Summary
שלא כמו שראה לאאוקריוטים, יש מיעוט מחקרים ששלילת קוטביות קרום פירוט וריכוז יונים שינויים בחיידקים, כגודלם הקטן בעיקר הופך את השיטות מקובלות של מדידה קשה. כאן, אנו פרוטוקולי פרט לניטור אירועים כאלה בפתוגן גראם חיובית המשמעותי Streptococcus pneumoniae תוך שימוש בטכניקות הקרינה.
Abstract
נתיבי שלילת קוטביות קרום ויון הם אירועים שנחקרו רב במערכות ביולוגיות בשל היכולת שלהם להשפיע עמוקות תפקודים תאיים, כולל האנרגטיקה וtransductions אות. בעוד שני שיטות הניאון ואלקטרו, ובכלל זה שימוש אלקטרודת ותיקון-clamping, פותחו גם למדידת אירועים אלה בתאי אוקריוטים, מתודולוגיה למדידת אירועים דומים במיקרואורגניזמים הוכיחו יותר מאתגר כדי לפתח בהתחשב בגודל הקטן שלהם בשילוב עם יותר מורכב משטח חיצוני של חיידקי מיגון הממברנה. במהלך הלימודים של מוות חניכה בStreptococcus pneumoniae (pneumococcus) שלנו, אנחנו רוצים להבהיר את התפקיד של אירועי קרום, לרבות שינויים בקוטביות, יושרה, וריכוזי יון תאיים. חיפוש בספרות, מצאנו כי מעט מאוד מחקרים קיימים. חוקרים אחרים היו במעקב ספיגת radioisotope או שיווי משקל כדי למדוד שפעת יוןXES וקרום פוטנציאלי ומספר מצומצם של מחקרים, רובם באורגניזמים גראם שליליים, שראו הצלחה מסוימת באמצעות carbocyanine או oxonol צבעי ניאון למדידת פוטנציאל ממברנה, או טעינת חיידקים עם acetoxymethyl תא permeant (AM) גרסאות אסתר של יון רגיש צבעי ניאון מחוון. לפיכך, אנו הוקמו ומותאמים פרוטוקולים למדידת פוטנציאל ממברנה, קרע, ויוני תחבורה באורגניזם גראם החיובי ס דלקת ריאות. פיתחנו פרוטוקולים באמצעות צבע bis-oxonol DiBAC 4 (3) ויודיד propidium לצבוע תאי impermeant למדוד שלילת קוטביות קרום וקרע, בהתאמה, כמו גם שיטות לטעינה אופטימלית pneumococci עם אסטרים AM של צבעי ratiometric פורע-2, PBFI, וBCECF כדי לזהות שינויים בריכוזי תוך תאיים של Ca 2 +, K +, ו-H +, בהתאמה, באמצעות קורא צלחת הקרינה איתור. פרוטוקולים אלה הם הראשונים מסוגם לpneumococcusורוב הצבעים האלה לא היה בשימוש בכל מיני חיידקים אחרים. למרות שהפרוטוקולים שלנו כבר מותאמים לס pneumoniae, אנו מאמינים גישות אלו צריכות להוות נקודת התחלה מצוינת למחקרים דומים במינים חיידקים אחרים.
Introduction
המעבדה שלנו זיהתה חלבון מורכב שומנים מחלב אדם בשם המלט (לאדם Alpha-lactalbumin Made קטלני לתאים סרטניים), שגורם לאפופטוזיס בתאים סרטניים, אבל הוא גם מסוגל להרוג מגוון רחב של מיני חיידקי 1,2. המינים שנמצאו להיות רגיש במיוחד היו אלה המכוונים את דרכי נשימה, עם Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) בו מוצגות הרגישות הגדולה ופנוטיפ כמו אפופטוזיס, מות 2,3. אירועי תחבורת שלילת קוטביות קרום ויון ספציפיים שתוארו היטב ואירועים מכריעים באפופטוזיס בתאי אוקריוטים, בפרט במיטוכונדריה, שבו יונים רדיואקטיביים TPP + וצבעי ניאון כולל JC-1 וTMRE היו בשימוש כדי להדגים שלילת קוטביות של קרום המיטוכונדריה 3 -5. לפיכך, אנו מבקשים ללמוד יותר על ההשפעה של המלט על תכונות הקשורות לממברנה אלה בpneumococcus כפי שאנו מתמקדים מאמצינולפתח הבנה טובה יותר של הרכיבים מכניסטית של פנוטיפ כמו אפופטוזיס, בחיידקים, עם פוטנציאל גדול לזיהוי טיפולי אנטיבקטריאלי רומן או מועמדי חיסון בתהליך.
