Summary
I modsætning til det, der ses for eukaryoter, er der en mangel på undersøgelser, der detaljeret membrandepolarisering og ionkoncentration ændringer i bakterier, primært som deres lille størrelse gør konventionelle målemetoder vanskelig. Her har vi detalje protokoller for overvågning af sådanne begivenheder i den betydelige Gram-positive patogen Streptococcus pneumoniae udnytte fluorescens teknikker.
Abstract
Membrandepolarisering og ionstrømme er begivenheder, der i vid udstrækning er blevet undersøgt i biologiske systemer på grund af deres evne til at dybt påvirke cellulære funktioner, herunder energetics og signal transduktioner. Mens både fluorescerende og elektrofysiologiske metoder, herunder elektrode brug og patch-fastspænding, er blevet godt udviklet til måling af disse begivenheder i eukaryote celler, har metode til måling af lignende hændelser i mikroorganismer vist sig mere udfordrende at udvikle på grund af deres lille størrelse i kombination med mere komplekse ydre overflade af bakterier afskærmning membranen. Under vores studier af død-indvielse i Streptococcus pneumoniae (pneumokokker), ønskede vi at belyse den rolle membran begivenheder, herunder ændringer i polaritet, integritet og intracellulære ion koncentrationer. Søgning litteraturen fandt vi, at der findes meget få undersøgelser. Andre forskere havde overvåget radioisotop optagelse eller ligevægt til at måle ion influenzaxes og membran potentiale og et begrænset antal undersøgelser, primært i Gram-negative organismer, havde set nogle succes ved hjælp carbocyanine eller oxonol fluorescerende farvestoffer til at måle membran potentiale, eller lastning bakterier med celle-permeant acetoxymethyl (AM) ester versioner af ion-følsomme fluorescerende indikatorfarvestoffer. Vi har derfor etableret og optimeret protokoller til måling membran potentiale, sprænges og ion-transport i grampositive organisme S. pneumoniae. Vi har udviklet protokoller ved hjælp af bis-oxonol farvestof DiBAC 4 (3) og den celle-impermeabel farvestof propidiumiodid at måle membrandepolarisering og brud henholdsvis samt metoder optimalt at indlæse pneumokokker med AM estere af ratiometrisk farvestoffer Fura-2, PBFI og BCECF at detektere ændringer i intracellulære koncentrationer af Ca2 +, K + og H +, henholdsvis ved hjælp af en fluorescens-påvisning pladelæser. Disse protokoller er de første af deres art for pneumokokkerog de fleste af disse farvestoffer ikke har været anvendt i andre bakteriearter. Selvom vores protokoller er blevet optimeret til S. pneumoniae, vi mener, at disse tiltag skal danne en glimrende udgangspunkt for lignende undersøgelser i andre bakteriearter.
Introduction
Vores laboratorium har identificeret et protein-lipid-kompleks fra human mælk opkaldt HAMLET (for Human Alpha-lactalbumin Made livsfarlige Tumorceller), som inducerer apoptose i tumorceller, men er også i stand til at dræbe en lang række bakteriearter 1,2. De arter, der blev anset for at være særligt følsomme, var dem, der er målrettet luftvejene, med Streptococcus pneumoniae (den pneumokokker) viser den største følsomhed og en apoptose-lignende fænotype dødens 2,3. Membrandepolarisering og specifik ion transporter er velbeskrevet og afgørende begivenheder i apoptose i eukaryote celler, især i mitokondrierne, hvor radioaktive TPP +-ioner og fluorescerende farvestoffer, herunder JC-1 og TMRE er blevet anvendt til at påvise depolarisering af mitokondriemembranen 3 -5. Således har vi forsøgt at lære mere om effekten af HAMLET på disse membran-relaterede funktioner i pneumokokker, som vi fokuseret vores indsats påudvikle en bedre forståelse af de mekanistiske komponenter i apoptose-lignende fænotype i bakterier, med et stort potentiale for at identificere nye antibakterielle behandlinger eller vaccinekandidater i processen.
I bestræbelserne på at udarbejde protokoller for vores mekanistiske undersøgelser, opdagede vi, at i modsætning til det velbeskrevne metode i eukaryote systemer, der er meget få offentliggjorte undersøgelser beskriver elektrofysiologi og ion transport mekanismer bakteriemembranen 6,7. Dette er primært tilskrives den mindre størrelse af mikroorganismer og deres overflade arkitektur, især tilstedeværelsen af cellevæggen, der begrænser adgangen til membran til anvendelsen af konventionelle eukaryote metoder som patch fastspænding, selv om nogle undersøgelser ved hjælp af gigantiske protoplaster er blevet udført med blandet succes 8,9. Efterhånden som arbejdet med disse gigantiske protoplaster er ikke en ideel eller endog praktisk metode for de fleste bakterielle arter, da det kræver mandipulated bakterier i en unaturlig og abiotisk tilstand, har de begrænsede undersøgelser af bakteriemembran polaritet der er blevet udført primært beskæftiget flowcytometri og brugen af cyanine og oxonol fluorescerende farvestoffer 10-16.
I stedet for flowcytometri, som samler de enkelte fluorescensaflæsninger fra en bakterie på et enkelt tidspunkt, valgte vi at anvende en fluorescenspåvisning pladelæser at detektere fluorescens intensitet af bakterielle suspensioner i en 96-brønds plade-format over tid. Dette gjorde det muligt at behandle en population af bakterier på forskellige tidspunkter med meget større enkelhed og lethed, og løbende overvågning af fluorescens kinetik af hele befolkningen i længere tid, hvilket er vanskeligt at opnå ved anvendelse af flowcytometri. Efter at have testet en lang række af de potentielle følsomme fluorescerende farvestoffer (herunder de ovenfor nævnte til brug med mitokondrier), opnåede vi det bedste tekniske og praktiske succes ved hjælp afbis-oxonol farvestof kaldet DiBAC 4 (3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric syre) trimethine oxonol) for at overvåge ændringer i polaritet.
Vi har også fundet det værdifuldt at samtidig overvåge forstyrrelser i integriteten af membranen ved hjælp af propidiumiodid (PI). Dette farvestof fluorescerer efter binding til nukleinsyre, men er kun i stand til at gøre det, når integriteten af den bakterielle membran er kompromitteret, hvilket gør det til det populære komponent, der anvendes til at påvise døde celler i levende-døde farvningsmetoder analyser. Ud over PI, SYTOX grøn og TO-PRO-1 er fluorescerende farver, der ligner i aktion og har tidligere været anvendt til bakterier i nogle undersøgelser ved hjælp af flowcytometri påvisningsmetoder 17. Vi valgte at bruge PI grund af sin excitation bølgelængde, der gav os mulighed for at overvåge fluorescens samtidig med DiBAC i en given prøve.
I vores undersøgelser har vi observeret, at HAMLET, såvel som et andet beslægtet protein-lipid-kompleks med baktericid aktivitetkendt som ELOA inducerede depolarisering og brud af den bakterielle membran som angivet ved stigninger i fluorescensen af begge farvestoffer ved behandling af pneumokokker 3,18,26. For begge komplekser, observerede vi, at fluorescensintensiteten af DiBAC 4 (3) forøget forud for forøgelse af intensiteten af PI, hvilket indikerer, at depolarisering fundet sted forud for brud og er derfor en specifik hændelse induceret af vores baktericide protein-lipid-komplekser af interesse. Denne sondring er vigtig at gøre, som brud på membranen selv kan forårsage uspecifik depolarisering. Måling og analyse af både DiBAC 4 (3) og PI fluorescens kinetik samtidig tilladt os at undersøge dette forhold mellem de to membran begivenheder, hvilket er en yderligere fordel ved at bruge fluorometri stedet for flowcytometri.
At overvåge bakteriel ion flux, har der været nogle tidligere succes med at bruge radioisotoper, herunder måle optagelse af45 Ca 2 + i pneumokokker 19,20, som vi også har brugt i vores seneste undersøgelser 18, 21. Men, der arbejder med disse radioaktive ioner har flere ulemper. De kan være dyrt, tidskrævende og rodet, og kan også udsætte den enkelte udfører eksperimentet til skade, afhængigt af isotop af interesse. Desuden er det vanskeligt at overvåge hurtige ændringer over tid. Således har vi vendt mod en alternativ målemetode, der beskæftiger acetoxymethyl (AM) ester versioner af ion-følsomme fluorescerende indikator farvestoffer. I sig selv er indikatorfarvestoffet opladet og ikke passere gennem membranen let, men med tilsætning af den lipofile estergruppe, kan nu uladet molekyle passere gennem membranen af bakterien. Ved ankomsten det indre, de bakterielle esteraser spalter estergruppen efterlod farvestof fri inde i cellen og sigtet igen betydeligt langsommere dens evne til at forlade cellen og tillade farvestoffet to ophobes inde over tid. Imidlertid har brugen af disse ester farvestoffer kun været beskrevet i nogle få bakteriearter at konstatere ændringer i intracellulær Ca 2 + 22-24 og H + 16, med varierende metoder til lastning, afsløring og succes.
Med et ønske om at overvåge ændringer i intracellulær Ca 2 + og også K + og H + niveauer i S. pneumoniae ved behandling med HAMLET og andre forbindelser, vi med succes skabt protokoller til effektivt at indlæse fluorescerende indikatorfarvestoffer i bakterieceller. Effektiv læsning ind i bakterier, der kræves både probenecid, der øger farvestof fastholdelse ved at blokere anion-transportører og kraftladning, en proprietær forbindelse fra Life Technologies, der øger læsning effektivitet. Fura-2/AM (påvisning af Ca 2 +), PBFI / AM (påvisning af K +), og BCECF / AM (påvisning af H +) blev indlæst i både uindkapslet og indkapslet pneumokok stregnskyl muliggør måling af de resulterende fluorescens mønstre efter tilsætning af ionoforer, såsom ionomycin (Ca 2 + afkobler), valinomycin (K + afkobler) og CCCP (H + afkobler) med en fluorescenspåvisning pladelæser 18, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forberedelse bakteriekulturer
- Voksende kultur til anvendelse i eksperimenter
- I en 37 ° C varmeblok, optø en frossen lager hætteglas S. pneumoniae og tilføjer dens indhold til 9 ml frisk, foropvarmet Todd-Hewitt-bouillon med 0,5% gærekstrakt (THY) til et samlet volumen på 10 ml i et glas kultur rør.
- Inkuberes statisk ved 37 ° C, indtil kulturen når mid-log-fase (Abs 600 nm ≈ 0,5-0,6).
2. Afsløring membrandepolarisering og Rupture
- Forberedelse reagenser
- Forbered en 50 uM bestand af DiBAC 4 (3) i 100% DMSO, og en 2 mg / ml bestand af PI i Hedeselskabet 2 O. Den DiBAC 4 (3) bestanden er stabil ved -20 ° C i mindst 6 måneder. PI bestanden er stabil ved 4 ° C i mindst 6 måneder.
- Wrap bestande i folie for at beskytte mod lys.
- Loadingbakterier
- Pelleter bakterieceller fra trin 1.2.2 ved centrifugering ved 2.400 x g i 10 minutter ved stuetemperatur og vaskes to gange ved at fjerne supernatanten resuspendere pelleten i 10 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS) og centrifugeres igen ved 2.400 xg i 10 min.
- Fjern supernatanten og resuspender pelleten i PBS til det oprindelige volumen. Det vil give cirka 10 8 kolonidannende enheder af bakterier per ml. Fjern 1 ml (nok til 5 prøver) af de vaskede celler og anbringes i et mikrocentrifugerør.
- Til disse celler, tilsættes 25 pi af en 1 M filtersteriliseret stamopløsning af glucose (fremstillet i ddH2O og filtreret gennem et 0,45 um filter) til en slutkoncentration på 25 mM glucose og inkuberes i en 37 ° C varmeblok til femten minutter. BEMÆRK: Det giver energi til alle ATP-afhængige membran kanaler og cellulære komponenter. Behovet for dette trin kan variere afhængig af eksperimentet.
- Tilsæt 5 ul af 50 uM DiBAC 4 (3) bestand og 10 ul af 2 mg / ml PI lager. Dette giver slutkoncentrationer på 250 nM og 20 ug / ml. Bland omhyggeligt ved pipettering op og ned flere gange. Tilsæt 200 pi af denne cellesuspension til hver prøvebrønd i en klar plade med 96 brønde.
- Bestemmelse af fluorescens
- Sæt plade i en forvarmet (37 ° C) fluorescenspåvisning pladelæser.
- Sørg for, at passende filtre er på plads for DiBAC 4 (3) (490 nm excitation, 516 nm emission) og PI (535 nm excitation, 617 nm emission) detektion.
- At give mulighed for (og samtidig overvåge) ligevægt af DiBAC 4 (3) over membranen, sætte læseren til at tage fluorescensmålingerne hver min i ca 30-40 min, eller indtil læsning stabiliserer, dette tjener som en "forbehandling" læsning.
- Skub pladen og tilsæt den eksperimentelle agent valg og immediately placere pladen tilbage i læseren til at fortsætte overvågningen DiBAC 4 (3) og PI fluorescens til den ønskede længde af tid. Hvis behandling af flere prøver på en gang, ved hjælp af en multikanalpipette kan være nyttigt at tilføje agenten samtidig til alle brønde.
- Eksporter aflæsningerne til en data-analyse program som Microsoft Excel. Plot fluorescens over tid for at evaluere membrandepolarisering og brud. Stigende fluorescens DiBAC og PI indikerer, at depolarisering og brud forekommer.
3. Afsløring Ændringer i intracellulære Ca 2 + eller K + Koncentrationer
- Forberedelse reagenser og loadingbuffer
- Forbered følgende reagenser: 5 mM lager af ion-følsomme fluorescerende farvestof (Fura-2/AM eller PBFI / AM, tilsæt passende mængde DMSO til et rør, der indeholder 50 ug af farvestoffet), "100x" probenecid (tilsæt 1 ml PBS til et hætteglas 77 mg). Den solubiliseredefarvestoffer kan fryses ved -20 ° C en gang og er stabile i opløsning i 3 måneder, mens probenecid er stabilt i opløsning ved -20 ° C i 6 måneder.
- Forbered 1 ml 2x Loading Buffer som følger: På bunden af en 15 ml plast konisk rør, dispensere 20 ul 100x kraftladning koncentrat (stabile ved 2-8 ° C i 6 måneder), efterfulgt af 2 pi af 5 mM ion -sensitive farvestof direkte i kraftladningen. Vortex kortvarigt at blande. Tilføj 960 pi PBS efterfulgt af 20 pi 100x probenecid. Vortex blandingen en sidste gang. Wrap i folie for at beskytte mod lys.
- Loading bakterierne med farvestof
- Pellet og vaske mid-log-fase bakteriekultur som beskrevet i 2.2.1. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 5 ml PBS for at lave en "2x" celle suspension.
- Tilsæt 1 ml 2x cellesuspension til 2x Loading Buffer. Dette vil give et endeligt volumen på 2 ml, og endelig concentrsammenslutninger af 1x kraftladning, 5uM fluorescerende farvestof, og 1x probenecid. BEMÆRK: Denne suspension giver nok volumen til 10 prøver, idet hver prøve godt for måling vil indeholde 200 ul.
- Inkuberes i et 37 ° C vandbad i 75 minutter beskyttet mod lys. BEMÆRK: Farvestoffet er indlæst i de bakterielle celler i fravær af eventuelle glycolytiske substrater og i nærvær af probenecid for at minimere udstrømning af farvestoffet.
- WASH 1: Pelleter cellerne ved centrifugering ved 2.400 x g i 10 minutter, fjern supernatanten og resuspender i 2 ml PBS indeholdende 1x probenecid. WASH 2, 3: Gentag trin 3.2.4 2x. Der inkuberes ved 37 ° C i yderligere 30 minutter. Dette vil give tid til bakterielle esteraser at hydrolysere AM estergruppen væk fra de internaliserede fluorescerende farvestoffer.
- WASH 4: Pelleter cellerne ved centrifugering ved 2.400 x g i 10 minutter, fjern supernatanten og resuspender i 2 ml PBS indeholdende 1x probenecid. BEMÆRK: Afhængigt af experiment, kan glukose lægges tilbage her relancerer bakterier.
- Bestemmelse af fluorescens
- Opvarmning af den fluorescenspåvisning pladelæser pladelæser til 37 ° C.
- For hvert ønsket prøve tilsættes 200 pi af de fyldte celler (fra trin 3.2.8) til brøndene i en 96-brønds plade. (Udfør følgende trin til afslutning for en brønd / prøve ad gangen).
- At etablere en baseline læsning for et godt, sted plade i fluorescensdetektion plade-reader til at måle fluorescens (340 nm excitation / 510 nm emission for "Værdi 1" og 380 nm excitation / 510 nm emission for "Value 2") ved hver sek én min.
- Skub pladen, tilsæt behandling af valg til at godt (i et lille volumen på cirka 5 ul), hurtigt pipette op og ned et par gange for at blande, og straks placere tilbage i fluorescensdetektion plade-reader til at læse hver sekund for den ønskede tidsrum. (Hvis ijectors forbundet med pladelæseren er tilgængelige, kunne disse også anvendes til problemfrit at tilføje den ønskede behandling, hvilket eliminerer behovet for at standse læse-og skubbe pladen).
- Eksporter aflæsningerne til en data-analyse program som Microsoft Excel. Beregn forholdet mellem fluorescens værdier for hver gang-point ved at dividere Værdi 1 af Værdi 2, og plot ratio værdier på en graf.
4.. Detektering af ændringer i intracellulær pH
- Forberedelse reagenser og kalibreringsbuffere
- Forbered følgende reagenser: 5 mM bestand af BCECF / AM (. Tilsæt passende mængde DMSO til et rør, der indeholder 50 ug af farvestoffet Denne bestand er stabil ved -20 ° C i 3 måneder), 100x probenecid (tilsæt 1 ml PBS til et hætteglas 77 mg). 1 mM stamopløsning fremstilling af nigericin i ethanol (der kræves for at ækvilibrere den intracellulære pH-værdi (pH i) cellerne til pH af den omgivende buffer Denne bestand er sbord ved -20 ° C i 6 måneder). 0,5 mM lager carbonylgruppetransmitter cyanid 3-chlorphenylhydrazon (CCCP) i DMSO (protonophore at afkoble proton drivkraften Denne bestand er stabil ved -20 ° C i 6 måneder)
- Forbered 10 ml af følgende høje kalium buffere: 135 mm KH 2 PO 4/20 mM NaOH (monobasisk) og 110 mm K 2 HPO 4/20 mM NaOH (dibasisk). Filtersteriliser ved anvendelse af et 0,45 um filter. (Disse buffere kan opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse).
- Bland de høje kalium buffere på de nødvendige proportioner til at skabe høj kalium buffere med mindst 5-6 pH-værdier i området fra 6,5 til 8,0.
- Forbered 1 ml 2x Loading Buffer som følger: På bunden af en 15 ml plast konisk rør, dispensere 40 pi 100x kraftladning, efterfulgt af 20 pi af 5 mM ion-følsomme farvestof direkte i kraftladningen. Vortex kortvarigt at blande. Tilføj 900 pi PBS efterfulgt af 40 pi 100x probenecid. Vortex blandingen en sidste gang. Wrap i folie for at beskytte mod lys.
- Loading bakterierne med farvestof
- Pellet og vaske 8 ml mid-log-fase bakteriekultur som beskrevet i 2.2.1. Fjern supernatanten, resuspender pellet i 2 ml PBS at lave en "4x" celle suspension.
- Tilsæt 1 ml 4x cellesuspension til 2x Loading Buffer. Dette vil give et endeligt volumen på 2 ml, og de endelige koncentrationer af 2x celler, 2x kraftladning, 50 pM fluorescerende farvestof, og 2x probenecid.
- Inkuber i en 30 ° C vandbad i 40 minutter beskyttet mod lys. BEMÆRK: Farvestoffet er indlæst i de bakterielle celler ved den lavere temperatur på 30 ° C, og i mangel af glykolytiske substrater for at minimere udstrømning af farvestoffet.
- WASH 1: Pellet cellerne ved centrifugering ved 2.400 xg i 10 min, fjerne supernatanten at slippe af med overskydende farvestof, og resuspender i 4 ml PBS indeholdende 2x probenecid ennd 1 mM glucose (for at reenergize bakterier). WASH 2, 3: Gentag trin 4.2.7 to gange, med den endelige resuspendering i 4 ml PBS (til en endelig koncentration på 1x celler) indeholdende 2x probenecid og 10 mM glucose.
- Inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Dette vil lade cellerne fuldt energi og give tid til bakterielle esteraser for at spalte AM estergruppen fra internaliseret BCECF.
- Etablering baggrundsfluorescens og in vivo kalibreringskurve
- Opvarmning af den fluorescenspåvisning pladelæser pladelæser til 37 ° C.
- For at bestemme baggrundsfluorescens, filter-sterilisere omkring 500 ul af lastet og energi bakteriesuspension (fra trin 4.2.7) for at fjerne bakterier, og der tilsættes 200 pi filtrat til brønd i 96-brønds plade.
- Anbring pladen i fluorescensdetektion plade-reader til at måle fluorescens (490 nm excitation / 530 nm emission for"Value 1" og 440 nm excitation / 530 nm emission for "Value 2") i 1 min. Denne baggrund fluorescens skal trækkes før beregning af nøgletal for både kalibreringskurve og de eksperimentelle prøver.
- For at opnå en in vivo kalibreringskurve, vask 500 gl portioner af læsset og strømførende celler fra trin 4.2.7 én gang og resuspender i høje kalium buffere ved forskellige pH-værdier (spænder fra 6,5 til 8,0).
- Tilsæt 20 uM nigericin prøverne at ækvilibrere den intracellulære pH-værdi af cellerne til pH af den omgivende buffer og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. Tilsæt 200 pi af bakterier / pH buffer kombinationer til brøndene i en 96-brønds plade.
- Placer plade i fluorescenspåvisning pladelæser at måle fluorescensen i et par minutter for at etablere en stabil aflæsning for hver brønd. Eksporter aflæsningerne til en data-analyse program som Microsoft Excel.
- Efter subtraktion af baGGRUND fluorescens værdier beregne forholdet mellem fluorescens-værdier ved at dividere Værdi 1 af Værdi 2. Plot forholdsværdierne for hver pH-buffer for at skabe kalibreringskurven. (En kalibreringskurve skal genereres for hver ny batch af loaded celler, da mængden af fluorescerende farvestof, der er lagt ind i bakterier kan variere hver gang).
