Summary
Duas técnicas de isolamento de gotículas lipídicas celulares a partir de 1) células de levedura e 2) placentas humanas estão apresentadas. A peça central de ambos os processos é a centrifugação de gradiente de densidade, onde a camada flutuante resultante contendo as gotículas podem ser facilmente visualizadas por olho, extraiu-se, e quantificada por análise de Western Blot quanto à pureza.
Abstract
Gotículas lipídicas são organelas dinâmicas que podem ser encontrados na maioria das células procariotas e eucariotas certos. Estruturalmente, as gotículas constituídas por um núcleo de lípidos neutros rodeadas por uma monocamada de fosfolipido. Uma das técnicas mais úteis na determinação dos papéis celulares de gotículas foi identificação proteoma de proteínas ligadas, que podem ser isolados, juntamente com as gotas. Aqui, dois métodos são descritos para isolar gotículas lipídicas e suas proteínas ligadas a partir de duas amplas eucariontes: levedura de fissão e as células das vilosidades da placenta humana. Apesar de ambas as técnicas têm diferenças, o método main - gradiente de densidade centrifugação - é compartilhado por ambas as preparações. Isto demonstra a ampla aplicabilidade das técnicas de isolamento de gotículas apresentados.
No primeiro protocolo, as células de levedura são convertidas em esferoplastos por digestão enzimática das paredes celulares. Os esferoplastos resultantes são então gently lisadas em um homogeneizador folgadas. Ficoll é adicionado ao lisado para providenciar um gradiente de densidade, e a mistura é centrifugada três vezes. Depois da primeira rotação, as gotículas lipídicas são localizadas na camada flutuante de cor branca dos tubos de centrífuga, juntamente com o retículo endoplasmático (ER), a membrana de plasma, e vacúolos. Dois rotações subsequentes são utilizados para remover estes três organelos. O resultado é uma camada que tem apenas gotículas e as proteínas ligadas.
No segundo protocolo, as células das vilosidades da placenta são isolados a partir de placenta humana prazo por digestão enzimática com tripsina e DNase I. As células são homogeneizadas num homogeneizador folgada. De baixa velocidade de centrifugação e de velocidade média passos são usadas para remover as células não quebradas, os detritos celulares, os núcleos, e as mitocôndrias. É adicionada sacarose ao homogenato para providenciar um gradiente de densidade, e a mistura é centrifugada para separar as gotículas lipídicas a partir do outro cellulafracções r.
A pureza das gotículas lipídicas em ambos os protocolos, é confirmada por análise Western Blot. As frações de gotículas de ambas as preparações são adequados para a análise proteômica e lipidomas subseqüente.
Introduction
Gotículas lipídicas celulares são organelas dinâmicas que servem múltiplas funções nas células. Eles são centros de armazenamento de lípidos neutros, que podem ser convertidas em energia ou utilizadas para a síntese de fosfolípidos. As gotículas de desempenhar um papel central em condições fisiológicas e patológicas, incluindo a aterosclerose, obesidade e doenças metabólicas relacionadas, e também as doenças infecciosas 1,2. Além disso, eles são fontes interessantes para combustíveis de biodiesel.
Muita informação sobre os papéis celulares de gotículas lipídicas foi obtida a partir de análise proteômica e lipidomas de gotículas purificados a partir de organismos de grande alcance 3. Estes organismos incluem as bactérias, levedura 4,5 6-11, plantas 12,13, nematóides 14, e voa 15,16. Dado o interesse no papel de gotículas lipídicas em doenças metabólicas humanos, as gotas foram também isolados a partir de células animais em cultura e umtecidos nimal. Linhas de células cultivadas têm incluído 3T3-L1 adipócitos 17, de ovário de hamster chinês (CHO), células K2 18, 19,20 hepatocyes humanos, e linhas de células epiteliais 21. Tecidos animais a partir do qual as gotas foram isolados incluíram rato músculo esquelético 22, fígado 23, e glândulas mamárias 23. Como mencionado acima, o objetivo da maioria dos estudos de isolamento gota é realizar análise proteômica sobre os fatores ligados e lipidomas no neutro e fosfolipídios.
Desde lipídios neutros - os mais numerosos componentes de gotículas lipídicas - são menos densos do que a maioria dos outros materiais celulares, o isolamento de gotículas tem sido tradicionalmente realizada usando gradiente de densidade centrifugação. Essa técnica é a peça central de ambas as preparações apresentadas aqui. As técnicas anteriores são combinados e 6,24 modificado para uma apresentação visual do isolamento de gotículas a partir de células de levedura de fissão cultivadase células humanas noncultured obtido a partir de tecido placentário. O objectivo é o de mostrar a ampla aplicabilidade desta técnica, escolhendo dois tipos de células muito diferentes de pontos para o isolamento a partir das gotículas. Esta técnica deve ser útil para aqueles que desejam isolar gotas da maioria dos organismos.
Protocolo 1 descreve o isolamento de gotículas lipídicas a partir da levedura de fissão, Schizosaccharomyces pombe, a qual tem sido utilizada como um modelo para observar a formação de gotículas durante a divisão celular eucariótica 25. A levedura Saccharomyces cerevisiae brotamento tem sido amplamente utilizado como organismo-modelo para estudar a biologia das gotículas de lípidos. Protocolo n ° 1 é aplicável a ambos os organismos e as diferenças nos preparativos são realçados.
Protocolo 2 descreve o isolamento de gotículas lipídicas de células das vilosidades da placenta, que são, por sua vez obtida a partir de placenta humana prazo. Ocoleção de placentas prazo proporciona uma oportunidade única de forma segura e eticamente obter 200-250 g de tecido humano prontamente disponível 26, que contém um número significativo de gotículas lipídicas. Isto está em contraste com a maior parte do trabalho de isolamento de gotículas de gordura em eucariotas superiores, onde as gotículas são originários a partir de células cultivadas. Nestes estudos, os ácidos gordos são, muitas vezes adicionado à cultura para promover a síntese de lípidos neutros e, assim, o crescimento de gotículas. Isto está em contraste com o trabalho aqui onde gotículas lipídicas são formadas sob condições nativas no tecido placentário.
As purezas das fracções de gotículas de lípido são determinados por análise de Western Blot, utilizando anticorpos de marcadores de organelos. Estes dois protocolos irá produzir fracções de gotículas lipídicas que são adequados para análise proteómica e lipidomas subsequente.
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Protocol
1. Isolando lipídicas gotas de (cisão) Células de levedura
Isolamento de gotículas do organismo modelo popular brotamento Saccharomyces cerevisiae é quase idêntico ao seguinte protocolo 6. As diferenças nas preparações são anotados.
1. Crescer células de levedura
- Prepare a mídia. Combine 36 g de YE5S pó por litro de dH 2 O em garrafas de vidro ou frascos de cultura. Serão necessários cerca de 2 L de mídia. Autoclave a mídia a 121 ° C por 20 min. Permita que os meios de comunicação para arrefecer à temperatura ambiente. Para S. cerevisiae substituir YE5S com YPD.
- Coloque 10-20 ml dos meios de comunicação YE5S resfriado em uma garrafa de cultura de 250 ml, utilizando técnicas estéreis. Inocular os meios de comunicação com uma pequena quantidade de células de levedura de uma placa de ágar utilizando uma vara de madeira estéril ou equivalente. Deixe as células crescer até à densidade óptica pretendida, a 30 ° C. Medir a densidade óptica a umcomprimento de onda de 595 nm utilizando um espectrofotómetro.
- Coloque a mídia restante nos frascos de 2,8 L. Usar não mais do que 1 L de balão por meios de 2,8 L para assegurar uma mistura adequada durante o crescimento celular na incubadora de agitação. O rendimento final de células molhadas deve ser cerca de 10 g para ser capaz de adquirir gotículas lipídicas suficientes para análise proteômica e lipidomas.
- Introduzir nas células do passo 1.2 em balões 2,8 L, tendo cada um 1 L de meios que foram preparados no passo 1.1.
- Crescer as células com a densidade desejada, a 30 ° C.
- Certifique-se que as células têm gotículas lipídicas. Reserva 1 ml das células. Medir a densidade óptica (OD) da amostra. Adicionar 0,1 ml de um estoque de 100 mM de BODIPY 493/503, em etanol por OD de células na amostra. Colocar 3 mL da amostra entre uma lâmina de vidro e uma lamela de vidro. Visualizar sob um microscópio fluorescente com um filtro de GFP (Figura 1A).
- Sedimentar as células do passo 1.5 a 4 & #176; C a 3.800 g durante 10 min. Trabalhar em lotes de acordo com a capacidade dos tubos de centrífuga.
- Deitar fora a mídia YE5S e lavar as células com um tampão de EMM + 600 mM sorbitol. Sorbitol fornece suporte osmótico.
- Transferência das células para um tubo de centrífuga de 50 ml estéril e sedimentar as células a 4 ° C a 2.000 g durante 10 min. Remover o sobrenadante. Pesar as células húmidas. Ressuspender as células em 2 ml de EMM (+ sorbitol 600 mM) de tampão por grama de células.
2. A conversão de células de levedura de fissão em esferoplastos e subsequente lise
- Adicionam-se 5 mg cada um de 1) enzima lítica de levedura e 2) de levedura de lise enzimas do fungo Trichoderma harzianum por grama de células húmidas, que foram pesadas no passo 1.9. Para S. cerevisiae aumentar estas enzimas com a mesma quantidade de Zymolyase.
- Incubar as células a 30 ° C, sob agitação suave a 100 rpm durante 60 min.
- Certifique-se de que os esferoplastos têm dr lipídicooplets. Ao repetir o passo 1.6 (Figura 1B).
3. Densidade centrifugação em gradiente
- Agregar as esferoplastos por centrifugação a 4 ° C a 2.000 g durante 5 min.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de transferência de plástico.
- Suavemente ressuspender os esferoplastos peletizadas com gelo frio de 10 mM Tris-HCl, 600 mM de sorbitol, e 200 ^ M de EDTA. Tenha em mente que os esferoplastos são muito frágeis.
- Agregar as esferoplastos novamente usando as mesmas configurações como no passo 3.1. Remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender as esferoplastos utilizando uma pipeta de transferência de plástico em 12% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, e 200 ^ M de EDTA a uma concentração de 2 ml / g de células.
- Transferir os esferoplastos em suspensão para um homogeneizador de vidro e homogeneizar em gelo, 20-30 pancadas, com o pilão solto do homogeneizador de vidro.
- Transfira os esferoplastos lisadas para tubos de centrífuga e sobreposição com o mesmo volume de 12% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, tampão e 200 fiM de EDTA. Escolha o número de tubos de centrífuga de usar para que cada tubo é de cerca de dois terços cheio.
- Centrifugar a 4 ° C a 100,000 xg durante 1,5 horas num rotor SW28 ou equivalente. Permitir rotor a costa a uma parada (rotor desaceleração = 0).
- Suavemente transferir a camada sobrenadante branco (Figura 2A), que contém as gotas, para um novo tubo (s) de centrifugação usando uma pipeta ou uma pipeta Pasteur curvada. Adicionar um volume suficiente de 12% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, tampão de EDTA e 200 ^ M para a amostra de modo que ele preenche mais ou menos um terço do tubo de centrifugação.
- Adicionar o volume equivalente de 8% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, tampão de EDTA e 200 ^ M para o topo da amostra (s) no novo tubo (s) de centrifugação. Após a adição desta amortecer os tubos devem ser de cerca de dois terços do volume.
- Centrifugar a 4 ° C a 100,000 xg durante 1 hora num rotor SW28 ou equivalente. Permitir rotor a costa a uma parada (rotor desaceleração = 0).
- Suavemente transferir a camada de topo branco flutuante (Figura 2B), que irá conter as gotículas, para um novo tubo (s) de centrifugação usando uma pipeta ou uma pipeta Pasteur curvada. Adicionar 600 mM de sorbitol, 8% de Ficoll, 10 mM Tris-HCl, tampão de EDTA e 200 ^ M para a amostra de modo a que ocupe cerca de um terço do tubo de centrifugação.
- Adicionar o volume equivalente a 250 mM de sorbitol, 10 mM Tris-HCl, e tampão EDTA 200 uM para o topo da amostra (s) no novo tubo (s) de centrifugação. Após a adição desta amortecer os tubos devem ser de cerca de dois terços do volume.
- Centrifugar a 4 ° C a 100,000 xg durante 1 hora num rotor SW28 ou equivalente. Permitir rotor a costa a uma parada (rotor desaceleração = 0).
- Transferir parte superior da camada branca (Figura 2C), que deve conter apenas as gotículas de lípidos e proteínas ligadas, a tubagem de diálise, e diálise O / N em 10 mM Tris-HCl e 200 ^ M de tampão de EDTA para eliminar o Ficoll.
Placentas foram coletadas de mulheres saudáveis com gestações únicas submetidos de forma eletiva entrega cesariana antes do início do trabalho de parto espontâneo no prazo. Assuntos deu o consentimento escrito e informado para a coleção de sua placenta. A coleção, e posterior utilização, de placentas foi realizada com a aprovação da Universidade do Tennessee e Universidade do Tennessee Graduate School of Medicine, em Knoxville Institutional Review Board (# 8757B e # 3338, respectivamente).
1. Isolamento de células das vilosidades da placenta humana
Parte 1 do protocolo é uma modificação de um protocolo publicado anteriormente por 26 Petroff et al.
Prepare as seguintes soluções:
- De NaCl (1 L): Dissolver 9 g de NaCl (M 58,4 g / mol) em dH 2 O, para se obter uma solução de 1 litro. Filtro de esterilizar (0,2; MM membrana).
- Solução salina equilibrada de 10x Hank (10x HBSS) (1 L): 4 g de KCl (M 74,5 g / mol); de 0,6 g de KH 2 PO 4 (M 136,086 g / mol), 80 g de NaCl (M 58,44 g / mol); Na 2 HPO 4 (M 141,96 g / mol), 10 g de D-glucose (M 180,16 g / mol). Dissolve-se cada um dos componentes em dH 2 O, para se obter uma solução de 1 litro. Filtro de esterilizar (0,2 membrana mm).
- Tampão de digestão de enzima (0,6 ml): combinar 70 ml 10x HBSS com 3,3 ml de 7,5% de Na Biscarbonate, 17,5 mL de HEPES 1 M, e 266,1 ml de dH2O; filtro de esterilizar (membrana de 0,2 um). Armazenar a 4 ° C.
- DNase I: imediatamente antes da utilização, adicionar 5 ml estéril 0,9% de NaCl para um frasco de DNase. Mantenha no gelo até o uso ou armazenar a -20 ° C.
- Preparando placenta para dissecção
- Obter uma placenta humana e processo tão perto do tempo de entrega possível. Usar um recipiente selado, tal como um refrigerador para transportar a placenta. Tenha cuidado ao ladoling materiais biológicos humanos.
- Na capa de segurança biológica, transferir a placenta para um recipiente estéril autoclave, e lavar cuidadosamente o sangue a partir de placenta e de membranas utilizando solução estéril a 0,9% de NaCl (salina). Descarte sangrenta salina no 1 L proveta como lixo biológico líquido.
- Coloque a placenta em um campo estéril, com a superfície lisa, tendo o cordão umbilical voltada para cima. Com nítidas, tesoura de ponta fina e pinças remover membranas fetais e do cordão umbilical.
- Vire a placenta de forma que a superfície materna (superfície áspera) é voltado para cima. Remover o tecido sobreposta placa basal, cerca de 3 mm a partir da superfície.
- Dissecando a placenta
- Dissecar um cotilédone de cada vez evitando a placa coriônica. Colete tecido das vilosidades em um copo de 250 ml com solução salina.
- Lavar tecido várias vezes em um copo separado com 0,9% de NaCl por agitação com uma pinça, utilizando o copo de 1 L para resíduos líquidos.
- Transferir um cotilédone de cada vez para uma placa de Petri 150 milímetros. Segure com uma pinça e raspar tecido com lâmina de barbear de navios na placa de Petri. Colocar o tecido raspado num copo separado, contendo 0,9% de NaCl. Repita o procedimento para todas as peças de tecido.
- Transferir pequena porção do tecido da peneira de dissociação de células e enxaguar com 0,9% de NaCl extensivamente até o eluato torna-se clara. Repetir para todo o tecido.
- Depois de enxaguar o tecido raspado do crivo de dissociação celular, drenar o excesso líquido e peso.
Neste ponto, o tecido pode ser armazenado S / N, num balão de Erlenmeyer estéril a 4 ° C em DMEM.
- A digestão enzimática do tecido placentário
- Preparar a mistura de digestão do tecido: 100 ml de tampão de diluição de enzima pré-aquecido, 1 ml de DNase I e 20 ml de 2,5% de tripsina 10x.
- Dividir o tecido, a transferência de 60 g a partir de tecido recolhido total (geralmente cerca de 250-300 g) para um balão de Erlenmeyer esterilizado de 500 ml.
- Coletar as células dissociadas
- Após os primeiros 45 min de dissociação, defina o recipiente de digestão em uma inclinação até que o tecido se instala.