במבקש להקים פרוטוקולים עבור המחקרים מכניסטית שלנו, גילו כי בניגוד למתודולוגיה שתוארה היטב במערכות אוקריוטים, יש מעט מאוד מחקרים שפורסמו מפרטים מנגנוני אלקטרופיזיולוגיה והובלת יונים של 6,7 קרום החיידק. זו מיוחסת בעיקר לגודל הקטן יותר של מיקרואורגניזמים ואדריכלות פני השטח שלהם, ובמיוחד את נוכחותו של דופן תא, המגבילה את הנגישות של הקרום לשימוש בשיטות אוקריוטים קונבנציונליות כמו הידוק תיקון, אם כי כמה מחקרים באמצעות protoplasts הענק בוצעו בהצלחה מעורבת 8,9. ככל שעבודה עם protoplasts הענק אלה היא לא שיטה אידיאלית או אפילו מעשית עבור רוב מיני חיידקים שכן היא דורשת גברחיידקי ipulated במצב לא טבעי ואביוטי, המחקרים מוגבלים של קוטביות קרום חיידק שכבר בוצעו היו בעיקר מועסקים cytometry זרימה והשימוש בצבעי ניאון cyanine וoxonol 10-16.
במקום cytometry זרימה, המרכזת את קריאות הקרינה בודדות מחיידק אחד בכל נקודת זמן אחת, בחרנו להשתמש בקורא צלחת גילוי הקרינה כדי לזהות עוצמת הקרינה של השעיות חיידקים בפורמט צלחת 96 היטב לאורך זמן. זה אפשר לנו לטיפול באוכלוסייה של חיידקים בנקודות זמן שונים בפשטות רבה יותר ולהקל, ולפקח באופן רציף קינטיקה הקרינה של האוכלוסייה כולה לפרקי זמן ארוכים, שקשה להשיג באמצעות cytometry זרימה. לאחר בדיקת מגוון רחב של הצבעים הפוטנציאליים רגישים ניאון (כוללים אלה שהוזכרו לעיל לשימוש עם מיטוכונדריה), השגנו ההצלחה הטכנית ומעשית הטובה ביותר באמצעותצבע bis-oxonol נקרא DiBAC 4 (3) (BIS-(oxonol חומצת 1,3-dibutylbarbituric) trimethine) כדי לעקוב אחר שינויים בקוטביות.
מצאנו גם את זה חשוב כדי לפקח במקביל לשיבושים ביושרה של הקרום באמצעות יודיד propidium (PI). צבע זה מאיר על כריכה לחומצות גרעין, אבל הוא רק מסוגל לעשות זאת כאשר על שלמות קרום החיידק נפגעת, מה שהופך את המרכיב הפופולרי המשמש לגילוי תאים מתים במבחנים מכתים חיים מתים. בנוסף לPI, Sytox ירוק וTO-PRO-1 צבעי ניאון שדומים בפעולה וכבר שימשו בעבר לחיידקים בכמה מחקרים באמצעות cytometry זרימת שיטות זיהוי 17. אנחנו בחרנו להשתמש PI עקב גל העירור שלה, שאיפשר לנו לעקוב אחר הקרינה שלה במקביל לDiBAC במדגם נתון.
במחקרים שלנו, יש לנו ציינו כי המלט, כמו גם אחר מורכבת חלבון שומנים בדם הקשורים לפעילות bactericidalהמכונה ELOA, שלילת קוטביות וקרע מושרה של קרום החיידק כפי שצוין על ידי עלייה בקרינה של שני הצבעים על הטיפול בpneumococci 3,18,26. עבור שני מתחמים, הבחין כי עוצמת הקרינה של DiBAC 4 (3) עלתה לפני העלייה בעוצמתו של צרכן, מצביע על כך ששלילת הקוטביות התרחשה לפני הקרע, והוא, אם כן, אירוע ספציפי הנגרם על ידי קומפלקסי חלבוני שומנים בדם bactericidal שלנו ריבית. הבחנה זו חשובה לעשות, כמו קרע של הקרום יכול לגרום לעצמו שלילת קוטביות לא ספציפית. קינטיקה (3) וקרינת PI מדידה וניתוח שני DiBAC 4 אפשרה במקביל לנו לבחון את הקשר הזה בין אירועי קרום שתיים, אשר מהווה יתרון נוסף של שימוש בfluorometry במקום cytometry זרימה.
כדי לעקוב אחר שטף יון חיידקים, יש כבר כמה הצלחה קודמת עם שימוש ברדיואיזוטופים, כולל מדידת ספיגה של45 Ca 2 + בpneumococcus 19,20, שיש לנו גם שימוש במחקרים האחרונים שלנו 18, 21. עם זאת, יש בעבודה עם יונים רדיואקטיביים אלה יש כמה חסרונות. הם יכולים להיות יקרים, גוזלים זמן, ומבולגן, והוא יכול גם לחשוף את פרט ביצוע הניסוי כדי לפגוע, תלוי באיזוטופ של עניין. בנוסף, קשה לעקוב אחר שינויים מהירים לאורך זמן. לפיכך, פנינו לכיוון שיטה חלופית של מדידה שמעסיקה גרסאות אסתר acetoxymethyl (PM) של צבעי ניאון מחוון יון רגיש. על ידי עצמו, צבע המחוון טעון ואינו עובר דרך הממברנה בקלות, אבל עם התוספת של קבוצת אסתר lipophilic, המולקולה כעת בלתי טעונים יכולה לעבור דרך הממברנה של החיידק. עם כניסתו לפנים, esterases החיידקים לדבוק קבוצת אסתר, והשאיר את צבען חופשי בתוך התא והואשם שוב, להאט באופן משמעותי את יכולתה לצאת מהתא ומאפשר לא לצבועo מצטברת בתוך לאורך זמן. עם זאת, שימוש בצבעי אסתר אלה תוארו רק בכמה מיני חיידקים כדי לזהות שינויים בתאיים Ca 2 + 22-24 ו-H +16, עם שיטות שונות של העמסה, איתור, והצלחה.
עם רצון לעקוב אחר שינויים בתאיים Ca 2 + וגם רמות K + ו-H + בס pneumoniae על טיפול עם המלט ותרכובות אחרות, יצרנו בהצלחה פרוטוקולים כדי לטעון צבעי ניאון מחוון ביעילות לתאי חיידקים. טעינה יעילה לחיידקים נדרשים שני פרובנציד שמגביר אצירת צבע על ידי חסימת אניון-מובילים וPowerLoad, מתחם קנייני מחיים טכנולוגיים שמגביר את יעילות טעינה. Fura-2/AM (גילוי Ca 2 +), PBFI / AM (גילוי K +), וBCECF / AM (גילוי + H) הועמסו בהצלחה לתוך st pneumococcal שני unencapsulated והמארזגשמים המאפשרים מדידה של דפוסי הקרינה וכתוצאה מכך לאחר תוספת של יונופורים, כגון ionomycin (Ca 2 + uncoupler), valinomycin (K + uncoupler) וCCCP (H + uncoupler) באמצעות צלחת גילוי הקרינה קורא 18, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תרבויות חיידקים
- גידול התרבות לשימוש בניסויים
- בבלוק חימום 37 מעלות צלזיוס, להפשיר מניות בקבוקון קפוא של ס דלקת ריאות ולהוסיף התוכן שלה ל9 מיליליטר של טרי, prewarmed מרק טוד יואיט עם 0.5% תמצית שמרים (THY) עבור נפח כולל של 10 מיליליטר בצינור תרבות זכוכית.
- דגירה באופן סטטי על 37 מעלות צלזיוס עד התרבות מגיעה שלב אמצע יומן (600nm אבס ≈ 0.5-0.6).
2. איתור ממברנה שלילת קוטביות ושבר
- ריאגנטים הכנה
- הכן מלאי 50 מיקרומטר של DiBAC 4 (3) בDMSO 100%, ומ"ג / מיליליטר מניות 2 של PI בDDH 2 O. DiBAC 4 (3) המניות היא יציבה ב -20 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים. מניית PI היא יציבה על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים.
- לעטוף את המניות בנייר כסף כדי להגן מפני האור.
- טעינהבקטריה
- גלולה תאי חיידקים מהצעד 1.2.2 על ידי צנטריפוגה ב2,400 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ולשטוף פעמיים על ידי הסרת supernatant, resuspending גלולה ב10 מיליליטר של 1x פוספט שנאגר מלוח (PBS), ו צנטריפוגות שוב ב2,400 XG עבור 10 דקות.
- הסר supernatant וגלול resuspend ב PBS לנפח המקורי. זה יספק כ 10 8 יחידות מושבה יוצרים של חיידקים למ"ל. הסר 1 מיליליטר (מספיק ל 5 דגימות) של התאים נשטפו ומקום לתוך צינור microcentrifuge.
- לתאים אלה, להוסיף 25 μl של 1 פתרון M-מעוקר מסנן מניות של גלוקוז (שהוכן DDH 2 O ומסונן באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר) לריכוז סופי של 25 גלוקוז מ"מ, ו דגירה בבלוק חימום 37 מעלות צלזיוס במשך חמישה עשר דקות. הערה: זה מספק אנרגיה לכל ערוצי הקרום תלוי ATP ומרכיבים תאיים. הצורך בשלב זה עשוי להשתנות, בהתאם לניסוי.
- הוסף 5 μl של 50 מיקרומטר DiBAC 4 (3) המניות ו10 μl של מניית 2 מ"ג / מיליליטר לצרכן. זה מספק לריכוזים סופיים של 250 ננומטר ו20 מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה. מערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. הוסף 200 μl של השעיה תא זה לזה גם דוגמא של צלחת 96 היטב ברורה.
- גילוי הקרינה
- צלחת מקום בקורא צלחת גילוי הקרינה (37 מעלות צלזיוס) prewarmed.
- ודא כי מסננים מתאימים נמצאים במקום במשך 4 DiBAC (3) (עירור 490 ננומטר, 516 פליטת ננומטר) וPI (535 עירור ננומטר, 617 פליטת ננומטר) זיהוי.
- כדי לאפשר (ולפקח במקביל) איזון של 4 DiBAC (3) על פני הקרום, להגדיר את הקורא לקחת מדידות הקרינה בכל דקה במשך כ 30-40 דקות, או עד שהקריאה תתייצב; זו משמשת כקריאה "טיפול מקדים".
- הוצא את צלחת ומוסיף את הסוכן הניסיוני של בחירה וimmediately למקם את הצלחת בחזרה בקורא להמשיך ולעקוב אחר DiBAC 4 (3) וקרינה לצרכן לכל האורך הרצוי של זמן. אם טיפול בכמה דגימות בבת אחת, בעזרת פיפטה רבה יכול להיות מועיל כדי להוסיף את הסוכן בו זמנית לכל הבארות.
- לייצא את הקריאה לתכנית ניתוח נתונים, כגון Microsoft Excel. הקרינה עלילה לאורך זמן כדי להעריך את שלילת קוטביות קרום וקרע. הקרינה הולך וגדל של DiBAC וPI מציינת כי שלילת קוטביות וקרע מתרחשים.
3. איתור שינויים תאיים Ca 2 + או + ריכוזי K
- ריאגנטים הכנה וחיץ טעינה
- הכן את ריאגנטים הבאים: 5 מניות מ"מ של צבע יון רגיש ניאון (Fura-2/AM או PBFI / AM, להוסיף את הכמות המתאימה של DMSO לצינור המכיל 50 מיקרוגרם של הצבע), "100x" פרובנציד (להוסיף 1 מיליליטר של PBS לבקבוקון 77 מ"ג). Solubilizedאפשר להקפיא צבעים ב-20 ° C פעם אחת והם יציבים בתמיסה במשך 3 חודשים, ואילו פרובנציד הוא יציב בתמיסה ב -20 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים.
- הכן 1 מיליליטר של 2x טוען הצפת כדלקמן: בחלק התחתון של צינור חרוטי פלסטיק 15 מיליליטר, לוותר 20 μl של 100x להתרכז PowerLoad (יציב ב-C ° 2-8 למשך 6 חודשים), ואחריו 2 μl של יון 5 מ"מ רגיש לצבען ישירות לתוך PowerLoad. בקצרה מערבולת לערבב. הוספת 960 μl של PBS ואחריו 20 μl של 100x פרובנציד. מערבולת את התערובת בפעם אחרונה. עוטף בנייר כסף כדי להגן מפני אור.
- טוען חיידקים עם צבע
- גלולה ולשטוף את תרבות חיידקים בשלב אמצע היומן כפי שמתואר ב2.2.1. הסר supernatant וגלול resuspend ב 5 מיליליטר של PBS כדי להפוך את ההשעיה "2x" תא.
- הוסף 1 מיליליטר של ההשעיה תא 2x לטוען 2x הצפת. זה יספק עבור נפח סופי של 2 מיליליטר, וconcentr הסופיations של 1x PowerLoad, 5 מיקרומטר צבע פלואורסצנטי, ופרובנציד 1x. הערה: השעיה זה מספקת מספיק נפח ל10 דגימות מאז היטב כל דגימה למדידה תכיל 200 μl.
- דגירה באמבט 37 ° C מים ל75 דקות, מוגן מפני אור. הערה: הצבע הוא נטען לתוך תאי חיידקיים בהעדר כל מצעי glycolytic ובנוכחות פרובנציד כדי למזער את הזרימה של הצבע.
- 1 WASH: גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב2,400 XG עבור 10 דקות, להסיר supernatant, resuspend ב 2 מיליליטר PBS המכיל פרובנציד 1x. WASH 2, 3: חזור על השלב 3.2.4 2x. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות נוספות. זה יאפשר זמן לesterases חיידקים לhydrolyze קבוצת אסתר AM מצבעי הניאון הפנימו.
- 4 WASH: גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב2,400 XG עבור 10 דקות, להסיר supernatant, resuspend ב 2 מיליליטר של PBS המכיל פרובנציד 1x. הערה: בהתאם לexperimeNT, גלוקוז ניתן להוסיף לכאן שוב כדי להמריץ מחדש את החיידקים.
- גילוי הקרינה
- Prewarm קורא צלחת צלחת קורא גילוי הקרינה ל37 ° C.
- עבור כל דגימה רצויה, להוסיף 200 μl של התאים עמוסים (מצעד 3.2.8) לבארות של צלחת 96 היטב. (בצע את השלבים הבאים עד להשלמתו ול/ דגימה אחת בכל פעם).
- להקים בסיס קריאה לטוב, צלחת מקום בצלחת קורא גילוי הקרינה כדי למדוד את הקרינה (פליטת ננומטר 340 עירור ננומטר / 510 ל" ערך 1 "ו380 עירור / פליטת ננומטר 510 ננומטר עבור" ערך 2 ") בשעה בכל שניות לדקות אחד.
- הוצא צלחת, להוסיף את טיפול בחירה לטוב, כי (בנפח קטן של כ 5 μl), פיפטה במהירות למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב, ומייד מכניסים לצלחת קורא גילוי הקרינה לקרוא כל שניות לרצויות אורכו של הזמן. (אם בjectors קשורים לקורא הצלחת זמין, אלה יכולים לשמש גם כדי להוסיף בצורה חלקה הטיפול הרצוי, ומבטל את הצורך להפסיק את הקריאה ולהוציא את הצלחת).
- לייצא את הקריאה לתכנית ניתוח נתונים, כגון Microsoft Excel. לחשב את היחס שבין ערכי הקרינה עבור כל נקודת זמן על ידי חלוקת 1 ערך לפי ערך 2, ולהתוות את ערכי יחס על גרף.
4. שינויים בזיהוי תאיים pH
- ריאגנטים הכנה ומאגרי כיול
- הכן את ריאגנטים הבאים: 5 מניות מ"מ של BCECF / AM (. להוסיף את הכמות המתאימה של DMSO לצינור המכיל 50 מיקרוגרם של צבע המניה זו היא יציבה ב-20 מעלות צלזיוס למשך 3 חודשים); 100x פרובנציד (להוסיף 1 מיליליטר של PBS לבקבוקון 77 מ"ג);. הכנת מניית 1 מ"מ של nigericin באתנול (חובה לאזן את רמת חומציות התוך התאית (i-pH) של תאי ה-pH של החיץ סביב המניה זה שלשולחן ב-20 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים);. 0.5 מניית מ"מ של ציאניד 3-chlorophenylhydrazone קרבוניל (CCCP) DMSO (protonophore לנתק את כוח מניע פרוטונים מלאי זה הוא יציב ב -20 מעלות צלזיוס במשך 6 חודשים)
- הכן 10 מיליליטר של מאגרי האשלגן גבוהים הבאים: 135 מ"מ KH 2 PO 4/20 מ"מ NaOH (monobasic) ו110 מ"מ K 2 HPO 4/20 מ"מ NaOH (dibasic). סנן לעקר באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. (ניתן לאחסן מאגרים אלה על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש).
- מערבבים את מאגרי האשלגן גבוהים בפרופורציות הדרושות ליצירת מאגרי אשלגן גבוהים עם לפחות 5-6 ערכי pH הנעים 6.5-8.0.
- הכן 1 מיליליטר של 2x טוען הצפת כדלקמן: בחלק התחתון של צינור חרוטי פלסטיק 15 מיליליטר, לוותר 40 μl של 100x PowerLoad, ואחריו 20 μl של צבע יון רגיש 5 מ"מ ישירות לתוך PowerLoad. בקצרה מערבולת לערבב. הוספת 900 μl של PBS ואחריו 40 μl של 100x פרובנציד. ווארטלשעבר התערובת הפעם אחרונה. עוטף בנייר כסף כדי להגן מפני אור.
- טוען חיידקים עם צבע
- גלולה ולשטוף 8 מיליליטר של תרבית חיידקי שלב אמצע היומן כפי שמתואר ב2.2.1. הסר supernatant, גלולה resuspend ב 2 מיליליטר של PBS כדי להפוך את ההשעיה "4x" תא.
- הוסף 1 מיליליטר של ההשעיה תא 4x לטוען 2x הצפת. זה יספק עבור נפח סופי של 2 מיליליטר, וריכוזים סופיים של תאי 2x, 2x PowerLoad, 50 מיקרומטר צבע פלואורסצנטי, ו2x פרובנציד.
- דגירה באמבט 30 ° C מים ל40 דקות, מוגן מפני אור. הערה: הצבע הוא נטען לתוך תאי חיידקים בטמפרטורה נמוכה יותר של 30 מעלות צלזיוס ובהעדר כל מצעי glycolytic כדי למזער את הזרימה של הצבע.
- 1 WASH: גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב2,400 XG עבור 10 דקות, להסיר supernatant כדי להיפטר מעודפי צבע, וresuspend ב 4 מיליליטר PBS המכיל פרובנציד 2xגלוקוז מ"מ nd 1 (לreenergize החיידקים). WASH 2, 3: חזור על שלב 4.2.7 פעמיים, עם resuspension הסופי ב4 מיליליטר PBS (לריכוז סופי של תאי 1x) המכיל פרובנציד 2x ו10 גלוקוז מ"מ.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. זה יאפשר לתאים כדי להמריץ באופן מלא ולאפשר זמן לesterases חיידקים לדבוק קבוצת אסתר AM מBCECF הפנים.
- הקמת הקרינה רקע ובעקומת כיול vivo
- Prewarm קורא צלחת צלחת קורא גילוי הקרינה ל37 ° C.
- כדי לקבוע הקרינה רקע, מסנן לעקר על 500 μl של השעיה הטעונה ומלאה אנרגיה חיידקים (מצעד 4.2.7) כדי להסיר את החיידקים, ולהוסיף 200 μl של תסנין אל הבאר של צלחת 96 היטב.
- מניחים צלחת בצלחת קורא גילוי הקרינה כדי למדוד את הקרינה (פליטת ננומטר 490 עירור ננומטר / 530 עבור"ערך 1" ו440 פליטת ננומטר עירור / 530 ננומטר עבור "ערך 2") דקות 1. הקרינה רקע זה צריכה להיות מופחת לפני החישוב של היחס לשני עקום הכיול והדוגמות הניסיוניות.
- כדי לקבל עקומת כיול in vivo, לשטוף 500 aliquots μl של התאים הטעונים ומלאים אנרגיה מהצעד 4.2.7 פעם אחת וresuspend במאגרי האשלגן גבוהים בערכים שונים pH (החל 6.5-8.0).
- הוסף 20 nigericin מיקרומטר לדגימות כדי לאזן את רמת חומציות התוך התאית של תאי ה-pH של החיץ שמסביב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הוסף 200 μl שילובי חיץ חיידקים / pH לבארות של צלחת 96 היטב.
- מניחים צלחת בצלחת קורא גילוי הקרינה כדי למדוד את הקרינה לכמה דקות כדי לקבוע קריאה מתמדת לכל אחד. לייצא את הקריאה לתכנית ניתוח נתונים, כגון Microsoft Excel.
- לאחר הפחתת baערכי הקרינה ckground, לחשב את היחס שבין ערכי הקרינה על ידי חלוקת 1 ערך לפי ערך 2. מגרש את ערכי יחס לכל חיץ pH כדי ליצור עקומת הכיול. (עקום כיול צריך להיות שנוצר עבור כל קבוצה חדשה של תאים טעונים, ככמות של צבע ניאון שהוא נטען לתוך החיידקים יכולה להשתנות בכל פעם).
- שינויי מדידה בpH תאיים
- עבור כל דגימה רצויה, להוסיף 200 μl של תאים הטעונים ומלאים אנרגיה (מצעד 4.2.7) לבארות של צלחת 96 היטב.
- מניחים צלחת בצלחת קורא גילוי הקרינה ולמדוד את הקרינה של הדגימות כל 5 שניות למשך 5 דקות.
- להוציא את הצלחת ולהוסיף 10 CCCP מיקרומטר גם אחד (משמש כביקורת החיובית להפחתת ה-pH תאיים) וסוכן הניסוי (ים) של עניין לבארות האחרות. כדי להשוות במדויק את ההשפעות שלהם לאורך זמן, להוסיף את CCCP וסוכנים של בחירה באותו הזמן באמצעות amפיפטה ultichannel.
- מייד להחזיר את הצלחת לצלחת הקורא ולהמשיך מדידת הקרינה כל 5 שניות ל10 דקות. כבקרה נוספת, להוציא את הצלחת ולהוסיף 20 מיקרומטר Nigericin לכל הדגימות לאזן i-pH של החיידקים ה-pH של החיץ שמסביב, ולקרוא למשך 5 דקות.
- לאחר הפחתת ערכי הקרינה רקע, לחשב את היחס בין הקרינה לכל דגימה. לשרבב את i-pH לכל קריאה מעקום הכיול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לכל הניסויים, יש דגימה אחת וקבוצה של תנאים נוכחים בכל טוב. לפיכך, כל עקיבה מייצגת את עוצמת הקרינה של אוכלוסייה שלמה של חיידקים לאורך זמן. התוצאות צריכה להיות לפרש בקלות, עם הבחנה ברורה בין הקרינה של דגימות מטופלים ושל בקרות שלא טופלו. קינטיקה ומידת שינוי שנצפה בקרינה יכולים לספק מידע על המנגנון והמידה האפשריים של האירוע במעקב.
כאשר בוחנים קוטביות קרום, החיידקים צריכים להיות הודגרו עם DiBAC כ -40 דקות, כדי לאפשר איזון של הצבע על פני הקרום, כפי שעולים מהירידה העקבית והפילוס הבא של הקרינה באיור 1A לפני הטיפול. כפי שמודגם באיור 1, PI אינו דורש איזון, כאות הניאון שלה היא יציבה לאורך הדגירה הראשונה 40 דקות, but את נוכחותה יחד עם DiBAC מועיל כדי לפקח קרע קרום במקביל לקוטביות. שלילת קוטביות וקרע של החיידקים מצויינים על ידי עלייה בעוצמת הקרינה של שני הצבעים. סוכנים אחרים מסוגלים שלילת קוטביות וקרע, כגון חומרי ניקוי (deoxycholate נתרן 18), uncouplers, או יונופורים (CCCP), ניתן גם להוסיף כדי להדגים את האירועים הללו שימוש במתודולוגיה זו.
לFura-2/AM, PBFI / AM, וBCECF / AM, היחס בין שני אותות ניאון מחושב, ועלייה או ירידה של יחס זה תואמת את תאיים Ca 2 + (איור 2), K + (איור 3 ), ו-H (איור 4) ריכוזים, בהתאמה +. עם התוספת של ionomycin ionophore סידן, Ca 2 + זורם לתוך התא וגורם להגדלת יחס הקרינה (איור 2). תוספת של valinomycin יש ההשפעה ההפוכה, וגרם K+ לזרום אל מחוץ לתא ולהקטין את הריכוז תאיים, אשר מסומן על ידי ירידה בשיעור הקרינה (איור 3). BCECF מאפשר המדידה של pH תאיים על ידי יצירת הראשונה עקום כיול (איור 4 א) בנוכחות מאגרים השונים של pH הידוע. ירידה בשיעור הקרינה של הצבע מתאים לירידה ב-pH, כפי שניתן לראות להלן תוספת של CCCP protonophores או nigericin, אשר מתמוטט שיפוע הפרוטון (איור 4).
איור 1. ניטור הפרעות הממברנה. ס pneumoniae הודגר עם () DiBAC וPI (ב ') בו זמנית ל40 דקות, כדי לאפשר איזון של DiBAC מעל מ'embrane. בסוף הדגירה זה (חץ), PBS (ללא טיפול) או המלט (שטופל) נוספו והדגימות היו לקרוא במשך שעה נוספת. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. איתור שינויים ברמות סידן תוך תאי. Pneumococci היו עמוס Fura-2/AM וטופל (חץ) עם PBS (ללא טיפול) או ionomycin ionophore סידן (הבקרה חיובית). היחס בין ערכי הקרינה מוצג. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. זיהוי שינויים ברמות אשלגן תאיים. Pneumococci היו עמוס PBFI / AM וטופל (חץ) עם PBS (ללא טיפול) או valinomycin ionophore אשלגן (בקרה חיובית). היחס בין ערכי הקרינה מוצג. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. איתור שינויים ברמות פרוטון תאיים. () עקום סטנדרטי לכיול ה-pH תאיים. (B) Pneumococci הועמסו עם pH צבע BCECF-AM רגיש, והיושטף וresuspended בגלוקוז + PBS. לאחר הקלטת קריאות תחילת המחקר, בחץ הראשון, PBS (שחור), CCCP protonophore (100 מיקרומטר), או המלט (100 מיקרוגרם / מיליליטר או 6 מיקרומטר), נוספו לחיידקים וקרינה נמדדה לאורך זמן. בnigericin החץ השני (20 מיקרומטר) נוספו כדי להפיג את שיפוע הפרוטון הטרנסממברני של כל הדגימות לחלוטין. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות המגבלה שהגודל מציג לשימוש בשיטות אלקטרופיזיולוגיה קלאסיות כדי לזהות שינויים בקוטביות ושלמותו של הקרום והשינויים בריכוזי יונים בתוך חיידקים, שתארנו דרך למדוד את האירועים הללו בס דלקת ריאות באמצעות צבעי ניאון. הפרוטוקולים שלנו הם הראשונים מסוגם תיארו לpneumococcus ואחד הבודדים שתוארו למיני חיידקים באופן כללי. באמצעות קורא צלחת גילוי הקרינה, ניתן למדוד את האירועים הללו בדגימות של חיידקים קטנים, 200 μl נפח, עם הקרינה זוהתה מהאוכלוסייה בודדת של חיידקים לאורך זמן. קינטיקה והשינויים בעוצמת הקרינה יכולים לשמש כדי לקבוע באופן איכותי את מה שקורה קרום קוטביות או יושר, או רמות של Ca 2 +, K +, או H + בחיידקים. כמותית מדבר, יכולים לשמש גם את ערכי עוצמת הקרינה כדי לחשב את מידת depolarization, קרע, ספיגת סידן, בזרימת אשלגן, או שינוי pH שנצפה במדגם אחד בהשוואה למשנו, מתן מידע קריטי על מנגנון של ריבית. בנוסף, הפרוטוקול שלנו צריך להיות שימושי כנקודת התחלה לטעינת צבעי ניאון בבוקר אחרים, ומאפשר למחקר של מגוון רחב של אירועים תאיים אחרים במגוון רחב של מיני חיידקים. יש לנו כבר היה מוצלח ביישום חלק מהפרוטוקולים הללו בStaphylococcus aureus 21.
בעת השימוש בצבעים בבוקר, זמן דגירה מספיק חשוב לטעינת צבע והשגת הידרוליזה הבאה הכרחית לצבע להגיב ליוני היעד בתוך החיידקים ולהניב שינויי הקרינה המתאימות. קינטיקה הטעינה עשויה להשתנות בין זני חיידקים בשל מספר גורמים, כולל הבדלים בארכיטקטורת משטח חיידקים (נוכחות הקפסולה, נזילות הממברנה, נוכחות של משאבות בזרימת, וכו '.) ובo המבנה הכימיו הצבע. כדי להשיג טעינה מקסימלי עבור הזן וצבע של עניין חיידקים, ישנם מספר פרמטרים של הפרוטוקול שלנו שעשויה לדרוש אפנון כולל: משך דגירה, טמפרטורת דגירה, זמינות חומרי מזון, ריכוז PowerLoad, וריכוז פרובנציד. כדי להשיג טעינה מוצלחת, עוצמת אות הקרינה היא פחות חשובה ממראה כי בקרות חיוביות, כגון תוספת של יונופורים, תהווינה איתות בכיוון הנכון ו / או המציג ליניאריות בעקום הכיול. כדי לייעל את טעינת עלייה בPowerLoad וריכוז Probenicide אחרי הורדת הטמפרטורה, כדי למנוע שחול של הצבע עדיף על הגדלת ריכוז צבע שעלול לגרום להכתמה תאית שלבלבל את האות. במהלך הפיתוח של הפרוטוקולים שלנו, היינו יכול לטעון בהצלחה הצבעים של עניין בשני D39 הסוג בר במארז pneumococcal הזן וזן unencapsulated R36A 25 שלנו.עם זאת, מצאנו כי אנו יכולים להשיג טעינה אופטימלית כפי שצוין על ידי קריאות ניאון מובילות ליחסים מוגברים באמצעות R36A לפורע-2 וPBFI ניסויים באמצעות 37 טמפרטורת דגירה מעלות צלזיוס, ואילו טמפרטורת דגירה נמוכה בשילוב עם PowerLoad וריכוזים גבוהים יותר פרובנציד עבדה טוב יותר עבור טעינה של BCECF לD39. למרות שעוצמת אות ספציפית עשויה להשתנות בין ניסויים, טבע ratiometric של המדידות סיפק תוצאות עם שחזור גבוה ופער קטן.