- Måle ændringer i intracellulær pH
- For hvert ønsket prøve tilsættes 200 pi af de fyldte og strømførende celler (fra trin 4.2.7) til brøndene i en 96-brønds plade.
- Placer plade i fluorescenspåvisning pladelæser og måle fluorescensen af prøverne hvert 5. sek til 5 min.
- Skub pladen og tilføje 10 uM CCCP til en brønd (tjener som positiv kontrol for faldende intracellulær pH) og den eksperimentelle middel (r) af interesse for de øvrige brønde. Præcist at sammenligne deres virkninger over tid, tilsæt CCCP og agenter valg på samme tid ved hjælp amultichannel pipette.
- Øjeblikkeligt returnere pladen til pladelæser og fortsætte med at måle fluorescens hver 5 sek til 10 min. Som en yderligere kontrol, skubbe pladen og tilsættes 20 uM nigericin til alle prøver for at ækvilibrere pH i af bakterierne til pH af den omgivende buffer og læse for 5 min.
- Efter fradrag fluorescensværdierne baggrund, beregne nøgletal for fluorescens for hver prøve. Interpolere pH i for hver aflæsning fra kalibreringskurven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For alle eksperimenter er der en prøve og sæt betingelser er til stede i hver brønd. De enkelte sporing repræsenterer fluorescensintensitet af en hel population af bakterier over tid. Resultaterne skal være let fortolkelige, med en klar skelnen mellem fluorescensen af de behandlede prøver og at af de ubehandlede kontroller. Kinetik og graden af en observeret ændring i fluorescens kunne give oplysninger om mulig mekanisme og omfanget af den begivenhed, der overvåges.
Når udforske membran polaritet, skal inkuberes med DiBAC for omkring 40 min for at tillade ækvilibrering af farvestoffet over membranen, som angivet ved det stadige fald og efterfølgende udjævning af fluorescens i figur 1A før behandling bakterierne. Som vist i figur 1B, er PI ikke kræver ækvilibrering som dens fluorescerende signal er stabil gennem de første 40 minutters inkubation, but sin tilstedeværelse sammen med DiBAC er nyttigt at overvåge membran brud i takt med polaritet. Depolarisering og brud af bakterierne er angivet med en stigning i fluorescensintensitet af begge farvestoffer. Andre agenter i stand til depolarisering og brud, såsom (natriumdeoxycholat 18) vaskemidler, uncouplers eller ionophorer (CCCP), kan også tilsættes for at demonstrere disse begivenheder ved hjælp af denne metode.
For Fura-2/AM, PBFI / AM, og BCECF / AM, er forholdet mellem to fluorescerende signaler beregnet, og en stigning eller et fald i dette forhold svarer til den intracellulære Ca 2 + (Figur 2), K + (Figur 3 ) og H + (Figur 4) koncentrationer hhv. Efter tilsætning af calciumionophor ionomycin, Ca 2 + strømmer ind i cellen forårsager en stigning i fluorescens-forhold (figur 2). Tilsætning af valinomycin har den modsatte effekt, der forårsager K+ At strømme ud af cellen og nedsætte den intracellulære koncentration, som er angivet med et fald i fluorescens-forhold (figur 3). BCECF giver mulighed for måling af intracellulær pH ved først at skabe en kalibreringskurve (figur 4A) i nærvær af forskellige buffere med kendt pH. Et fald i fluorescens-forhold af farvestoffet svarer til et fald i pH, som ses efter tilsætning af protonophores CCCP eller nigericin, som kollapser protongradienten (figur 4B).
Figur 1. Overvågning membran forstyrrelser. S. pneumoniae blev inkuberet med (A) DiBAC og (B) PI samtidig i 40 min for at tillade ækvilibrering af DiBAC over membrane. Ved afslutningen af denne inkubation (pil), PBS (ubehandlet) eller HAMLET (behandlet) tilsat, og prøverne blev læst yderligere en time. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Detektere ændringer i intracellulære calcium niveauer. Pneumokokker blev indlæst med Fura-2/AM og behandlet (pil) med PBS (ubehandlet) eller calciumionophor ionomycin (positiv kontrol). Forholdet mellem fluorescens-værdier er præsenteret. Klik her for at se større billede.
Figur 3.. Detektere ændringer i intracellulære kalium niveauer. Pneumokokker blev lastet med PBFI / AM og behandlet (pil) med PBS (ubehandlet) eller kalium ionophoren valinomycin (positiv kontrol). Forholdet mellem fluorescens-værdier er præsenteret. Klik her for at se større billede.
Figur 4.. Detektere ændringer i intracellulære proton niveauer. (A) Standard kurve for intracellulær pH-kalibrering. (B) Pneumokokker blev læsset med pH-følsomme farvestof BCECF-AM, og varvasket og resuspenderet i PBS + glucose. Efter optagelse baseline aflæsninger ved den første pil, PBS (sort), den protonophore CCCP (100 uM) eller HAMLET (100 pg / ml eller 6 uM) blev tilsat til bakterierne og fluorescens blev målt over tid. På den anden pil nigericin (20 uM) blev sat til fuldt imødegå den transmembrane proton gradient af alle prøverne. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På trods af den begrænsning, at størrelsen præsenterer for brug af klassiske elektrofysiologi metoder til at detektere ændringer i polaritet og integriteten af membranen og ændringer i ion-koncentrationer inden bakterier, har vi beskrevet en måde at måle disse hændelser i S. pneumoniae anvendelse af fluorescerende farvestoffer. Vores protokoller er det første af sin art beskrevet for pneumokokker og en af de få beskrevet for bakteriearter i almindelighed. Ved hjælp af en fluorescenspåvisning pladelæser kan måles disse begivenheder i små, 200 pi volumen prøver af bakterier med fluorescens detekteret fra de enkelte population af bakterier over tid. Kinetikken og ændringer i fluorescensintensitet kan anvendes til kvalitativt at bestemme, hvad der sker med membranen polaritet eller integriteten eller niveauer af Ca2 +, K +, eller H + i bakterier. Kvantitativt set kan fluorescensintensiteten værdier også anvendes til at beregne graden af depolarization, sprænges calciumoptagelse, kalium efflux, eller pH-ændring observeret i en prøve i forhold til en anden, der giver kritiske oplysninger om en mekanisme af interesse. Derudover bør vores protokol være anvendelige som et udgangspunkt for ilægning af andre AM fluorescerende farvestoffer, der giver mulighed for undersøgelse af en række andre cellulære begivenheder i en række bakterielle arter. Vi har allerede haft succes med at anvende nogle af disse protokoller i Staphylococcus aureus 21..
Ved brug af AM farvestoffer, rigelig Inkubationstiden er vigtigt for farvestof lastning og opnå den efterfølgende hydrolyse nødvendig for farvestoffet til at reagere på de mål ioner inden for bakterier, og giver de tilsvarende fluorescens ændringer. Lastning kinetik kan variere mellem bakteriestammer skyldes flere faktorer, herunder forskelle i bakteriel overflade arkitektur (kapsel tilstedeværelse, membranfluiditet, tilstedeværelse af effluxpumper osv.) Og i den kemiske struktur of farvestoffet. For at opnå maksimal belastning for bakteriestammen og farvestof af interesse, er der flere parametre for vores protokol, der kan kræve modulation herunder: inkubation varighed, inkubationstemperatur, tilgængeligheden af næringsstoffer, kraftladning koncentration og probenecid koncentration. For at opnå succes lastning, fluorescens signal intensitet er mindre vigtig end at vise, at positive kontroller, såsom tilføjelse af ionophorer, giver et signal i den rigtige retning, og / eller som viser linearitet i kalibreringskurven. For at optimere ilægning af en stigning i kraftladning og Probenicide koncentration efterfulgt af en sænkning af temperaturen for at undgå ekstrudering af farvestoffet foretrækkes at øge farvestofkoncentration der kan resultere i ekstracellulær farvning, der vil forvirre signalet. Under udviklingen af vores protokoller, var vi i stand til at indlæse vores farvestoffer af interesse i både vildtype indkapslet pneumokok stamme D39 og indkapslet stamme R36A 25.Vi fandt imidlertid, at vi kunne opnå optimal belastning som angivet ved fluorescerende aflæsninger fører til øget forhold anvender R36A til Fura-2-og PBFI eksperimenter under anvendelse af 37 ° C inkubationstemperatur, mens en lavere inkubationstemperatur kombineret med højere kraftladning og probenecidtabletter koncentrationer fungerede bedre til lastning af BCECF i D39. Selv specifikt signal intensitet kan variere mellem eksperimenter, den ratiometrisk karakter af målingerne forudsat resultater med høj reproducerbarhed og lille spredning.
Til fluorescens målinger af prøver, brug af softwaren, der følger mest avancerede pladelæsere giver mulighed for justeringer af en række forskellige parametre påvisning, herunder afsløring hastighed, afsløring følsomhed, og læse varighed, for at nævne et par stykker. Dette gør det muligt for forskeren at finde den optimale følsomhed til påvisning af den pågældende begivenhed, der bliver overvåget. For optimal fortolkning af resultaterne, er det afgørende, at stabile basislinjer fluorescence og lineær standardkurver er etableret, da der kan være inter-assay variationer i mængden af farvestof, der er til stede, i ligevægt over membranen, eller indlæses i bakterierne og hydrolyseret. Giver tid til farvestof ækvilibrering over bakteriemembranen før behandling af enhver art er særlig vigtigt, når der anvendes DiBAC 4 (3) for at muliggøre en stabiliseret fluorescens niveauet før behandling. Derudover, herunder alle de rigtige kontroller i hver enkelt analyse er afgørende for nøjagtig dataanalyse, da de eksperimentelle additiver, der føres ind bakteriesuspensionen skal testes kan selv autofluoresce på de særlige bølgelængder af afsløring eller måske uspecifikt ændre fluorescens indikatorfarvestof via direkte interaktioner.
Vi anerkender nogle potentielle problemområder er forbundet med de metoder, som vi har beskrevet her. I modsætning til carbocyanine dye DiOC 2 (3), DiBAC 4 (3) er en bisoxonol farvestof, der ikke er ratiometrisk, så mens carbocyanine farvestof kan redegøre for ændringer i celle volumen, DiBAC 4 (3) ikke kan. Således kan der ske ændringer i niveauet af fluorescens, som svarer til ændringer i cellevolumen. Vi imidlertid ikke bemærke dette at være et stort problem, da det pneumokokker har en stiv cellevæg, der ikke tillader væsentlige ændringer i volumen uden brud bakterier. For at undersøge bakterielle ionstrømme kan følsomheden af ion-følsomme farvestoffer variere afhængigt af ion af interesse og graden af forandring i sin koncentration. Derudover er anvendelsen af fluorescerende farvestoffer er forsøgsmæssigt ikke så direkte en fremgangsmåde som anvendelse af radioaktive isotoper. Men afhængigt af den ion af interesse, at undersøge fluorescens er en meget mere praktisk løsning, når de overvejer både økonomiske og sikkerhedsrelaterede begrænsninger forbundet med brugen af radioaktive isotoper. Således de metoder, der er beskrevet i dette manuskript give ny og konsekvent tilganges til bedre studiemiljø membran polaritet, integritet og transport begivenheder, og i bakterielle systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Bill og Melinda Gates Foundation (Grant 53085), JR Oishei Foundation og The American Lung Association (Grant RG-123.721-N) til APH, og NIH (NIDCD) stipendium F31DC011218 til ØK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Bacto, BD Diagnostics | 249240 | |
| Yeast Extract | Bacto, BD Diagnostics | 212750 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2) | Invitrogen (GIBCO) | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | DMSO |
| DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) | Molecular Probes | B-438 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Make up in deionized water |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| PowerLoad | Molecular Probes | P10020 | 100x concentrate |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | Make 100x stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial |
| Fura-2/AM | Molecular Probes | F1221 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| PBFI/AM | Molecular Probes | P1267 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | |
| KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | monobasic |
| NaOH | JT Baker | 5565-01 | |
| K2HPO4 | JT Baker | 4012-01 | dibasic |
| BCECF/AM | Molecular Probes | B1170 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| CCCP | Sigma-Aldrich | Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, dissipating the electrical potential and the H+ gradient. | |
| Culture tube | VWR | 53283-802 | Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | Spectronic 20D+ | |
| 15 ml Plastic conical tube | Corning | 430790 | |
| Clear 96-well polystyrene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Plate reader | BioTek | Synergy 2 Multi-Mode | |
| Gen5 software | BioTek | Gen5™ Software |
References
- Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).
- Hakansson, A., et al. A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).
- Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex. PLoS One. 6 (3), (2011).
- Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria. Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (Δψ m) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).
- Dominguez, D. C. Calcium signalling in bacteria. Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).
- Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family. Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).
- Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. A patch-clamp study of Bacillus subtilis. Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).
- Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).
- Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique. Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).
- Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).
- Shapiro, H. M. Membrane potential estimation by flow cytometry. Methods. 21 (3), 271-279 (2000).
- Shapiro, H. M. Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques. J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).
- Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions. Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).
- Suzuki, H., Wang, Z. -Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes. Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).
- Breeuwer, P., Abee, T. Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques. Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).
- Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).
- Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death. J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).
- Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential. J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).
- Trombe, M. C. Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence. J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).
- Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
- Futsaether, C. M., Johnsson, A. Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes. Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).
- Tisa, L. S., Adler, J. Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content. J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).
- Werthen, M., Lundgren, T. Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens. J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).
- Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).
- Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against. PLoS One. . 8, (2013).