- Recolher o sobrenadante, tomando cuidado para não coletar tecido não dissociada. Adicionar uma quantidade igual de HBSS para o sobrenadante foi recolhido e transferir para tubos estéreis de 15 ml de centrífuga. Para porções adicionais de tecido não dissociado, repetir procedimento a partir do passo 3.2 com o tecido não dissociado.
- Centrifuga-se o homogeneizado a 4 ° C a 1.000 g durante 15 min.
- Para cada lote, após a centrifugação, aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. As células das vilosidades da placenta são predominantemente na parte branca da pelota, sobrepondo-se as células vermelhas do sangue.
- Transferência das células das vilosidades (parte branca da pelota) para a sterile 50 ml tubo de centrifugação cónico e manter em gelo.
- Depois de recolher as células a partir de todas as três fases de digestão, filtrar a suspensão através de um filtro de 100 mm de células de nylon inserida no topo de um tubo de centrífuga de 50 ml estéril cónica. Se a filtração da suspensão de células diminui, levante sobre o filtro para extrair um vácuo no interior do tubo.
- Centrifugar a 4 ° C a 1.000 g durante 10 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
2. Homogeneização de células das vilosidades da placenta
- Antes de iniciar o processo de isolamento, preparar 50 ml de lise hipotónico Médio (HLM) contendo 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 e EDTA 1 mM. Adicionar os inibidores da protease de HLM imediatamente antes da utilização e manter o meio em gelo.
- Na capa de segurança biológica, adicionar 4 vezes o volume do pelete celular HLM gelada para as células. Forma suave e profunda voltar a suspender as células por pipetagem as células-se-and-baixo com uma pipeta de 10 ml.
- Incubar as células em suspensão em gelo durante 10 min.
- Transferência das células para o homogeneizador de Dounce, a qual deve estar em gelo. Lentamente homogeneizar as células através da aplicação de 20-25 movimentos suaves com o pilão folgada do homogeneizador.
- Centrifugar o lisado celular a 4 ° C a 3000 xg durante 10 min para remover as células não rompidas, núcleos e restos celulares.
- Recolhe-se o sobrenadante e transferir para um tubo SW28 (ou uma alternativa que pode ser centrifugado a 25.000 x g). Centrifugar a 4 ° C a 25000 x g durante 20 min para remover as mitocôndrias.
3. Isolando gotículas lipídicas por ultracentrifugação
- Preparar 50 ml de carbonato de sódio 100 mM (M 106 g / mol) de tampão (pH 11,5) e 50 ml de solução a 60% (w / w) de sacarose. Adicionar os inibidores de protease para o tampão de carbonato de sódio imediatamente antes da utilização e manter em gelo.
- Recolhe-se o sobrenadante a partir do passo 2.6 para um tubo de centrífuga de 50 ml, ajustara 20% de sacarose e de transferência para a parte inferior de um tubo de ultracentrífuga para o rotor SW28, ou equivalente. Sobrenadante densidade sobreposição ajustado com ~ 10 ml de tampão de carbonato de sódio 100 mM gelado (pH 11,5) e 0,5-1 ml de gelado HLM para encher o tubo.
- Centrifugar a 4 ° C a 130,000 g durante 45 min, utilizando rotor basculante SW28. Permitir rotor a costa a uma parada (rotor desaceleração = 0).
- Recolher a camada flutuante, ajustar para 10% de sacarose e transferir para a parte inferior de um tubo de ultracentrífuga 13,2 ml para um rotor SW41Ti, ou equivalente. Sobreposição densidade ajustada sobrenadante com cerca de 5 ml de tampão de carbonato de sódio 100 mM gelado (pH 11,5) e 0,5 mL de HLM gelada.
- Centrifugar a 4 ° C a 274,000 g durante 60 min utilizando SW41Ti rotor basculante. Permitir rotor a costa a uma parada (rotor desaceleração = 0) para minimizar a interrupção da camada de gotículas de lipídios.
- Recolher cuidadosamente a camada superior flutuante (Figura 2D), contendogotículas lipídicas com uma pipeta de 1 ml e repita o passo 3.4.
- Centrifugar a 4 ° C a 274,000 g durante 30 min utilizando SW41Ti rotor basculante. Permitir rotor a costa a uma parada (rotor desaceleração = 0).
- Recolher cuidadosamente a camada flutuante de cor branca top contendo gotículas lipídicas com uma pipeta Pasteur dobrada em três tubos de 1,5 ml contendo 100 mL HLM.
Fração gotículas lipídicas Caracterização (Protocolos 1 e 2)
A recuperação e a pureza da fracção de gotículas de gordura pode ser verificada por Western Blot combinada com luz ou microscopia electrónica. Além disso, as alíquotas após diferentes passos de centrifugação pode ser recolhida e retida para determinar a eficiência de purificação. Em Western Blotting, é mais apropriado comparar o volume da fração de gotículas de gordura que representa o equivalente a todo o lisado celular de comparar gotículas lipídicas para outras frações de membrana em tEle função do teor de proteína total de 24.
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Representative Results
Se a centrifugação em gradiente de densidade funcionou como esperado, a camada flutuante deve conter gotículas lipídicas e ser desprovido de outros organelos toda a progressão dos spins de alta velocidade.
Para Protocolo 1, Western Blot foram realizadas com anticorpos para marcadores gotículas lipídicas (Erg6p) e organelas que foram encontrados para interagir com gotículas lipídicas em levedura, ER (Dpm1p), mitocôndria (Por1p), membrana plasmática (Pma1p), e vacúolos (Vma1p).
Volumes iguais de camada flutuante de cada três rotações (passos 3,7, 3,10, e 3,13) foram recolhidas, precipitada com ácido tricloroacético (15% de concentração final), e solubilizado em água. 13 mL do lisado de células (Figura 3A, "Lys") e preparação de proteínas de cada uma das três voltas (Figura 3A, "Spin1", "Spin2", e "Spin3") foram separadas em 12% SDS-PAGE, transferidos para nitrocelulose membrana, e imunotransferidas com organela especianticorpos fic. Como esperado, o marcador de proteína de gotículas de gordura Erg6p está presente na camada flutuante, após cada uma das três voltas (Figura 3A); Por1p não está presente na camada flutuante após Spin1 (Figura 3A); Vma1p está esgotado a partir da camada flutuante após Spin2 (Figura 3A) e Dpm1p Pma1p e não estão presentes na camada flutuante após Spin3 (Figura 3A).
Para Protocolo 2, a presença de gotículas lipídicas isoladas de células das vilosidades da placenta prazo humana foi verificada através de coloração com um corante neutro lípido específico de fluorescência, BODIPY 493/503. As gotículas foram então visualizadas com um microscópio de fluorescência (Figura 3B). A pureza das fracções isoladas de gotículas de lípidos foi avaliada através de Western Blot com as proteínas marcadoras de gotículas lipídicas (Perilipin 2), ER (calnexina), Golgi (GM130), mitocôndria (COX IV) e membrana de plasma (MEK1) (Figura 3C). O dr lipídicooplets foram des-lipidados com acetona fria e as proteínas foram extraídas. Iguais percentagens de sobrenadante pós-nuclear (SNP), a fracção abaixo da camada flutuante de a última centrifugação (passo 3.6, "Spin4" na Figura 3C), o passo de lavagem subsequente (passo 3.8, "Spin5" na Figura 3C), e preparação de proteínas de-lipidada da camada flutuante de gotículas de gordura (passo 3.8, "LD" na Figura 3C) foram separadas em 12% SDS-PAGE, transferidos e imunotransferidas com anticorpos indicados. Perilipin 2 (também conhecido como PADR), a proteína de gotículas de gordura, foi detectado no sobrenadante pós-nuclear e no branco camada flutuante isolado contendo gotículas lipídicas. As proteínas específicas para a membrana plasmática (MEK1) e Golgi (GM130) não foram detectadas nas fracções de gotículas lipídicas em qualquer das camadas abaixo da camada flutuante de Spin4 e Spin5. Como relatado anteriormente, a proteína ER calnexina 18,27,28 e uma fraca coloração da proteína da membrana mitocondrial COX IV foram detected em outras partes da fração de gotículas de gordura 22. Estes resultados são consistentes com relatos anteriores que mostram que gotículas lipídicas interagir com mitocôndrias em células de mamíferos e 29 com a ER 30,31.
Figura 1. Gotículas lipídicas celulares em células de levedura de fissão. (A) campo Bright (BF) e ampla fluorescência campo imagens (Fluor.) de seis células representativas levedura onde as gotículas lipídicas são tingidos com BODIPY 493/503. (B) Campo claro (BF ) e ampla fluorescência campo imagens (Fluor.) de um representante esferoplasto onde as gotículas lipídicas são tingidos com BODIPY 493/503. Barras de escala são de 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior oesta figura f.
Figura 2. Camada flutuante após a centrifugação de gradiente de densidade. Tubos de centrífuga após (A) Spin1 (passo 3.8), (B) Spin2 (passo 3.11) e (C) Spin3 (passo 3.14) do Protocolo 1. (D) Tubos de centrífuga após Spin4 (passo 3.6) do Protocolo 2. As camadas flutuantes contendo as gotículas lipídicas são indicados por setas.
Figura 3. Análise da pureza das gotículas lipídicas isoladas. (A) Western blots dos passos chave no protocolo 1. Volumes iguais de cada preparação de proteína (Spin1 - passo 3.7, Spin2 - passo 3.10, e Spi n3 - passo 3.13) foi separado por SDS-PAGE, transferidos para membranas de nitrocelulose, e imunotransferidas com anticorpos para Erg6p (LD, gotículas lipídicas), Dpm1p (ER), Por1p (MT, mitocôndrias), Pma1p (PM, membrana do plasma), e Vma1p (vacúolos). (B) contraste de fase (PC) e largo campo de fluorescência imagens (Fluor.) de BODIPY 493/503-stained gotículas lipídicas que foram isolados a partir de células das vilosidades da placenta humana. (C) Western blot de passos-chave no Protocolo 2. Igual percentagem pf PNS (sobrenadante pós nuclear), o sobrenadante abaixo da camada flutuante após a última rotação (Spin4 - passo 3.6), lavagem subseqüente (Spin5 - passo 3.8), e uma camada flutuante (LD) foram separados por SDS-PAGE, transferidos para membranas e imunotransferidas com anticorpos para perilipin 2 (LD, gotículas lipídicas), calnexin (ER), GM130 (proteína da matriz Golgi, Golgi), COX IV (citocromo c oxidase, MT, mitocôndrias) e MEK1 (MAPK quinase; PM, plasma membrana).ad/50981/50981fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As etapas críticas dentro deste protocolo
Certifique-se para ser consistente com os meios e as densidades celulares durante o crescimento das células em cultura. Gotículas lipídicas celulares são únicos na medida em que as suas proteínas associadas são altamente dependentes do ambiente no qual as células são cultivadas 17. Portanto, os meios de comunicação em que as células são cultivadas e da densidade das células devem ser cuidadosamente monitorizados antes de lise.
A composição de proteína de gotículas de gordura é uma função da fase de crescimento das células de levedura. Menos proteínas serão obrigados a as gotas em fase de crescimento log contra fase estacionária. Além disso, a eficiência spheroplasting é uma função da fase de crescimento das células de levedura. As células na fase de crescimento log têm rendimentos mais elevados de esferoplastos do que as células em fase estacionária, porque estes últimos são mais resistentes ao tratamento enzimático.
tenda ">Certifique-se usar técnicas suaves de abrir as células. Técnicas que quebram a parede celular de levedura por digestão enzimática têm preferência sobre as técnicas que rompem a parede celular através da força aplicada. O último método pode perturbar a integridade estrutural das gotículas resultando na perda de proteínas ou de lípidos ligados.
Evite congelar amostras após as células foram lisadas. Gotas de congelamento não é recomendado, pois isso pode afetar a sua integridade estrutural, resultando na perda de proteína ligado ou lipídios. O congelamento pode também fazer com que as gotículas de fundir ou fragmento 24. Isto pode ser particularmente relevante uma vez que as gotas têm sido observados para fragmentar ou sofrer cisão em células de levedura vivos 25 e assim quebra de gotas maiores em menores é possível. Pedaços de gotículas que fragmento podem não ter a flutuabilidade para aparecer na fcamada loating durante densidade gradiente de centrifugação. Isto poderia reduzir artificialmente o número de factores de gotas que seriam identificadas por meio desta técnica uma vez que a composição de proteína de superfície das gotículas pode ser uma função do tamanho da gotícula 32.
Certifique-se de testar a localização de gotículas de lipídios fatores associados à gotículas lipídicas. Uma das características de gotículas lipídicas é que eles interagem com outras organelas 33-37. Portanto, os fatores de essas organelas são freqüentemente encontrados na fração de gotículas de lipídios. Portanto, é importante o uso de técnicas adicionais para garantir que estes factores de localizar as gotas. Estudos com uma proteína de fusão fluorescente ligada à proteína de interesse em células em que as gotículas lipídicas são coradas com um marcador fluorescente diferente deve ser usado para determinar a extensão de uma co-localização 15. Técnicas tais como a correlação proteína PRofiling pode ser utilizado para quantificar mais a pureza da fracção de gotículas de gordura 15. Em que a estratégia, dois componentes são cada marcados com diferentes aminoácidos contendo isótopos. O primeiro componente é um factor de gotículas de gordura conhecidos, e o segundo componente é a fracção que está a ser analisada. Comparações são então feita entre as localizações das frações das duas componentes.
Modificações e solução de problemas
Modificações Protocolo 1 para isolar gotículas lipídicas das brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae são anotados. Note-se que os tamanhos de gotículas lipídicas pode variar grandemente. Velocidade de centrifugação de gradiente de densidade pode precisar de ser aumentada para gotículas menores para se acumulam na camada flutuante.
Limitações da técnica
Acesso a uma centrífuga de ultra com comowinging rotor de cesto é essencial para o isolamento de gotículas lipídicas celulares. Embora este equipamento é padrão na maioria dos laboratórios de biologia celular e bioquímica, é caro.
Significância da técnica em relação a métodos existentes, ou outros métodos alternativos
Como mencionado acima, um protocolo é fortemente baseado no trabalho de Leber et al. 6 e parte 1 do Protocolo 2 é uma modificação de um protocolo publicado anteriormente por 26 Petroff et al.
Aplicações
Isolamento Lipid gota é mais útil para posterior análise proteômica e lipidomas de proteínas ligadas, lipídios neutros e fosfolipídios. Os estoques de proteínas associadas de gotículas de lipídios e lipídios foram compilados 4,6-17,19,20,22,23,28.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo prêmio American Heart Association 13SDG14500046 para PD, uma Educação Energia Sustentável & Centro de Pesquisa Award (Univ. of Tennessee) para PD, e de Educação Médica dos Médicos e Fundação de Pesquisa (Univ. of Tennessee) prêmio para JM A autores agradecem Caroline Leplante (Yale Univ.) para o protocolo para a conversão de levedura para esferoplastos; Eric T. Boder (Univ. of Tennessee) para o uso de suas incubadoras agitação, mesa centrífuga e Western Blot equipamentos de análise, e do Centro de Biotecnologia Ambiental (Univ. Tennessee) para o uso de seu ultra-centrífuga; Günther Daum para anticorpos levedura (Graz Univ of Technology, na Áustria.); o pessoal do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia (Univ. Tennessee Medical Center) para assistência técnica .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protocol 1 | |||
| 1. Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
| Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
| Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
| YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
| Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
| Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
| Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
| Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
| 1 L glass bottle | |||
| 250 ml flask | |||
| 2.8 L flasks | |||
| 2. Yeast lipid droplet isolation | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge Tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| 12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| Protocol 2 | |||
| 1. Placental villous cells isolation | |||
| Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
| Autoclavable pan (container), 3 L | Fisher Scientific | 1336110 | |
| Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine Science Tools | 1406011 | |
| London Forceps | Fine Science Tools | 1108002 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 1127020 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
| Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
| 40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
| Fisherbrand cell stainers 100 μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
| KCl | Fisher Scientific | P333 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| 2.5% Trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
| DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
| Sodium bicarbonate solution | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| 500 ml Erlenmeyer flasks | |||
| 250 ml Beakers | |||
| 15 ml Centrifuge tubes | |||
| 10 ml Serological pipettes | |||
| 50 ml Centrifuge tubes | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
| 2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
| Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
| Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
| Ultracentrifuge tubes 25 mm x 89 mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
| Ultra-Clear centrifuge tubes 14 mm x 89 mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Disposable borosilicate glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
| Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
| Waterbath | Fisher Scientific | ||
| Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
| Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
| Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
| Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
| SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
| SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
| Western blot | |||
| IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15,000 |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5,000 |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
| Primary antibodies for Protocol 1 | |||
| Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
| Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5,000 |
| Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10,000 |
| Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
| Primary antibodies for Protocol 2 | |||
| Perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
| Calnexin | Cell Signaling Technology | 2679 | dilution 1:1,000 |
| GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
| COX IV | Cell Signaling Technology | 4850 | dilution 1:1,000 |
| MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |
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