עבור מדידות הקרינה של דגימות, שימוש בתוכנה הנלווית לקוראי צלחת המתקדמים ביותר מאפשר התאמות של מגוון רחב של פרמטרים לזיהוי, כולל מהירות זיהוי, רגישות זיהוי, ולקרוא את משך זמן, עד כמה שם. זה מאפשר לחוקר למצוא את הרגישות האופטימלית לזיהוי של אירוע המסוים כי הוא במעקב. לפרשנות אופטימלית של תוצאות, זה קריטי, כי ערכי בסיס יציבים של פלואורידעקומות escence והסטנדרטיות ליניארי מבוססים, כמו שם יכולות להיות וריאציות בין assay בכמות של צבע שקיימת, מתאזנת על פני הקרום, או נטענות לתוך החיידקים והידרוליזה. מתן אפשרות לזמן לאיזון צבע על קרום החיידק לפני טיפול מכל סוג שהוא חיוני במיוחד בעת השימוש בDiBAC 4 (3), כדי לאפשר לרמת הקרינה התייצבה לפני הטיפול. בנוסף, כולל כל הבקרות נאותות בכל ניתוח פרטי הוא חיוני לניתוח נתונים מדויק, כתוספים הניסיוניים שהם הציגו להשעית החיידקים להיבדק עשויים עצמם autofluoresce באורכי גל המסוים של גילוי או עשוי unspecifically לשנות את הקרינה של מחוון לצבוע דרך אינטראקציות ישירות.
אנו מכירים בכמה אזורים פוטנציאליים של דאגה הקשורים לשיטות שתארנו כאן. בניגוד לצבע carbocyanine DiOC 2 (3), DiBAC 4 (3) הוא צבע bisoxonol שאינו ratiometric, ולכן בזמן שצבע carbocyanine יכול להסביר את שינויים בנפח תא, DiBAC 4 לא (3) יכול. לפיכך, ייתכן שיש שינויים ברמת הקרינה שמתאימות לשינויים בנפח תא. אנחנו, לעומת זאת, לא שמנו לב לזה שיש בעיה משמעותית, כpneumococcus יש דופן תא נוקשה שאינו מאפשר שינויים משמעותיים בנפח ללא פקיעת החיידקים. לבחינת נתיבי יון חיידקים, הרגישות של צבעי יון רגיש יכולה להשתנות בהתאם ליון של עניין ואת מידת השינוי בריכוז שלה. בנוסף, השימוש בצבעי ניאון הוא ניסיוני ולא כשיטה ישירה כמו השימוש ברדיואיזוטופים. עם זאת, בהתאם ליון של עניין, בדיקת הקרינה היא אופציה הרבה יותר מעשית כאשר בוחנים את שני מגבלות כספיות ובטיחותיות מעורבות עם השימוש ברדיואיזוטופים. לפיכך, מתודולוגיות מתוארות בכתב היד הזה מספקים גישה חדשה ועולה בקנה אחדes לקוטביות טובה יותר קרום מחקר, יושרה, ואירועי תחבורה ובמערכות בקטריאלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים להכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס (גרנט 53085), קרן JR Oishei, ואיגוד הריאות האמריקאי (גרנט RG-123,721-N) לAPH, וF31DC011218 מלגת NIH (NIDCD) לEAC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Bacto, BD Diagnostics | 249240 | |
| Yeast Extract | Bacto, BD Diagnostics | 212750 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2) | Invitrogen (GIBCO) | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | DMSO |
| DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) | Molecular Probes | B-438 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Make up in deionized water |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| PowerLoad | Molecular Probes | P10020 | 100x concentrate |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | Make 100x stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial |
| Fura-2/AM | Molecular Probes | F1221 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| PBFI/AM | Molecular Probes | P1267 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | |
| KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | monobasic |
| NaOH | JT Baker | 5565-01 | |
| K2HPO4 | JT Baker | 4012-01 | dibasic |
| BCECF/AM | Molecular Probes | B1170 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| CCCP | Sigma-Aldrich | Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, dissipating the electrical potential and the H+ gradient. | |
| Culture tube | VWR | 53283-802 | Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | Spectronic 20D+ | |
| 15 ml Plastic conical tube | Corning | 430790 | |
| Clear 96-well polystyrene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Plate reader | BioTek | Synergy 2 Multi-Mode | |
| Gen5 software | BioTek | Gen5™ Software |
References
- Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).
- Hakansson, A., et al. A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).
- Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex. PLoS One. 6 (3), (2011).
- Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria. Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (Δψ m) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).
- Dominguez, D. C. Calcium signalling in bacteria. Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).
- Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family. Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).
- Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. A patch-clamp study of Bacillus subtilis. Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).
- Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).
- Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique. Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).
- Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).
- Shapiro, H. M. Membrane potential estimation by flow cytometry. Methods. 21 (3), 271-279 (2000).
- Shapiro, H. M. Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques. J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).
- Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions. Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).
- Suzuki, H., Wang, Z. -Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes. Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).
- Breeuwer, P., Abee, T. Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques. Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).
- Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).
- Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death. J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).
- Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential. J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).
- Trombe, M. C. Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence. J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).
- Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
- Futsaether, C. M., Johnsson, A. Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes. Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).
- Tisa, L. S., Adler, J. Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content. J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).
- Werthen, M., Lundgren, T. Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens. J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).
- Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).
- Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against. PLoS One. . 8, (2013).
