. Lukkeren. Juster tid at kameraet er åpent til 1/300 sek.
  4. Leve lest ut parametere:
    1. Veksle mellom en digital og en analog visning modus når som helst ved å klikke på "Live-image" -knappen.
    2. Gjennom hele forsøket, overvåke spredning Intensitet bar, som viser metnings status av prøven som et fargekodet indikator. Ikke analyser exosomes hvis spredning linjen er rød. I et slikt tilfelle ytterligere fortynne prøven for å unngå dette fenomen. Hvis den eksperimentelle tilstand forbyr en manipulasjon av prøvesuspensjonen, ned-regulere følsomheten eller opp-regulerer lysstyrken i programvaren-sinns å forbedre måleresultatene.
      MERK: Når prøver med en ekstremt høy konsentrasjon av partikler blir analysert scatter vil sikring individuelle partikler og de er regnet som en enkelt partikkel.
    3. Legg merke til antall partikler telles i synsfeltet fra displayet.
  5. Klikk på "Measurement" -kategorien.
  6. Velg innstillinger i "Kjør alternativer" array.
    1. Før hvert kjøp, velg "check bevegelse 'for en gjentatt sjekk partikkel drift test. Utfør testen minst én gang før du starter hele analysen. Hvis drift er høyere enn 20 mikrometer / sek, vente før du fortsetter målingen slik at prøven stopper strømmer.
    2. Velge antall eksperimenter (5), og tidsforsinkelsen mellom dem (0).
    3. Utføre en "sample sjekk" om nødvendig. Denne testen er en del av auto justering i oppstartsprosedyren og kan gjentas etterpå som trengs.
    4. Til slutt klikker du på "kjøre video oppkjøpet" -knappen. I det nye vinduet, definere antall sykluser (15) og antall målepunkter (11).
      MERK: laserhodet og mikroskopet kan beveges for å analysere partikkelnummeret ved 11 forskjellige posisjoner. Avhengig av den eksperimentelle etterspørsel, bestemme om forsøket bør utføres på en enkelt stilling eller på forskjellige posisjoner.
      1. Bekreft minimal tid varighet en partikkel har spores å bli regnet som én enkelt partikkel ved å sette videooppløsning (lav). En lavere oppløsning resulterer i en kortere relativ varighet.
      2. Velg en fil-navn og klikk på "OK" for å starte målingen.

    4. Tolkning av resultatene

    1. Se følgende resultater og parametere som vises etter målingen på "resultater" -kategorien: (1) totale antall partikler spores, (2) gjennomsnittlig antall delicles pr stilling, og (3) partikkelkonsentrasjon.
      1. Se resultatet gjennomsnittlig tabell for tallforholdet mellom partikkelstørrelse (diameter, overflate og volum) til den prosentandel av partikkeltall, så vel som verdier for middelverdi og standard differensiering.
      2. Bruk av topp analysetabell hvis mer enn én topp finnes i grafisk analyse. Denne tabellen viser fordelingen av partikler som er mindre enn den første eller henholdsvis andre topp.
    2. Se grafen beregnes etter måling for å se en fordeling av partikler etter størrelse. Bruk ikonene i visningsmodus og over grafen for å endre innstillingene.

Representative Results

Prøven som brukes for denne demonstrasjonen viser en optimal innstilling for måling med en sensitivitet på 85%, før den maksimale helningen av følsomhetskurve (figur 2). Lysstyrken, det min / maks verdier ble valgt som anbefalt i protokollen. En konsentrasjon på 5,3 partikler / ml x 10 6, ble målt, og den midlere størrelse av partiklene var 0,149 um, de fleste av dem var 0,137 um.

De mottatte etter måleverdier kan lagres i en rapport med et filformat .pdf eller som en .txt for eksport i en database. Diagrammet kan justeres som foretrukket som beskrevet i protokollen (seksjon 4). Videosekvensen blir også lagret og kan brukes for senere off-line re-analyse. Men i en slik off-line analyse, pre-oppkjøp innstillinger i kameraet kan ikke endres i ettertid.

For å finne de optimale parameterinnstillingene for en måling, vi her beskrive the optimalisering av instrumentinnstillingene på eksempel på en 100 nm polystyren størrelse standard. Påvirkningen av to parametere, sensitivitet og min / max størrelse på videobildet, og partikkelstørrelsesfordelingen er diskutert i detalj. Alle andre parametere er oppsummert i tabell 1.

Et visuelt inntrykk av virkningen av følsomhet (varierer 50-94) på analoge og digitale bilder er visualisert i Figur 3. Den kvantitative opplysninger hentet fra bildene som er presentert i Figur 4, basert på innstillingene i tabell 1, Min Size = 5 og Max Size = 200. Et typisk forhold mellom antallet detekterte partikler vs. følsomhet er vist i figur 4A. Mellom 50 og 90, økte antall oppdaget partikler med følsomhet og økte dramatisk for følsomhet> 90. Et optimalt område på sensitivitet ble funnet mellom 66 og 86 (A). Partikkelstørrelsesfordelingen oppnådd med diflige følsomhetsinnstillinger er vist i figur 4B. Partikkelstørrelsesfordelingen representerer gjennomsnittet av tre enkeltmålinger. For for lav sensitivitet (følsomhet = 62, rød kurve) bare noen få partikler ble analysert resulterer i heller dårlig statistikk. Antall analyserte partikler økte med følsomhet og nådde et optimalt mellom 70 (gul kurve) og 86 (tan kurve). Ytterligere økning av følsomheten føre til en forringelse av partikkelstørrelsesfordeling med antallet partikler faller og størrelsesfordeling skiftende mot mindre størrelser (sensitivitet = 94, blå kurve). Figur 4C viser utviklingen av antallet basert x50 diameteren (50% av partiklene er mindre enn denne diameter) som en funksjon av følsomhet. I beige intervall, RSD av partikkelstørrelsen var mindre enn 8% og tilsvarer den optimale intervall i A. De røde områdene indikerer RSD> 8% som følge av dårlig statistikk (sensitivitet for lavt) eller bred distributions med skift til mindre størrelser (sensitivitet for høy).

Innstillingene fra Min Størrelse og Max størrelse er filtre som brukes på digitale bilder for å fjerne partikler med spot størrelser mindre enn Min Størrelse og større enn Max størrelse. På grunn av evnen til å spre lys, skaper en partikkel en flekk av en viss størrelse på et digitalt bilde. Størrelsen på stedet måles som antall piksler (px). Når en partikkel sprer lyset godt (f.eks partikler> 200 nm eller aggregater), er spot størrelse ganske stor, f.eks> 500 px. Den punktstørrelse er ganske liten (f.eks, <10 px) for små partikler (for eksempel <20 nm), avhengig av partikkelmaterialet. Punktstørrelse (px), kan ikke byttes om med partikkelstørrelse (nm) som de ikke er identiske, og det ikke er noen direkte sammenheng mellom disse to variablene. En optimalisering av Min og Max størrelse gjør at brukeren kan filtrere ut uønskede gjenstander som agglomerater (Maks størrelse) eller litengjenstander som bakgrunnsstøy (Min størrelse). Påvirkningen av Min / max størrelse på partikkelstørrelsesfordelingen for en 100 nm størrelse standard er vist i figur 4D (følsomhet = 82). Når intervallet er satt til små spot størrelser (f.eks min = 1, maks = 52; oransje kurve), antall analyserte partikler reduseres og antall basert x50 diameteren er litt forskjøvet mot mindre størrelser. En innstilling for større flekker (min = 40, maks = 1000; rød kurve) resulterer i en bred partikkelstørrelsesfordelingen forskyves mot større størrelser. For å oppnå like totale antall partikler, ble intervall grensene for både orange og røde fordelinger justeres for å passe 80 partikler. Fordelingen med optimale innstillinger (min = 5, max = 200; tan kurve) består av 360 partikler.

En rekke vellykkede forsøk ble utført med exosomes isolert ved ultrasentrifugering, og målt ved hjelp av NTA presentert systemet. De resulterende data ble sterktkonsistent og bekreftet en høy grad av reproduserbarhet. Andre isoleringsmetoder bør vise tilsvarende resultater. Imidlertid ble fortynningen identifisert som en spesielt kritisk punkt og dens innvirkning på den beregnede totale antallet partikler må revurderes.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk av oppsettet av NTA. Mikroskopet / video-aksen og laserstrålen er orientert ortogonalt med hverandre, krysser hverandre i cellen kanaltverrsnitt. Lys spredt av partikler vises i "live-view" vindu av programvaren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Effekt av følsomhet på analog og digital bilde. Visualisering av partikler på live view skjermen vises for følsomheter mellom 50 og 94 for både analog (øverste rad) enD Digital (nederste rad) utsikt. Når følsomheten er for lav, er det bare noen få partikler oppdaget (til venstre). Med optimal sensitivitet vises partiklene som enkelt prikker godt isolert fra hverandre (i midten). Til en relativt høy følsomhet partiklene smelter sammen fører til dårlig bildekvalitet (til høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Påvirkning av følsomhet min og max størrelse innstillinger for en kontroll 100 nm polystyren partikkelprøve (A) Plot av sensitivitet versus oppdaget antall partikler.; den optimale intervall er 66 til 86, før den maksimale helning av kurven. (B) Partikkelstørrelsesfordelingen oppnådd med flere følsomhetsinnstillinger (62-94); grafer for for lav (62) eller for høy do (94) følsomhet ikke fange opp partikkelstørrelsesfordelingen for de 100 nm polystyren kontrollprøve. (C) Antall basert x50 diameter versus følsomhet; feilen av x50 i beige intervallet er mindre enn 8%, er optimale intervallet fra 66 til 86. (D) Effekt av Min og Max størrelse på partikkelstørrelsesfordeling; optimale parametere (min = 5 og max = 200) fange riktig fordeling for kontrollutvalget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Pre-oppkjøpet parametere
Følsomhet variabel
Shutter 40
Bildefrekvens 30 fps
Oppløsning Heigh
Sykluser 10
Flere oppkjøp 3
Posisjon 1
Etter oppkjøpet parametere
Min Lysstyrke 30
Maks størrelse variabel
Min Størrelse variabel

Tabell 1. Sammendrag av pre- og post-oppkjøpet parametere for innstilling av partikkel sporing instrument.

Discussion

Vi viser en detaljert protokoll for exosome isolert fra blod og liggende nanopartikkel sporing som en ny og innovativ fremgangsmåte for å måle exosome størrelse og konsentrasjon i en biologisk væske. I de presenterte eksperimenter humant perifert blod ble brukt som opprinnelsen til exosomes. Imidlertid kan andre opprinnelse, slik som urin, spytt, cellekultursupernatant, etc., også anvendes som testmateriale.

Basert på den biologiske variasjonen av exosome konsentrasjon hos mennesker, kan analyser fra forskjellige individer har en bemerkelsesverdig varierende konsentrasjon av exosomes. Imidlertid kan konsentrasjonen av partikler i den biologiske testprobe ha en innvirkning på resultatene. Derfor er en pålitelig og standardmetode for fortynning av prober er nødvendig. I det presenterte fremgangsmåte exosome inneholder plasma ble generert fra 9 ml perifert helblod. Ved hjelp av differensialsentrifugering trinn en exosome pellet ble isolert fra1 ml plasma og resuspendert i 5 ml destillert vann for å føre arbeids prøve av suspenderte exosomes. Denne forhåndsdefinert innstilling har gitt oss en skikkelig konsentrasjon av partikler, dvs. passende scatter intensitet under NTA. Ved siden av volum og fortynning aspekt, er sammensetningen av de løsningene som brukes også av betydning. Vi har brukt destillert vann for den endelige re-suspensjon av exosomes. Selvfølgelig kan forskjellige medier for den endelige fortynning trinnet også anvendes, i henhold til kravene i det eksperimentelle oppsett. Imidlertid, i tilfelle av zeta-potensialmålinger av ioniske-løsninger, spesielt når testprøver med en bufferkapasitet, er anvendelige en forsiktig fortynning i turbulensfrie forhold. For direkte sammenligning av flere prøver anbefaler vi å holde den samme fortynning nivå for alle prøvene. Alle innstillinger unntatt følsomheten og videooppløsningen kan endres etterpå ved hjelp av ZetaView Analyse programvare.

10. Vi tror at praktiske aspekter vedrørende prøvehåndtering og reproduserbarhet av resultatene er av sentral betydning i valg av metodisk sekvens for exosome evaluering. Vi tror også at en ideell detection system bør fjerne bruker avhengig faktorer som kan forstyrre resultatene av målingene. Den exosome analyse tilnærming som presenteres her oppfyller kriteriet for enkel håndtering i høy grad. Som en ytterligere fordel er det semi-automatisert analyse av prøvene utført på en rask prosess, gir resultater i løpet av kort tid. En online visualisering av exosomes hjelpemidler analysatoren til gapå et øyeblikk idé om exosome egenskaper, for eksempel, brutto konsentrasjon.

