Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En innovativ metod för Exosome Kvantifiering och storlek Measurement

doi: 10.3791/50974 Published: January 17, 2015

Introduction

Den exakta funktionen av cirkulerande exosomer förblev okänd för en lång tid. Redan nu hela sökvägen mekanismen exosomes inte är helt klarlagd. Eftersom exosomes bär antigener, proteiner och RNA (mRNA och miRNA) som relaterar dem till sin föräldracell ursprungsland, deras funktion som cell-cell signalering sändare har främst prioriteras.

Många olika metoder har beskrivits i litteraturen för isolering och kvantitativ detektering av exosomer 1,2. Dock har ingen konsensus om en "gold standard" nåtts. Samtidigt majoriteten av forskare verksamma inom Exosome forskningen överens om att en konsekvent metod för isolering är starkt motiverat för att uppnå en högre grad av jämförbarhet mellan olika rapporter och studier.

Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) är den vanligaste och utbredda verktyg för Exosome analys 3. FACS har benbestämda att, via fluorescensmärkning, kan celler från olika ursprung jämföras i ett steg. De största nackdelarna med FACS är att denna metod inte är tillräckligt känslig för att identifiera partiklar mindre än 0,5 um 4, medan exosomes är i allmänhet mellan 30-120 nm i diameter 5, ännu mindre att mäta deras storlek.

Svepelektronmikroskopi (SEM) och transmissionselektronmikroskopi (TEM) är andra verktyg för analys av partikelstorlek och morfologi av exosomer. Men både SEM och TEM har nackdelen att framställningen av prover är tidskrävande, båda metoderna involverar arbetsintensiva steg och var och en har en viss risk för artefakt generationen. Varken metod är lämplig för hög provgenomströmning och karakterisering av flera tusen enskilda partiklar av ett prov. Dessutom, en kvantitativ analys för klinisk daglig rutin där prover måste ofta analyseras samtidigt eller åtminstone i en mycket kort period ärsvåra att utföra. Nya generationens teknik tillåter nu att vi kan analysera exosomes utan föregående intensivt förberedelsearbete (t.ex. miljö SEM). Dessa moderna tekniker är fortfarande ganska obekvämt för att analysera stora volymer suspensioner innehållande exosomes att bestämma deras genomsnittliga antalet och storleksfördelning 6.

En annan mycket känslig metod för visualisering och analys av exosomes är nanopartikel-tracking analys (NTA). Denna metod utnyttjar två olika principer för fysik. Först, är partiklar som detekteras av det ljus som sprids när de bestrålas med en laserstråle. Det andra fenomenet är känt som Brownsk rörelse, enligt vilken diffusion av olika partiklar i en vätskesuspension är omvänt proportionell till deras storlek. I det senare fallet rörelsen beror också på temperaturen och viskositeten hos vätskan. Ändå är denna hastighet direkt relaterad till partikelstorlek och används av NTA. Använda mjukaware baserad analys, är digitala bilder av spritt ljus från enstaka partiklar registreras. Tomter för spridda ljusfläckar och deras rörelsehastighet ger de data som underlättar bestämningen av totalantal partikel och storleksfördelning. Denna teknik är särskilt kraftfull för att analysera partiklar med en medeldiameter av mindre än 100 nm.

Mätningarna storlek och koncentration sker med ZetaView Brownsk och elektrofores Motion Video Analysis Mikroskop. Detta är en halvautomatiserad skrivbords nanoparticle analysinstrument för vätskeprover (nedan kallad partikelspårningsinstrument). Den består av partikelspårning analysatorn samt en bärbar dator med programvara som används för dataanalysen. Heterogena biologiska prover är så lämpliga för denna metod som mer homogena suspensioner av oorganiska partiklar. En laserspridning mikroskop med en videokamera används för detektion av partiklar och för observation av deras rörelse. Medan mikroskopaxeln är horisontell och fokuseras in i cellen kanalen fylld med en suspension innehållande exosomer, är laserstrålen orienterad vertikalt. Partiklarna bestrålas med laser scatter ljuset, som återfinns under 90 ° med en digital videokamera via mikroskopet (Figur 1). Intensiteten hos det spridda ljuset tillåter observation av partiklar större 60 nm diameter. I en sådan inställning ljusstyrka en partikel är inte den enda indikation på partikelstorlek. När inget elektriskt fält appliceras, partikelrörelse följer endast Brownsk rörelse och kan tjäna som en indikator för att beräkna partikelstorlek. Emellertid är instrumentet även i stånd att anbringa ett elektriskt fält över cellkanalen. När de utsätts för detta område, potentialen, polaritet och nivå av jonisk-laddning av de suspenderade exosomes blir ytterligare bestämnings riktningen av deras rörelse. Hastighet och riktning resulterar i en elektro moheten histogram.

Samtidigt hitta en optimal metod för att analysera isolerade exosomes är ett problem, ligger en annan i effektiv isolering av exosomer från olika medier, såsom blod, ascites, urin, mjölk, fostervatten eller cellmedia. Olika metoder har beskrivits hittills, som är baserade på ultracentrifuge 1, industriella separationsreagens (såsom Exoquick) 7, magnetiska pärlor för antigen använder separation 8 eller ultrafiltrering steg 9.

I detta protokoll visar vi hela processen av Exosome isolering via ultracentrifuge och visa hur man analyserar den resulte Exosome innehåller fjädring via spårningspartikelinstrument. Särskilda överväganden för analys av human plasma eller cellkultur medel härledda exosomes tillhandahålls.

Protocol

OBS: Experimenten som presenteras i detta arbete har godkänts av den institutionella etiska styrelse Düsseldorfs universitet.

1. Exosome Framställning

  1. Samla helblod i 3 citrat rören via venpunktion (totalt 9 ml). Häll blod i en 15 ml Falcon-rör.
  2. Centrifugera provet vid 1500 xg under 20 min vid 4 ° C för att initiera separation av celler från plasma. Överför supernatanten till ett nytt 15 ml Falcon-rör.
  3. Centrifugera provet vid 2800 xg under 20 min vid 4 ° C för att avlägsna alla celler från plasma (cellfritt plasma; GFP). Överför den gemensamma fiskeripolitiken till ultracentrifugeringsrören, 1 ml per rör.
  4. Centrifugera vid 100.000 xg under 90 minuter vid 4 ° C för att utarma exosomer. Ta bort 900 pl supernatant. Ätersuspendera pelleten i de återstående 100 | il i ultracentrifugeröret. Lägg 900 pl PBS.
  5. Centrifugera igen vid 100.000 xg under 30 minuter vid 4 ° C. Ta bort 900 pl supernatant. Ätersuspendera pelleten med de återstående 100 | il.
  6. Överför 5 till 20 pl resuspension i 40 ml destillerat vatten. Filtrera suspensionen genom ett 450 nm filter för att separera exosomer från större partiklar. Använd denna slutliga suspensionen för mätning partikel.

2. Startordningen för Particle Tracking Instrument

  1. Starta programmet genom att dubbelklicka på programikonen. Klicka på de olika programflikarna ("Cell Check", "Mätning", "Analys") för att växla mellan dem genom hela protokollet.
  2. Följ instruktionerna på skärmen för en automatiserad implementering av startproceduren. Markera rutorna för både cell kvalitetskontroll och automatisk justering.
    OBS: Båda dessa steg kan upprepas separat om det behövs genom att trycka på knappen (A) eller (B) på "check cellen" -fliken.
  3. Öppna inlopp och utlopp i NTA instrumentet och injicera 10 ml destillerat vatten med spruta in i cellen kanalen genom inloppsporten. Stäng utloppsöppning som den sista mängden vatten sprutas. Placera en bägare under utloppet för att samla avfall lösning. Se till att mätcellen är fri från luftbubblor och inte spruta luftbubblor i systemet. Stäng inloppsöppning omedelbart.
  4. Utför cell kvalitetskontroll genom att klicka på "OK". Mjukvaran kommer att visa cell kvalitet resultat efter några sekunder.
  5. Om några partiklar fortfarande visualiseras i live-view skärm av programvaran eller om resultatet av kvalitetskontrollen är bara bra eller dålig, är upprepa steg 2,3 tills de återstående partiklarna bort från mätcellen. Upprepar även steg 2,3 efter varje mätning för att undvika ansamling av partiklar. Om upprepa destillerat vatten injektion och kontroll cell inte producerar ett "bra" resultat, fortsätt till 2,9.
  6. Bered en kontroll suspension innehållande enhetliga 200 nm stora polystyrene partiklar som skall användas för att inrikta foci av lasern och mikroskop. Lägg en droppe av suspensionskoncentrat, som tillhandahålls av instrumenttillverkaren, till 500 ml destillerat vatten för att erhålla den önskade koncentrationen, så att 600 ± 100 partiklar visas per skärm i live-view.
  7. Injicera inriktnings suspensionen i NTA instrumentet som beskrivs i steg 2.3. Tryck på "OK" för att starta den automatiska justering, en automatiserad rutin genom vilken systemet automatiskt hitta rätt position för de två härdar.
  8. När en uppmaning visas anger systemet är nu redo för experiment, klicka på OK för att starta mätningen.
  9. Ibland, rengör cell kanal manuellt mellan experiment genom att spola cellen med en 30% lösning av etanol. Rengör kanalen när programvaran visar en automatisk felrapport.

3. Mätning av Prov

  1. Spola kanalen med destillerat vatten före each provmätning (såsom beskrivs i steg 2.3).
  2. Injicera Exosome fjädring (framställd i avsnitt 1) ​​i den kanalen, enligt beskrivningen i steg 2.3.
  3. Ställ följande huvud parametrar i programvaran som behövs:
    1. Känslighet. För att hitta den optimala känsligheten sortiment, klicka på knappen "antalet partiklar vs. känslighet" för att visa en kurva för uppmätta partiklar per skärm för olika känslighetsnivåer. Valde en känslighetsnivå innan den maximala lutningen på kurvan. En högre känslighetsnivån möjliggör visualisering av fler små partiklar utan ökar också frågor som rör bakgrundsljud.
    2. Minsta ljusstyrka. Valde en start ljusstyrka 20 för Exosome mätning för att använda den här funktionen som ett filter. Reglera denna parameter till tomma ut starkt ljusspridande partiklar. Reglera ner för att förstärka svagt scattering artefakter. Variera ljusstyrka under hela experimentet.
      OBS: Partiklar som ljus-Scatter alltför starkt överlappar varandra och kan uteslutas från analysen av misstag.
    3. Min och Max Size. Ställ ett digitalt filter för att eliminera pixelbrus och oönskade scatter från dimensionerade partiklar genom att reglera minsta och största storlek. Använd en rad 10 till 500 pixlar för mätning av exosomes.
    4. Shutter. Justera tid som kameran är öppen för 1/300 sek.
  4. Live läst ut parametrar:
    1. Växla mellan en digital och en analog vy modus när som helst genom att klicka på "Live-image" -knappen.
    2. Under hela försöket, övervaka spridningsintensiteten bar, som visar mättnadsstatus provet som en färgkodad indikator. Inte analysera exosomes om spridningsfältet är röd. I ett sådant fall ytterligare späda provet för att undvika detta fenomen. Om experimentbeting förbjuder en manipulering av provet suspension, nedreglera känsligheten eller uppreglera ljusstyrkan i programvaran-snst ä llningar att förbättra mätresultaten.
      OBS: När prover med en extremt hög koncentration av partiklar analyseras scatter kommer säkring enskilda partiklar och de räknas som en enda partikel.
    3. Notera antalet partiklar räknades i synfältet från displayen.
  5. Klicka på "Mätning" -fliken.
  6. Välj inställningar i "kör alternativ" array.
    1. Före varje förvärv, välj "check rörelsen" för en upprepad kontroll partikel drift testet. Utför testet åtminstone en gång innan hela analysen. Om avdriften är högre än 20 pm / sek, vänta innan du fortsätter mätningen så att provet slutar flöda.
    2. Välj antal försök (5) och tidsfördröjningen mellan dem (0).
    3. Utför en "stickprovskontroll" om det behövs. Detta test är en del av den automatiska anpassningen på startförfarandet och kan upprepas i efterhand som det behövs.
    4. Klicka slutligen på "kör video förvärvet" -knappen. I det nya fönstret, definierar antalet cykler (15) och antalet mätpositioner (11).
      OBS: Laserhuvudet och mikroskopet kan flyttas för att analysera partikelantalet vid 11 olika positioner. Beroende på den experimentella efterfrågan, besluta om experimentet ska utföras på en enda position eller på olika positioner.
      1. Bekräfta minimal tid varaktighet en partikel måste spåras för att räknas som en enskild partikel genom att ställa in videoupplösning (låg). En lägre upplösning ger en kortare spårning varaktighet.
      2. Välj ett filnamn och klicka på "OK" för att starta mätningen.

    4. Tolkning av resultat

    1. Visa följande resultat och parametrar som visas efter mätning på fliken "resultat": (1) Totalt antal partiklar spåras, (2) Genomsnittligt antal delaricles per position, och (3) partikelkoncentration.
      1. Visa resultat genomsnittstabellen för det numeriska förhållandet mellan partikelstorlek (diameter, yta och volym) till andelen partikelantal, samt värden av medelvärdet och standard differentiering.
      2. Använd toppanalystabellen om mer än en topp existerar i den grafiska analysen. Denna tabell visar fördelningen av partiklar som är mindre än den första eller respektive andra topp.
    2. Visa grafen beräknas efter mätningen för att se en fördelning av partiklar efter storlek. Använd ikonerna i visningsläge och ovanför diagrammet för att ändra inställningarna.

Representative Results

Det prov som används för denna demonstration visar en optimal miljö för mätning med en känslighet på 85%, innan den maximala lutningen på känslighetskurvan (Figur 2). Ljus, min- / maxvärden valdes som rekommenderas i protokollet. En koncentration av 5,3 partiklar / ml X 10 6 mättes, medan medelstorleken hos partiklarna var 0,149 ^ m, de flesta av dem var 0,137 | am.

De värden som inkommit efter mätningen kan sparas i en rapport med ett filformat för .pdf eller som en .txt för export i en databas. Grafen kan justeras så att föredra som beskrivs i protokollet (avsnitt 4). Videosekvensen sparas också och kan användas för senare off-line återanalys. Men i en sådan en off-line analys, de före förvärvet inställningar på kameran kan inte ändras i efterhand.

För att hitta de optimala parameterinställningar för en mätning, här beskriver vi the optimering av instrumentinställningarna på exemplet med en 100 nm polystyren storleksstandard. Påverkan av två parametrar, känslighet och min / max storlek på videobilden och partikelstorleksfördelning diskuteras i detalj. Alla andra parametrar är sammanfattade i tabell 1.

En visuella intrycket av effekterna av känsligheten (från 50 till 94) på analoga och digitala bilder visualiseras i Figur 3. Den kvantitativa information från bilderna visas i Figur 4, baserat på inställningarna i tabell 1, Min Size = 5 och Max Size = 200. En typisk förhållandet mellan antalet upptäckta partiklar kontra känslighet visas i figur 4A. Mellan 50 och 90, antalet upptäckta partiklar ökade med känslighet och steg dramatiskt för känslig> 90. En optimal känslighetsområdet återfanns mellan 66 och 86 (A). Partikelstorleksfördelningarna som erhölls med diflunda känslighetsinställningar visas i figur 4B. Partikelstorleksfördelningarna representerar medelvärdet av tre enskilda mätningar. För alltför låg känslighet (sensitivitet = 62, röd kurva) bara några partiklar analyserades vilket resulterar i ganska dåliga statistiken. Antalet analyserade partiklar ökade med känslighet och nådde en optimal mellan 70 (gul kurva) och 86 (tan kurva). Vidare ökar känsligheten leda till en försämring av partikelstorleksfördelning med antalet partiklar släppa och storleksfördelning skiftande mot mindre storlekar (känslighet = 94, blå kurva). Figur 4C visar utvecklingen av antalet baserade x50 diameter (50% av partiklarna är mindre än denna diameter) som en funktion av känslighet. I beige intervallet, RSD av partikelstorleken var mindre än 8% och motsvarar den optimala intervallet i A. De röda områdena indikerar RSD> 8% till följd av dåliga statistik (känslighet för låg) eller bred distribubutions med övergång till mindre storlekar (känslighet för hög).

Inställningarna för Min Storlek och Max Size är filter som tillämpas på digitala bilder för att avlägsna partiklar med spot storlekar mindre än Min Storlek och större än Max Size. På grund av förmågan att sprida ljus, skapar en partikel en fläck av en viss storlek på en digital bild. Storleken på fläcken mäts som ett antal bildpunkter (pixlar). När en partikel sprider ljus mycket väl (t.ex. partiklar> 200 nm eller aggregat) är fläckstorleken ganska stora, t ex,> 500 px. Den fläckstorleken är ganska liten (t.ex. <10 px) för små partiklar (t.ex. <20 nm), beroende på partikelmaterialet. Spot storlek (px) kan inte bytas ut mot partikelstorlek (nm), eftersom de inte är identiska och det finns inget direkt samband mellan dessa två variabler. En optimering av min och max storlek gör att användaren kan filtrera bort oönskade objekt såsom agglomerat (Max Size) eller småobjekt såsom bakgrundsbrus (Min storlek). Inverkan av Min / Max storlek på partikelstorleksfördelningen hos en 100 nm storlek standard visas i Figur 4D (känslighet = 82). När intervallet är inställt på små punktstorlekar (t.ex. min = 1, max = 52; apelsin kurva), antalet analyserade partiklar minskar och antalet baserade x50 diameter är något förskjutits mot mindre storlekar. En inställning för större fläckar (min = 40, max = 1000; röd kurva) resulterar i en bred partikelstorleksfördelning förskjutits mot större storlekar. För att erhålla lika totala antalet partiklar har intervall gränserna för både orange och rött fördel justeras för att passa 80 partiklar. Fördelningen med optimala inställningar (min = 5, max = 200; tan kurva) består av 360 partiklar.

En serie av framgångsrika experiment utfördes med exosomer isolerats genom ultracentrifugering och mäts genom NTA med den presenterade systemet. De resulterande data var mycketkonsekvent och bekräftade en hög reproducerbarhet. Andra isoleringsmetoder bör visa liknande resultat. Dock var utspädningssteg identifieras som ett särskilt kritiskt steg och dess inverkan på de beräknade totala antalet partiklar måste omvärderas.

Figur 1
Figur 1. Skiss över installationen av NTA. Mikroskopet / video axel och laserstråle är orienterade ortogonalt mot varandra, passerar vid tvärsnitt cellkanalen. Ljus som sprids av partiklarna visas i "live-view" fönstret av programvaran. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Effekter av känslighet på analog och digital bild. Visualisering av partiklar på livevisningsskärmen visas för känsligheter mellan 50 och 94 för både analog (övre raden) end digitala (nedre raden) vyer. När känsligheten är för låg, är bara några partiklar upptäcks (till vänster). Vid optimal känslighet partiklarna bildar tillsammans prickar väl isolerade från varandra (mitten). Vid en jämförelsevis hög känslighet partiklar slås ihop vilket leder till dålig bildkvalitet (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Inverkan av känslighets min och max storleksinställningar för ett kontrollprov 100 nm polystyren partikel (A) Tomt på känslighet kontra upptäckta antal partiklar. det optimala intervallet är 66-86, innan den maximala lutningen hos kurvan. (B) partikelstorleksfördel erhållits med flera känslighetsinställningar (62-94); diagram för alltför lågt (62) eller för hög gör (94) känslighet inte fånga partikelstorleksfördelningen för kontrollprovet polystyren 100 nm. (C) Antal baserade x50 diameter kontra känslighet; felet av x50 i beige intervallet är mindre än 8%, är optimalt intervall från 66 till 86. (D) Effekterna av min och max storlek på partikelstorleksfördelningen; optimala parametrar (min = 5 och max = 200) fånga den rätta fördelningen för kontrollprovet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Pre-förvärvet parametrar
Känslighet variabel
Shutter 40
Bildhastighet 30 fps
Upplösning Hejgh
Cykler 10
Multipla Förvärv 3
Position 1
Efter förvärvet parametrar
Min Ljusstyrka 30
Maximal Storlek variabel
Min Storleken variabel

Tabell 1. Sammanfattning av före och efter förvärvet parametrar för inställning av spårningspartikelinstrument.

Discussion

Vi visar ett detaljerat protokoll för Exosome isolering från blod och närvarande nanopartikel spårning som ett nytt och innovativ metod för att mäta Exosome storlek och koncentration i en biologisk vätska. I de presenterade experimenten humant perifert blod användes som ursprung exosomes. Emellertid kan andra ursprung, såsom urin, sputum, cellkultursupernatant, etc, också användas som testmaterial.

Baserat på den biologiska variabilitet Exosome koncentrationen hos människa, kan analyser från olika individer har en anmärkningsvärt varierande koncentration av exosomes. Emellertid kan koncentrationen av partiklar i biologiskt test sonden påverka resultaten. Därför behövs en pålitlig och standardiserad metod för utspädning av sonder. I den presenterade metoden Exosome innehållande plasma genererades från 9 ml perifert helblod. Använda differentiell centrifugering steg en Exosome pellet isolerades från1 ml plasma och åter suspenderas i 5 ml destillerat vatten för att resultera i arbetsprovet av suspenderade exosomes. Denna fördefinierad inställning har gett oss en ordentlig koncentration av partiklar, dvs lämplig spridningsintensiteten under NTA. Bredvid volym och utspädning aspekt är kompositionen av de lösningar som används också av betydelse. Vi har använt Destillerat vatten för den slutliga resuspension av exosomer. Naturligtvis kan olika medier för den slutliga utspädningssteget också användas, i enlighet med kraven i den experimentella uppställningen. Emellertid, i fallet med Zeta-potential mätningar av joniska-lösningar, särskilt vid analys av prover med en buffrande kapacitet, är en försiktig utspädning i turbulensfria betingelser användbara. För direkt jämförelse av flera prover rekommenderar vi att samma utspädningsnivå för alla prover. Alla inställningar utom känslighet och videoupplösningen kan ändras i efterhand med hjälp av ZetaView Analysis programvaran.

10. Vi tror att praktiska aspekter av provhantering och reproducerbarhet av resultaten är av central betydelse i valet av metodsekvensen för Exosome utvärdering. Vi tror också att en ideal detektionssystem bör eliminera användar beroende faktorer som kan störa resultatet av mätningarna. Exosome förhållningssätt analysera som presenteras här uppfyller kriteriet för enkel hantering i hög grad. Som en ytterligare fördel, är den halvautomatisk analys av proverna utfördes i en snabb process, generera resultat på kort tid. En online visualisering av exosomes hjälper analysatorn gapå ett ögonblick uppfattning om Exosome egenskaper, t.ex. brutto koncentration.

En mycket enkel men elegant tillägg till tekniken mätning som presenteras här är användningen av antikroppsmärkta exosomer och tillfångatagandet av den spridda laserstrålen med hjälp av en föregående filter framför detektorn. På detta sätt Exosome subpopulationer kan särskiljas enligt deras ytantigener och andra biologiskt relevanta egenskaper som är tekniskt tillgängliga för en selektiv fluorescerande färgning.

En nackdel med den nuvarande versionen av vår partikelspårning instrumentet är det faktum att artefakter såsom bakgrundsbrus vid mycket höga känslighetsnivåer kan bli närvarande, som är baserad på cellkanalväggen. En teknisk lösning och förbättring av det nuvarande systemet kan bli tillgänglig inom en snar framtid. Genom denna metod reflektioner av laser sprider ljus på kanalväggen kommer att minskas, vilket därigenom ökar riktigheten av de uppmätta signalerna och erhållna data och sänka detektionsgränsen.

Även om den för närvarande används protokollet för Exosome isolering är väl etablerad och tillämpad spårningspartikelinstrument har en anmärkningsvärt exakt upplösning med en lägre storleksfördelning på 30 nm, det finns ingen garanti för att de upptäckta partiklarna är faktiskt helt sant exosomes. Andra partiklar, såsom döda cellfragment eller större proteinkomplex kan också vara närvarande i Exosome suspensionen och leda till falska positiva signaler. En pålitlig metod som sådan "förorening" kan uteslutas kan vara elektronmikroskopi (EM), antingen transmissions EM eller scanning EM. Tyvärr har ingen allmän och specifik markör för exosomes identifierats hittills, även om ett antal tidigare föreslagna ytmarkörer har fått en allt större mängd uppmärksamhet, inklusive tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, etc. 11.

"> Oavsett framtida utvecklingen av forskning om Exosome biologi, särskilt när det gäller Exosome specifika markörer, kommer protokollet som presenteras här ger en kraftfull metod för isolering och detektion av exosomer. Koncentration och storlek kan lätt bestämmas i en mjukvarustödd okomplicerad mode. Tillsatsen av selektiva fluorescerande markörer eller fluorofor kopplad antikroppar kommer sannolikt ytterligare öka de möjliga tillämpningarna av den beskrivna arbetssätt av NTA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Citrate tube BD 364305 BD Vacutainer
Distilled water Braun 3880087 Aqua ad iniectabilia
Falcon tube Greiner Bio One 188271 PP Tube, Steril 15 ml
Ultracentrifugation tube Beckman 357448 Microfuge Tube Polyallomer 1.5 ml
Polybead Polysciences, Inc. 07304 2.6% Solids-Latex
Alignment Solution
Syringe (Filter) Braun 4617053V 5 ml
Syringe (ZetaView) Braun 4606051V 5 ml
Needle BD 305180 BD Blunt Fill Needle
Filter Sartorius Stedim 16555 Syringe filter, hydrophilic, 450 µm
Ultracentrifuge Beckman L8-M Rotor: 70Ti Ser. No E21078
ZetaView Particle Metrix PMX 100, Type 101
Centrifuge Eppendorf 5804R Rotor: A-4-44

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Chapter 3. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. . Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. (3.22), (2006).
  2. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in molecular biology. 728, 235-246 (2011).
  3. Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. e3037 (2012).
  4. Konokhova, A. I., et al. Light-scattering flow cytometry for identification and characterization of blood microparticles. Journal of biomedical. 17, 057006 (2012).
  5. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et biophysica acta. 1820, 940-948 (2012).
  6. Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 87, 146-150 (2011).
  7. Exoquick, ExoQuick-TC and ExoQuick-LP. Polymer-based exosome preciption. System Biosciences. Available from: http://www.systembio.com/microrna-research/exoquick-exosomes/overview (2015).
  8. Clayton, A., et al. Analysis of antigen presenting cell derived exosomes, based on immuno-magnetic isolation and flow cytometry. Journal of immunological. 247, 163-174 (2001).
  9. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Amer. J. Phys. Renal Phys. 292, F1657-1661 (2007).
  10. Carr, B., Warren, J. Company profile: NanoSight: delivering practical solutions for biological nanotechnology. Nanomedicine. 7, 1129-1132 (2012).
  11. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. International immunology. 17, 879-887 (2005).
En innovativ metod för Exosome Kvantifiering och storlek Measurement
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mehdiani, A., Maier, A., Pinto, A., Barth, M., Akhyari, P., Lichtenberg, A. An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement. J. Vis. Exp. (95), e50974, doi:10.3791/50974 (2015).More

Mehdiani, A., Maier, A., Pinto, A., Barth, M., Akhyari, P., Lichtenberg, A. An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement. J. Vis. Exp. (95), e50974, doi:10.3791/50974 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter