A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.
Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach.
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).
Den exakta funktionen av cirkulerande exosomer förblev okänd för en lång tid. Redan nu hela sökvägen mekanismen exosomes inte är helt klarlagd. Eftersom exosomes bär antigener, proteiner och RNA (mRNA och miRNA) som relaterar dem till sin föräldracell ursprungsland, deras funktion som cell-cell signalering sändare har främst prioriteras.
Många olika metoder har beskrivits i litteraturen för isolering och kvantitativ detektering av exosomer 1,2. Dock har ingen konsensus om en "gold standard" nåtts. Samtidigt majoriteten av forskare verksamma inom Exosome forskningen överens om att en konsekvent metod för isolering är starkt motiverat för att uppnå en högre grad av jämförbarhet mellan olika rapporter och studier.
Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) är den vanligaste och utbredda verktyg för Exosome analys 3. FACS har benbestämda att, via fluorescensmärkning, kan celler från olika ursprung jämföras i ett steg. De största nackdelarna med FACS är att denna metod inte är tillräckligt känslig för att identifiera partiklar mindre än 0,5 um 4, medan exosomes är i allmänhet mellan 30-120 nm i diameter 5, ännu mindre att mäta deras storlek.
Svepelektronmikroskopi (SEM) och transmissionselektronmikroskopi (TEM) är andra verktyg för analys av partikelstorlek och morfologi av exosomer. Men både SEM och TEM har nackdelen att framställningen av prover är tidskrävande, båda metoderna involverar arbetsintensiva steg och var och en har en viss risk för artefakt generationen. Varken metod är lämplig för hög provgenomströmning och karakterisering av flera tusen enskilda partiklar av ett prov. Dessutom, en kvantitativ analys för klinisk daglig rutin där prover måste ofta analyseras samtidigt eller åtminstone i en mycket kort period ärsvåra att utföra. Nya generationens teknik tillåter nu att vi kan analysera exosomes utan föregående intensivt förberedelsearbete (t.ex. miljö SEM). Dessa moderna tekniker är fortfarande ganska obekvämt för att analysera stora volymer suspensioner innehållande exosomes att bestämma deras genomsnittliga antalet och storleksfördelning 6.
En annan mycket känslig metod för visualisering och analys av exosomes är nanopartikel-tracking analys (NTA). Denna metod utnyttjar två olika principer för fysik. Först, är partiklar som detekteras av det ljus som sprids när de bestrålas med en laserstråle. Det andra fenomenet är känt som Brownsk rörelse, enligt vilken diffusion av olika partiklar i en vätskesuspension är omvänt proportionell till deras storlek. I det senare fallet rörelsen beror också på temperaturen och viskositeten hos vätskan. Ändå är denna hastighet direkt relaterad till partikelstorlek och används av NTA. Använda mjukaware baserad analys, är digitala bilder av spritt ljus från enstaka partiklar registreras. Tomter för spridda ljusfläckar och deras rörelsehastighet ger de data som underlättar bestämningen av totalantal partikel och storleksfördelning. Denna teknik är särskilt kraftfull för att analysera partiklar med en medeldiameter av mindre än 100 nm.
Mätningarna storlek och koncentration sker med ZetaView Brownsk och elektrofores Motion Video Analysis Mikroskop. Detta är en halvautomatiserad skrivbords nanoparticle analysinstrument för vätskeprover (nedan kallad partikelspårningsinstrument). Den består av partikelspårning analysatorn samt en bärbar dator med programvara som används för dataanalysen. Heterogena biologiska prover är så lämpliga för denna metod som mer homogena suspensioner av oorganiska partiklar. En laserspridning mikroskop med en videokamera används för detektion av partiklar och för observation av deras rörelse. Medan mikroskopaxeln är horisontell och fokuseras in i cellen kanalen fylld med en suspension innehållande exosomer, är laserstrålen orienterad vertikalt. Partiklarna bestrålas med laser scatter ljuset, som återfinns under 90 ° med en digital videokamera via mikroskopet (Figur 1). Intensiteten hos det spridda ljuset tillåter observation av partiklar större 60 nm diameter. I en sådan inställning ljusstyrka en partikel är inte den enda indikation på partikelstorlek. När inget elektriskt fält appliceras, partikelrörelse följer endast Brownsk rörelse och kan tjäna som en indikator för att beräkna partikelstorlek. Emellertid är instrumentet även i stånd att anbringa ett elektriskt fält över cellkanalen. När de utsätts för detta område, potentialen, polaritet och nivå av jonisk-laddning av de suspenderade exosomes blir ytterligare bestämnings riktningen av deras rörelse. Hastighet och riktning resulterar i en elektro moheten histogram.
Samtidigt hitta en optimal metod för att analysera isolerade exosomes är ett problem, ligger en annan i effektiv isolering av exosomer från olika medier, såsom blod, ascites, urin, mjölk, fostervatten eller cellmedia. Olika metoder har beskrivits hittills, som är baserade på ultracentrifuge 1, industriella separationsreagens (såsom Exoquick) 7, magnetiska pärlor för antigen använder separation 8 eller ultrafiltrering steg 9.
I detta protokoll visar vi hela processen av Exosome isolering via ultracentrifuge och visa hur man analyserar den resulte Exosome innehåller fjädring via spårningspartikelinstrument. Särskilda överväganden för analys av human plasma eller cellkultur medel härledda exosomes tillhandahålls.
Vi visar ett detaljerat protokoll för Exosome isolering från blod och närvarande nanopartikel spårning som ett nytt och innovativ metod för att mäta Exosome storlek och koncentration i en biologisk vätska. I de presenterade experimenten humant perifert blod användes som ursprung exosomes. Emellertid kan andra ursprung, såsom urin, sputum, cellkultursupernatant, etc, också användas som testmaterial.
Baserat på den biologiska variabilitet Exosome koncentrationen hos människa, kan analyser från olika individer har en anmärkningsvärt varierande koncentration av exosomes. Emellertid kan koncentrationen av partiklar i biologiskt test sonden påverka resultaten. Därför behövs en pålitlig och standardiserad metod för utspädning av sonder. I den presenterade metoden Exosome innehållande plasma genererades från 9 ml perifert helblod. Använda differentiell centrifugering steg en Exosome pellet isolerades från1 ml plasma och åter suspenderas i 5 ml destillerat vatten för att resultera i arbetsprovet av suspenderade exosomes. Denna fördefinierad inställning har gett oss en ordentlig koncentration av partiklar, dvs lämplig spridningsintensiteten under NTA. Bredvid volym och utspädning aspekt är kompositionen av de lösningar som används också av betydelse. Vi har använt Destillerat vatten för den slutliga resuspension av exosomer. Naturligtvis kan olika medier för den slutliga utspädningssteget också användas, i enlighet med kraven i den experimentella uppställningen. Emellertid, i fallet med Zeta-potential mätningar av joniska-lösningar, särskilt vid analys av prover med en buffrande kapacitet, är en försiktig utspädning i turbulensfria betingelser användbara. För direkt jämförelse av flera prover rekommenderar vi att samma utspädningsnivå för alla prover. Alla inställningar utom känslighet och videoupplösningen kan ändras i efterhand med hjälp av ZetaView Analysis programvaran.
<p class="Jove_content"> Även om författarna tror att häri infört systemet representerar för närvarande det lämpligaste instrumentet, det är inte den enda tillgängliga NTA-systemet. Ett antal tidigare rapporter har anställt andra system som tillämpar samma NTA principer men ger ett annat instrument design som går tillsammans med några olika funktioner 10. Vi tror att praktiska aspekter av provhantering och reproducerbarhet av resultaten är av central betydelse i valet av metodsekvensen för Exosome utvärdering. Vi tror också att en ideal detektionssystem bör eliminera användar beroende faktorer som kan störa resultatet av mätningarna. Exosome förhållningssätt analysera som presenteras här uppfyller kriteriet för enkel hantering i hög grad. Som en ytterligare fördel, är den halvautomatisk analys av proverna utfördes i en snabb process, generera resultat på kort tid. En online visualisering av exosomes hjälper analysatorn gapå ett ögonblick uppfattning om Exosome egenskaper, t.ex. brutto koncentration.En mycket enkel men elegant tillägg till tekniken mätning som presenteras här är användningen av antikroppsmärkta exosomer och tillfångatagandet av den spridda laserstrålen med hjälp av en föregående filter framför detektorn. På detta sätt Exosome subpopulationer kan särskiljas enligt deras ytantigener och andra biologiskt relevanta egenskaper som är tekniskt tillgängliga för en selektiv fluorescerande färgning.
En nackdel med den nuvarande versionen av vår partikelspårning instrumentet är det faktum att artefakter såsom bakgrundsbrus vid mycket höga känslighetsnivåer kan bli närvarande, som är baserad på cellkanalväggen. En teknisk lösning och förbättring av det nuvarande systemet kan bli tillgänglig inom en snar framtid. Genom denna metod reflektioner av laser sprider ljus på kanalväggen kommer att minskas, vilket därigenom ökar riktigheten av de uppmätta signalerna och erhållna data och sänka detektionsgränsen.
Även om den för närvarande används protokollet för Exosome isolering är väl etablerad och tillämpad spårningspartikelinstrument har en anmärkningsvärt exakt upplösning med en lägre storleksfördelning på 30 nm, det finns ingen garanti för att de upptäckta partiklarna är faktiskt helt sant exosomes. Andra partiklar, såsom döda cellfragment eller större proteinkomplex kan också vara närvarande i Exosome suspensionen och leda till falska positiva signaler. En pålitlig metod som sådan "förorening" kan uteslutas kan vara elektronmikroskopi (EM), antingen transmissions EM eller scanning EM. Tyvärr har ingen allmän och specifik markör för exosomes identifierats hittills, även om ett antal tidigare föreslagna ytmarkörer har fått en allt större mängd uppmärksamhet, inklusive tetraspanin (Tspan), CD81, C63, CD9, etc. 11.
"> Oavsett framtida utvecklingen av forskning om Exosome biologi, särskilt när det gäller Exosome specifika markörer, kommer protokollet som presenteras här ger en kraftfull metod för isolering och detektion av exosomer. Koncentration och storlek kan lätt bestämmas i en mjukvarustödd okomplicerad mode. Tillsatsen av selektiva fluorescerande markörer eller fluorofor kopplad antikroppar kommer sannolikt ytterligare öka de möjliga tillämpningarna av den beskrivna arbetssätt av NTA.The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Christina Ballázs, Hug Aubin and Jörn Hülsmann for the critical reading of the manuscript and excellent editorial assistance. Moreover, the authors thank Gisela Mueller for the technical assistance. The authors thank Particle Metrix GmbH for providing the funds covering the publication costs.
Name of the Reagent | |||
Citrate tube | BD | 364305 | BD Vacutainer |
Distilled water | Braun | 3880087 | Aqua ad iniectabilia |
Falcon tube | Greiner Bio One | 188271 | PP Tube, Steril 15ml |
Ultracentrifugation tube | Beckman | 357448 | Microfuge Tube Polyallomer 1,5ml |
Polybead | Polysciences, Inc. | 07304 | 2,6% Solids-Latex Alignment Solution |
Syringe (Filter) | Braun | 4617053V | 5ml |
Syringe (ZetaView) | Braun | 4606051V | 5ml |
Needle | BD | 305180 | BD Blunt Fill Needle |
Filter | Sartorius Stedim | 16555 | Syringe filter, hydrophilic, 450µm |
Material Name | |||
Ultracentrifuge | Beckman | L8-M | Rotor: 70Ti Ser. No E21078 |
ZetaView | Particle Metrix | PMX 100, Type 101 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Rotor: A-4-44 |