En meget enkel, men elegant tillegg til den måleteknikk som presenteres her er bruken av antistoff merket exosomes og innfanging av det spredte laserstråle ved hjelp av en foregående filter foran detektoren. På denne måte exosome subpopulasjoner kan identifiseres i henhold til deres overflateantigener og andre biologisk relevante egenskaper som er teknisk tilgjengelige for en selektiv fluorescerende farging.

En ulempe ved den nåværende versjon av vår partikkelsporings instrument er det faktum at ved meget høye nivåer for følsomhet gjenstander som for eksempel bakgrunnsstøy kan være til stede, som er basert på cellekanalveggen. En teknisk løsning og forbedring av dagens system kan bli tilgjengelig i nær fremtid. Ved denne metoden refleksjoner av laserspredningslyset på kanalveggen vil bli redusert, og dermed øke nøyaktigheten av de målte signalene og oppnådde data og senke påvisningsgrensen.

Selv om det i dag brukt protokoll for exosome isolasjon er godt etablert og anvendt partikkel sporing instrument har en usedvanlig presis oppløsning med en lavere størrelsesfordeling på 30 nm, er det ingen garanti for at de oppdaget partikler er faktisk helt sant exosomes. Andre partikler, slik som døde cellefragmenter eller større proteinkomplekser kan også være til stede i suspensjonen exosome og føre til falske positive signaler. En pålitelig fremgangsmåte hvorved slike "forurensning" kan utelukkes, kan være elektronmikroskopi (EM), enten overførings EM eller skanning EM. Dessverre har ingen generell og spesifikk markør for exosomes blitt identifisert så langt, selv om en rekke tidligere foreslåtte overflatemarkører har fått en økende mengde oppmerksomhet, inkludert tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, etc. 11.

"> Uavhengig av framtidig utvikling av forskning på exosome biologi, spesielt angå exosome spesifikke markører, vil protokollen som er presentert her gir en kraftig metode for isolering og påvisning av exosomes. Kan Konsentrasjon og størrelse lett bestemmes i en software-assistert grei måte. Tilsetting av selektive fluorescerende markører eller fluoroforpar kombinert antistoffer vil trolig ytterligere styrke de mulige anvendelser av den presenterte tilnærming av NTA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Citrate tube BD 364305 BD Vacutainer
Distilled water Braun 3880087 Aqua ad iniectabilia
Falcon tube Greiner Bio One 188271 PP Tube, Steril 15 ml
Ultracentrifugation tube Beckman 357448 Microfuge Tube Polyallomer 1.5 ml
Polybead Polysciences, Inc. 07304 2.6% Solids-Latex
Alignment Solution
Syringe (Filter) Braun 4617053V 5 ml
Syringe (ZetaView) Braun 4606051V 5 ml
Needle BD 305180 BD Blunt Fill Needle
Filter Sartorius Stedim 16555 Syringe filter, hydrophilic, 450 µm
Ultracentrifuge Beckman L8-M Rotor: 70Ti Ser. No E21078
ZetaView Particle Metrix PMX 100, Type 101
Centrifuge Eppendorf 5804R Rotor: A-4-44

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. (3.22), (2006).
  2. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).
  3. Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. e3037 (2012).
  4. Konokhova, A. I., et al. Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles. Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).
  5. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).
  6. Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).
  7. Exoquick, ExoQuick-TC and ExoQuick-LP. Polymer-based exosome preciption. System Biosciences. Available from: http://www.systembio.com/microrna-research/exoquick-exosomes/overview (2015).
  8. Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).
  9. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).
  10. Carr, B., Warren, J. Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology. Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).
  11. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. International immunology. 17, 879-887 (2005).
En innovativ metode for Exosome Kvantifisering og størrelse måling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mehdiani, A., Maier, A., Pinto, A., Barth, M., Akhyari, P., Lichtenberg, A. An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement. J. Vis. Exp. (95), e50974, doi:10.3791/50974 (2015).More

Mehdiani, A., Maier, A., Pinto, A., Barth, M., Akhyari, P., Lichtenberg, A. An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement. J. Vis. Exp. (95), e50974, doi:10.3791/50974 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter