A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Den nøyaktige funksjon av sirkulerende exosomes forble ukjent for en lang tidsperiode. Selv nå den fullstendige banen mekanisme exosomes ikke er fullt ut forstått. Siden exosomes bære antigener, proteiner og RNA (mRNA og miRNA) som knytter dem til deres foreldre celle av opprinnelse, deres funksjon som celle-cellesignale sendere har hovedsakelig vært prioritert.
Mange forskjellige fremgangsmåter er blitt beskrevet i litteraturen for isolering og kvantitativ påvisning av exosomes 1,2. Imidlertid er nådd ingen enighet om en "gullstandard". Imens de fleste forskere aktive innen exosome forskning er enige om at en konsekvent metode for isolasjon er sterkt garanteres å oppnå en høyere grad av sammenlignbarhet mellom ulike rapporter og studier.
Fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) er den mest vanlige og utbredt verktøy for analyse exosome 3. FACS har benEFIT at via fluorescens merking, kan celler fra forskjellige steder sammenlignes i ett trinn. De største ulempene ved FACS er at denne metoden ikke er følsom nok til å identifisere partikler mindre enn 0,5 um 4, mens exosomes er generelt mellom 30-120 nm i diameter 5, enda mindre for å måle deres størrelse.
Scanning elektronmikroskopi (SEM) og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) det andre verktøy for analyse av partikkelstørrelse og morfologi exosomes. Men både SEM og TEM har den ulempe at fremstillingen av prøvene er tidkrevende, begge metoder involverer arbeidskrevende trinn, og hver har en viss risiko for artefakt generasjon. Hverken fremgangsmåten er egnet for høy prøvekapasitet og karakterisering av flere tusen enkeltpartikler av en prøve. Videre er en kvantitativ analyse for klinisk daglige rutine hvor prøver må ofte bli analysert samtidig eller i det minste i en svært kort periodevanskelig å utføre. Ny generasjon teknikker nå tillate oss å analysere exosomes uten forutgående intensive forberedende arbeid (for eksempel miljø SEM). Disse moderne teknikker er fortsatt ganske upraktisk for å analysere store volum suspensjoner som inneholder exosomes å fastslå gjennomsnittlig antall og størrelsesfordeling 6.
En annen meget følsom metode for visualisering og analyse av exosomes er nanopartikkel-sporing analyse (NTA). Denne fremgangsmåten utnytter to forskjellige prinsipper for fysikk. Først blir partikler detektert av lys som spres når de blir bestrålt med en laserstråle. Det andre fenomen er kjent som Brownske bevegelser, i henhold til hvilken diffusjon av forskjellige partikler i en væskesuspensjon er omvendt proporsjonal med deres størrelse. I det sistnevnte tilfelle bevegelsen avhenger også av temperaturen og viskositeten av væsken. Likevel er denne frekvensen er direkte relatert til partikkelstørrelse, og brukes av NTA. Ved hjelp av mykeware basert analyse, er digitale bilder av spredt lys fra enkeltpartikler registrert. Plott av spredt lys flekker og deres hastighet av bevegelse tilveiebringe de data som til rette for bestemmelse av totalt partikkelantall og størrelsesfordeling. Denne teknikken er spesielt kraftig for å analysere partikler med en midlere diameter på mindre enn 100 nm.
Størrelses- og konsentrasjonsmålinger utføres med ZetaView Brownske og Elektroforese Motion Video Analysis mikroskop. Dette er en semi-automatisert desk top nanopartikkelanalyseapparatet for væskeprøver (heretter referert til som partikkel-sporings instrument). Den består av partikkelsporings analysatoren, samt en bærbar datamaskin med programvare for dataanalyse. Heterogene biologiske prøver er som egner seg for denne fremgangsmåte som mer homogene suspensjoner av uorganiske partikler. En lasersprednings mikroskop med et videokamera anvendes for deteksjon av partikler og for observation av deres bevegelse. Mens mikroskopet aksen er horisontal og fokusert inn i cellen kanal fylt med en suspensjon inneholdende exosomes, blir laserstrålen orientert vertikalt. Partiklene bestrålt av laser scatter lyset, som er ført under 90 ° ved et digitalt videokamera via mikroskop (figur 1). Intensiteten av det spredte lys tillater observasjon av partikler som er større 60 nm i diameter. I en slik innstilling lysstyrken for en partikkel er ikke den eneste indikasjon av partikkelstørrelse. Når ingen elektriske felt påtrykkes bare følger partikkelbevegelse Brownske bevegelser, og kan tjene som en indikator for beregning av partikkelstørrelse. Imidlertid er instrumentet også i stand til å påtrykke et elektrisk felt på tvers av cellekanalen. Når den utsettes for dette feltet, potensialet, polaritet og nivå av ionisk-ladning for suspenderte exosomes bli ytterligere faktorer som bestemmer retningen av deres bevegelse. Fart og retning resultat i et elektro moheten histogram.
Mens å finne en optimal metode for å analysere isolerte exosomes er ett problem, ligger en annen i effektiv isolering av exosomes fra ulike medier, for eksempel blod, ascites, urin, melk, fostervann eller celle media. Forskjellige metoder er blitt beskrevet så langt, som er basert på ultrasentrifugering 1, 7, trinn industrielle separasjons reagenser (for eksempel Exoquick) magnetiske kuler for antigen ved anvendelse av separasjons 8 eller 9 ultrafiltrering.
I denne protokollen viser vi hele prosessen med exosome isolasjon via ultrasentrifugering og viser hvordan å analysere den resulterende exosome inneholder suspensjon via partikkel sporing instrument. Spesielle hensyn analyse av humant plasma eller cellekultur mellom avledet exosomes er gitt.
Vi viser en detaljert protokoll for exosome isolert fra blod og liggende nanopartikkel sporing som en ny og innovativ fremgangsmåte for å måle exosome størrelse og konsentrasjon i en biologisk væske. I de presenterte eksperimenter humant perifert blod ble brukt som opprinnelsen til exosomes. Imidlertid kan andre opprinnelse, slik som urin, spytt, cellekultursupernatant, etc., også anvendes som testmateriale.
Basert på den biologiske variasjonen av exosome konsentrasjon hos mennesker, kan analyser fra forskjellige individer har en bemerkelsesverdig varierende konsentrasjon av exosomes. Imidlertid kan konsentrasjonen av partikler i den biologiske testprobe ha en innvirkning på resultatene. Derfor er en pålitelig og standardmetode for fortynning av prober er nødvendig. I det presenterte fremgangsmåte exosome inneholder plasma ble generert fra 9 ml perifert helblod. Ved hjelp av differensialsentrifugering trinn en exosome pellet ble isolert fra1 ml plasma og resuspendert i 5 ml destillert vann for å føre arbeids prøve av suspenderte exosomes. Denne forhåndsdefinert innstilling har gitt oss en skikkelig konsentrasjon av partikler, dvs. passende scatter intensitet under NTA. Ved siden av volum og fortynning aspekt, er sammensetningen av de løsningene som brukes også av betydning. Vi har brukt destillert vann for den endelige re-suspensjon av exosomes. Selvfølgelig kan forskjellige medier for den endelige fortynning trinnet også anvendes, i henhold til kravene i det eksperimentelle oppsett. Imidlertid, i tilfelle av zeta-potensialmålinger av ioniske-løsninger, spesielt når testprøver med en bufferkapasitet, er anvendelige en forsiktig fortynning i turbulensfrie forhold. For direkte sammenligning av flere prøver anbefaler vi å holde den samme fortynning nivå for alle prøvene. Alle innstillinger unntatt følsomheten og videooppløsningen kan endres etterpå ved hjelp av ZetaView Analyse programvare.
<p class="Jove_content"> Selv om forfatterne mener at det her innført systemet representerer i dag den mest egnet instrument, er det ikke den eneste tilgjengelige NTA system. En rekke tidligere rapporter har ansatt andre systemer som gjelder de samme NTA prinsipper, men gir et annet instrument design som går sammen med noen forskjellige funksjoner 10. Vi tror at praktiske aspekter vedrørende prøvehåndtering og reproduserbarhet av resultatene er av sentral betydning i valg av metodisk sekvens for exosome evaluering. Vi tror også at en ideell detection system bør fjerne bruker avhengig faktorer som kan forstyrre resultatene av målingene. Den exosome analyse tilnærming som presenteres her oppfyller kriteriet for enkel håndtering i høy grad. Som en ytterligere fordel er det semi-automatisert analyse av prøvene utført på en rask prosess, gir resultater i løpet av kort tid. En online visualisering av exosomes hjelpemidler analysatoren til gapå et øyeblikk idé om exosome egenskaper, for eksempel, brutto konsentrasjon.En meget enkel, men elegant tillegg til den måleteknikk som presenteres her er bruken av antistoff merket exosomes og innfanging av det spredte laserstråle ved hjelp av en foregående filter foran detektoren. På denne måte exosome subpopulasjoner kan identifiseres i henhold til deres overflateantigener og andre biologisk relevante egenskaper som er teknisk tilgjengelige for en selektiv fluorescerende farging.
En ulempe ved den nåværende versjon av vår partikkelsporings instrument er det faktum at ved meget høye nivåer for følsomhet gjenstander som for eksempel bakgrunnsstøy kan være til stede, som er basert på cellekanalveggen. En teknisk løsning og forbedring av dagens system kan bli tilgjengelig i nær fremtid. Ved denne metoden refleksjoner av laserspredningslyset på kanalveggen vil bli redusert, og dermed øke nøyaktigheten av de målte signalene og oppnådde data og senke påvisningsgrensen.
Selv om det i dag brukt protokoll for exosome isolasjon er godt etablert og anvendt partikkel sporing instrument har en usedvanlig presis oppløsning med en lavere størrelsesfordeling på 30 nm, er det ingen garanti for at de oppdaget partikler er faktisk helt sant exosomes. Andre partikler, slik som døde cellefragmenter eller større proteinkomplekser kan også være til stede i suspensjonen exosome og føre til falske positive signaler. En pålitelig fremgangsmåte hvorved slike "forurensning" kan utelukkes, kan være elektronmikroskopi (EM), enten overførings EM eller skanning EM. Dessverre har ingen generell og spesifikk markør for exosomes blitt identifisert så langt, selv om en rekke tidligere foreslåtte overflatemarkører har fått en økende mengde oppmerksomhet, inkludert tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, etc. 11.
"> Uavhengig av framtidig utvikling av forskning på exosome biologi, spesielt angå exosome spesifikke markører, vil protokollen som er presentert her gir en kraftig metode for isolering og påvisning av exosomes. Kan Konsentrasjon og størrelse lett bestemmes i en software-assistert grei måte. Tilsetting av selektive fluorescerende markører eller fluoroforpar kombinert antistoffer vil trolig ytterligere styrke de mulige anvendelser av den presenterte tilnærming av NTA.The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Name of the Reagent | |||
Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
Material Name | |||
Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |