Summary
Unlike die gezien eukaryoten, er een gebrek aan studies die details membraan depolarisatie en ionenconcentratie veranderingen in bacteriën, vooral als hun kleine formaat maakt conventionele meetmethoden moeilijk. Hier hebben we detail protocollen voor toezicht op dergelijke gebeurtenissen in de grote Gram-positieve ziekteverwekker Streptococcus pneumoniae met behulp van fluorescentie technieken.
Abstract
Membraan depolarisatie en ionfluxen zijn gebeurtenissen die uitgebreid bestudeerd in biologische systemen vanwege hun vermogen om diepgaande impact cellulaire functies, waaronder energetica en signaaltransmissie. Hoewel fluorescentie-en elektrofysiologische werkwijzen, inclusief verbruik elektrode en patch-klemming, zijn goed ontwikkeld voor het meten van deze gebeurtenissen in eukaryotische cellen, methode voor het meten soortgelijke gebeurtenissen in microörganismen gebleken moeilijker te ontwikkelen gezien hun kleine grootte in combinatie met complexe buitenoppervlak bacteriën afscherming het membraan. Tijdens onze studies van de dood-initiatie in Streptococcus pneumoniae (pneumokok), wilden we de rol van het membraan gebeurtenissen, waaronder veranderingen in polariteit, integriteit, en intracellulaire ionenconcentraties helderen. Het zoeken van de literatuur, vonden we dat heel weinig studies bestaan. Andere onderzoekers hadden radio-isotoop opname of evenwicht te ion griep meten bewaaktxes en membraanpotentiaal en een beperkt aantal studies, vooral bij Gram-negatieve organismen, had enig succes gezien met behulp carbocyanine of oxonol fluorescente kleurstoffen aan membraanpotentiaal meten, of het laden van bacteriën met cel-permeant acetoxymethyl (AM) ester versies van ion-gevoelige fluorescente indicator kleurstoffen. We daarom vastgesteld en de geoptimaliseerde protocollen voor het meten van membraanpotentiaal, breuk, en ion-transport in de Gram-positieve organisme S. pneumoniae. We ontwikkelden protocollen met de bis-oxonolkleurstof DiBAC 4 (3) en de mobiele impermeant kleurstof propidiumjodide membraan depolarisatie en scheuren te meten, respectievelijk, alsook werkwijzen optimaal laden pneumokokken met de AM esters van de kleurstoffen ratiometrische Fura-2, PBFI en BCECF veranderingen in intracellulaire concentratie van Ca2 +, K + en H +, respectievelijk detecteren, met fluorescentie-detectie plaatlezer. Deze protocollen zijn het eerste in hun soort voor de pneumokoken de meerderheid van deze kleurstoffen niet zijn gebruikt in een andere bacteriële species. Hoewel onze protocollen geoptimaliseerd voor S. pneumoniae, wij geloven dat deze aanpak moet een uitstekend uitgangspunt voor soortgelijke studies in andere bacteriesoorten vormen.
Introduction
Ons laboratorium heeft een eiwit-lipide complex van moedermelk genoemd GEHUCHT (voor humaan alfa-lactalbumine gemaakt dodelijk tumorcellen) die apoptose induceert in tumorcellen geïdentificeerd, maar kan ook een verscheidenheid van bacteriële species 1,2 doden. De soorten die bleken bijzonder gevoelig te zijn die de luchtwegen richten, met Streptococcus pneumoniae (pneumokok de) tonen de grootste gevoeligheid en een apoptose-achtige fenotype dood 2,3. Membraan depolarisatie en specifieke ionentransport gebeurtenissen zijn goed beschreven en cruciale gebeurtenissen gedurende geprogrammeerde celdood in eukaryote cellen, vooral in de mitochondriën, waar radioactieve TPP + ionen en fluorescente kleurstoffen zoals JC-1 en TMRE zijn gebruikt om depolarisatie van de mitochondriale membraan 3 tonen -5. Dus zochten we om meer te leren over het effect van gehucht op deze membraan-gerelateerde functies in de pneumokok als we onze inspanningen gericht opontwikkelen van een beter begrip van de mechanische componenten van de apoptose-achtig fenotype in bacteriën, met grote mogelijkheden voor het identificeren van nieuwe antibacteriële therapie of vaccinkandidaten in het proces.
Bij het streven naar de vaststelling van protocols voor onze mechanistische studies, ontdekten we dat in tegenstelling tot de goed beschreven methodiek in eukaryote systemen, zijn er zeer weinig gepubliceerde studies detaillering elektrofysiologie en ionen transport mechanismen van de bacteriële membraan 6,7. Dit wordt voornamelijk toegeschreven aan de kleinere omvang van micro-organismen en hun oppervlak architectuur, met name de aanwezigheid van celwand, dat beperkt de toegankelijkheid van het membraan voor gebruik van conventionele methoden zoals eukaryotische patchklemmen, hoewel sommige studies met grote protoplasten uitgevoerd met wisselend succes 8,9. Naarmate het werk met deze gigantische protoplasten is niet een ideaal of zelfs praktische methode voor de meeste soorten bacteriën, omdat het de mens nodig heeftipulated bacteriën in een onnatuurlijke en abiotische toestand, de beperkte studies van bacteriële membraan polariteit die zijn uitgevoerd zijn voornamelijk werkzaam flowcytometrie en gebruik van cyanine en oxonol fluorescente kleurstoffen 10-16.
In plaats van flowcytometrie, die individuele fluorescentie metingen verzamelt ve bacterie op een enkel tijdstip, kozen we een fluorescentiedetectie plaatlezer om fluorescentie-intensiteit van bacteriële suspensies detecteren in een 96-putjes tijd. Zo konden we een populatie van bacteriën op verschillende tijdstippen met veel grotere eenvoud en gemak, en continu de fluorescentie kinetiek van de gehele bevolking voor langere tijd, hetgeen moeilijk te bereiken met flowcytometrie. Na het testen van een grote verscheidenheid van potentiële gevoelige fluorescente kleurstoffen (waaronder de genoemde voor gebruik met de mitochondria), bereikten wij de beste technische en praktische succes met debis-oxonolkleurstof DiBAC genoemd 4 (3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethineoxonol) veranderingen in polariteit controleren.
We vonden ook waardevol gelijktijdig verstoringen in de integriteit van het membraan te controleren met propidium jodide (PI). Deze kleurstof fluoresceert bij binding aan nucleïnezuur, maar is alleen in staat om dat te doen als de integriteit van de bacteriële membraan wordt aangetast, waardoor het de populaire component gebruikt om dode cellen te detecteren in levende-dode kleuring assays. Naast PI SYTOX groen en TO-PRO-1 fluorescerende kleurstoffen die qua actie en zijn eerder voor bacteriën in enkele studies met flowcytometrie detectiemethoden 17. We kozen ervoor om PI te gebruiken vanwege de golflengte die ons toeliet om de fluorescentie monitoren gelijktijdig met DiBAC in een bepaald monster.
In onze studies hebben we GEHUCHT, alsmede andere verwante eiwit-lipide complex met bactericide activiteit waargenomenbekend als Eloa, geïnduceerde depolarisatie en breuk van het bacteriële membraan, zoals aangegeven door een toename in de fluorescentie van beide kleurstoffen bij behandeling van pneumokokken 3,18,26. Voor beide complexen waargenomen dat de fluorescentie-intensiteit van DiBAC 4 (3) verhoogd vóór de toename in intensiteit van PI, wat aangeeft dat depolarisatie zich vóór scheuren en is daarom een specifieke gebeurtenis veroorzaakt door onze bactericide eiwit-lipide-complexen van belang. Dit onderscheid is belangrijk te maken, als breuk van het membraan kan zelf leiden tot niet-specifieke depolarisatie. Meten en analyseren van zowel DiBAC 4 (3) en PI fluorescentie kinetiek gelijktijdig konden we de relatie tussen de twee membraanlagen gebeurtenissen, wat een extra voordeel van fluorometrie plaats van doorstroomcytometrie onderzocht.
Om bacteriële ionenflux bewaken, is er een aantal eerdere succes met het gebruik van radio-isotopen, waaronder het meten van de opname van45 Ca 2 + in de pneumokok 19,20, die we ook hebben gebruikt in onze recente studies 18, 21. Het werken met deze radioactieve ionen heeft een aantal nadelen. Ze kunnen duur, tijdrovend en rommelig, en kan ook het individu bloot uitvoeren van het experiment te schaden, afhankelijk van de isotoop van belang. Bovendien is het moeilijk om snelle veranderingen tijdig te signaleren. Zo hebben we gedraaid naar een andere manier van meten die acetoxymethyl (AM) ester versies van ionen-gevoelige fluorescente indicator kleurstoffen werken. Op zichzelf is de indicatorkleurstof opgeladen en niet gemakkelijk door het membraan, maar met de toevoeging van de lipofiele estergroep, kan nu ongeladen moleculen door het membraan van de bacterie. Bij binnenkomst in de inrichting, de bacteriële esterasen splitsen de estergroep, vrij blijft de kleurstof in de cel en opnieuw geladen, zijn vermogen om de cel te verlaten aanzienlijk vertragen en waardoor de kleurstof to ophopen in de tijd. Echter, het gebruik van deze kleurstoffen ester is slechts in enkele bacteriesoorten beschreven veranderingen in intracellulaire Ca 2 + 22-24 en H + 16 sporen met verschillende methoden laden, detectie, en succes.
Met een verlangen om veranderingen in intracellulaire Ca 2 + monitoren en ook K + en H + niveaus in S. pneumoniae na behandeling met HAMLET en andere verbindingen, we succesvol aangemaakt protocollen om efficiënt te laden fluorescerende indicator kleurstoffen in bacteriële cellen. Effectieve laden in bacteriën vereist zowel probenecide dat kleurstofretentie stijgt met anion-transporteurs en PowerLoad, een eigen verbinding van Life Technologies dat laden efficiëntie verhoogt blokkeren. Fura-2/AM (detecteren van Ca 2 +), PBFI / AM (detecteren van K +), en BCECF / AM (detecteren van H +) werden met succes in zowel niet-ingekapselde en ingekapselde pneumokokken st geladenregens waarmee meting van de resulterende fluorescentie patronen na toevoeging van ionoforen zoals ionomycine (Ca2 + ontkoppelaar), valinomycine (K + ontkoppelaar) en CCCP (H + ontkoppelaar) met fluorescentie detectie plaatlezer 18, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiden van bacterieculturen
- Groeiende kweek voor gebruik in proeven
- In een 37 ° C verwarmen blok, ontdooien van een bevroren voorraad-flesje van S. pneumoniae en zijn inhoud aan 9 ml verse, voorverwarmde Todd-Hewitt bouillon met 0,5% gistextract (THY) voor een totaal volume van 10 ml in een glazen kweekbuis.
- Incubeer statisch bij 37 ° C totdat de kweek mid-log fase (Abs ≈ 600 nm 0,5-0,6) bereikt.
2. Detecteren membraandepolarisatie en Rupture
- Voorbereiden van reagentia
- Bereid een 50 uM voorraad van DiBAC 4 (3) in 100% DMSO, en een 2 mg / ml voorraad van PI in DDH 2 O. De DiBAC 4 (3) bestand is stabiel bij -20 ° C gedurende ten minste 6 maanden. De PI stock is stabiel bij 4 ° C gedurende ten minste 6 maanden.
- Wikkel voorraden in folie ter bescherming tegen het licht.
- Het ladenbacterie
- Pellet de bacteriële cellen uit stap 1.2.2 door centrifugeren bij 2400 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en tweemaal spoelen door het verwijderen van het supernatant, resuspenderen de pellet in 10 ml 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), gecentrifugeerd en opnieuw bij 2400 xg gedurende 10 minuten.
- Verwijder de supernatant en resuspendeer pellet in PBS tot het oorspronkelijke volume. Dit zal ongeveer 10 8 kolonievormende eenheden bacteriën per ml. Verwijderen 1 ml (genoeg voor 5 monsters) van de gewassen cellen en plaats in een microcentrifugebuis.
- Om deze cellen, voeg 25 ul van een 1 M-filter gesteriliseerde voorraadoplossing van glucose (bereid in DDH 2 O en gefiltreerd door een 0,45 um filter) voor een uiteindelijke concentratie van 25 mM glucose, en incuberen in een 37 ° C verwarmingsblok vijftien minuten. OPMERKING: Dit levert energie voor alle ATP-afhankelijke membraan kanalen en cellulaire componenten. De noodzaak van deze stap kan variëren afhankelijk van het experiment.
- Voeg 5 ul van de 50 pM DiBAC 4 (3) voorraad en 10 ul van de 2 mg / ml PI voorraad. Dit verschaft een eindconcentratie van 250 nM en 20 ug / ml. Meng goed door en neer te pipetteren meerdere malen. Voeg 200 ul van de celsuspensie aan elk monster putje van een heldere 96-well plaat.
- Detecteren van fluorescentie
- Plaats plaat in een voorverwarmde (37 ° C) fluorescentiedetectie plaat lezer.
- Waarborgen dat de juiste filters zijn in de plaats voor DiBAC 4 (3) (490 nm excitatie, 516 nm emissie) en PI (535 nm excitatie, 617 nm emissie) detectie.
- Om rekening te houden (en gelijktijdig monitoren) verevening van DiBAC 4 (3) over het membraan, stelt de lezer om de fluorescentie metingen elke min voor ongeveer 30-40 minuten, of tot de meting stabiliseert, dit dient als een "voorbehandeling" lezen.
- Uitwerpen bord en voeg de experimentele middel van keuze en IMMEDiately plaatst de plaat terug in de lezer te blijven volgen DiBAC 4 (3) en PI fluorescentie voor de gewenste tijdsduur. Als de behandeling van verschillende monsters tegelijk, met een meerkanaalspipet nuttig kan zijn om de agent tegelijk toe te voegen aan alle putjes.
- De lezingen exporteren naar een data-analyse programma zoals Microsoft Excel. Plot fluorescentie in de tijd om membraandepolarisatie en scheuren te evalueren. Toenemende fluorescentie van DiBAC en PI geeft aan dat depolarisatie en scheuren worden voorkomen.
3. Het detecteren van veranderingen in intracellulaire Ca 2 + of K + concentraties
- Voorbereiden van reagentia en beladingsbuffer
- Bereid de volgende reagentia: 5 mM voorraadoplossing van de ion-gevoelige fluorescente kleurstof (Fura-2/AM of PBFI / AM, voeg de juiste hoeveelheid DMSO een buisje met 50 ug van de kleurstof), "100x" probenecide (voeg 1 ml PBS om een 77 mg injectieflacon). De gesolubiliseerdekleurstoffen kunnen bij -20 ° C na bevriezen en stabiel in oplossing gedurende 3 maanden, terwijl het probenecide stabiel in oplossing bij -20 ° C gedurende 6 maanden.
- Bereid 1 ml 2x laadbuffer als volgt: In de bodem van een 15 ml plastic conische buis, afzien 20 gl 100x PowerLoad concentraat (stabiel bij 2-8 ° C gedurende 6 maanden), gevolgd door 2 pi van het 5 mM ion -gevoelige kleurstof direct in de PowerLoad. Vortex kort te mengen. Voeg 960 ul van PBS gevolgd door 20 ui 100x probenecide. Vortex het mengsel nog een laatste keer. Wikkel in folie ter bescherming tegen licht.
- Het laden van de bacteriën met kleurstof
- Pellet en was de mid-log fase bacteriecultuur zoals beschreven in 2.2.1. Verwijder de supernatant en resuspendeer pellet in 5 ml PBS om een "2x" celsuspensie te maken.
- Voeg 1 ml van de celsuspensie 2x de 2x laadbuffer. Dit voorziet in een eindvolume van 2 ml en definitieve concentraties van 1x PowerLoad, 5 uM fluorescerende kleurstof, en 1x probenecide. LET OP: Deze schorsing biedt voldoende volume voor 10 monsters omdat elk monster goed voor de meting 200 ul zal bevatten.
- Incubeer in een 37 ° C waterbad gedurende 75 min, beschermd tegen licht. OPMERKING: De kleurstof wordt in de bacteriële cellen opgeladen bij afwezigheid van glycolytische substraten en in aanwezigheid van probenecide om efflux van kleurstof minimaliseren.
- WASH 1: Pellet de cellen door centrifugeren bij 2400 xg gedurende 10 minuten, verwijder supernatant en resuspendeer in 2 ml PBS met 1x probenecide. WASH 2, 3: Herhaal stap 3.2.4 2x. Incubeer bij 37 ° C gedurende nog 30 minuten. Hierdoor kan de tijd voor bacteriële esterasen tot de AM ester groep weg van de geïnternaliseerde fluorescerende kleurstoffen hydrolyseren.
- WASH 4: Pellet de cellen door centrifugeren bij 2400 xg gedurende 10 minuten, verwijder supernatant en resuspendeer in 2 ml PBS met 1x probenecide. OPMERKING: Afhankelijk van de experiment, kan glucose hier worden toegevoegd terug om nieuwe energie op de bacteriën.
- Detecteren van fluorescentie
- Voorverwarmen de fluorescentie detectie plaat-lezer plaataflezer tot 37 ° C.
- Voor elk gewenst monster, voeg 200 ul van de beladen cellen (uit stap 3.2.8) aan de putjes van een 96-wells plaat. (Voer de volgende stappen uit om de voltooiing van een goed / monster per keer).
- Om een baseline lezen voor een goed, laat de plaat in de fluorescentie detectie plaat-lezer om de fluorescentie te meten (340 nm excitatie / 510 nm emissie voor "Waarde 1" en 380 nm excitatie / 510 nm emissie voor "Waarde 2") op te stellen elke seconde gedurende een min.
- Eject bord, voeg de behandeling van de keuze om dat goed (in een klein volume van ongeveer 5 pl), snel pipet op en neer een paar keer om te mengen, en onmiddellijk terug te plaatsen in de fluorescentie detectie plaat-lezer om elke seconde te lezen voor de gewenste tijdsduur. (Indien de inprojectoren verbonden met de plaat reader beschikbaar, deze kunnen ook worden gebruikt om naadloos voeg de gewenste behandeling, waardoor de noodzaak om de lees Stopt de plaat).
- De lezingen exporteren naar een data-analyse programma zoals Microsoft Excel. Bereken de verhouding van de fluorescentie waarden voor elk tijdpunt door deling Waarde 1 door Value 2 en plot de verhouding waarden in een grafiek.
4. Het detecteren van veranderingen in intracellulaire pH
- Voorbereiden van reagentia en kalibratie buffers
- Bereid de volgende reagentia: 5 mM voorraad BCECF / AM (. Voeg de juiste hoeveelheid DMSO een buisje met 50 ug van de kleurstof Deze voorraad is stabiel bij -20 ° C gedurende 3 maanden), 100x probenecide (1 ml PBS een 77 mg injectieflacon). 1 mM stock bereiding van nigericine in ethanol (nodig om de intracellulaire pH (pH evenwicht i) van de cellen om de pH van de omringende buffer Deze voorraad is stafel bij -20 ° C gedurende 6 maanden);. 0,5 mM voorraad van Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) in DMSO (protonophore aan het proton drijfkracht ontkoppelen Deze voorraad is stabiel bij -20 ° C gedurende 6 maanden)
- Bereid 10 ml van de volgende hoge kaliumgehalte buffers: 135 mm KH 2 PO 4/20 mM NaOH (eenbasisch) en 110 mm K 2 HPO 4/20 mM NaOH (dibasisch). Filter steriliseren met behulp van een 0,45 pm filter. (Deze buffers kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C tot gebruik).
- Meng de hoge kaliumbuffers met de noodzakelijke verhoudingen hoog kaliumgehalte buffers met ten minste 5-6 pH variërend 6,5-8,0.
- Bereid 1 ml 2x laadbuffer als volgt: In de bodem van een 15 ml plastic conische buis, afzien 40 pl 100x PowerLoad, gevolgd door 20 pi van de 5 mM ion-gevoelige kleurstof direct in de PowerLoad. Vortex kort te mengen. Voeg 900 ul van PBS gevolgd door 40 ui 100x probenecide. Vortex het mengsel nog een laatste keer. Wikkel in folie ter bescherming tegen licht.
- Het laden van de bacteriën met kleurstof
- Pellet en was de 8 ml van de mid-log fase bacteriecultuur zoals beschreven in 2.2.1. Verwijder supernatant, resuspendeer pellet in 2 ml PBS om een "4x" celsuspensie maken.
- Voeg 1 ml van de celsuspensie 4x de 2x laadbuffer. Dit voorziet in een eindvolume van 2 ml en eindconcentraties 2x cellen 2x PowerLoad, 50 uM fluorescerende kleurstof en 2x probenecide.
- Incubeer in een 30 ° C waterbad gedurende 40 min, beschermd tegen licht. OPMERKING: De kleurstof wordt in de bacteriële cellen bij de lagere temperatuur van 30 ° C en bij afwezigheid van glycolytische substraten efflux van kleurstof minimaliseren geladen.
- WASH 1: Pellet de cellen door centrifugeren bij 2400 xg gedurende 10 minuten, verwijder supernatant om zich te ontdoen van overtollige kleurstof, en resuspendeer in 4 ml PBS met 2x probenecide eennd 1 mM glucose (om de bacteriën reenergize). WASH 2, 3: Herhaal stap 4.2.7 tweemaal met uiteindelijke resuspensie in 4 ml PBS (een eindconcentratie van 1x cellen) met 2x probenecid en 10 mM glucose.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Hierdoor kunnen de cellen volledig energie en voldoende tijd voor bacteriële esterasen tot de AM ester groep weg van de geïnternaliseerde BCECF klieven.
- Vaststelling achtergrond fluorescentie en in vivo kalibratiecurve
- Voorverwarmen de fluorescentie detectie plaat-lezer plaataflezer tot 37 ° C.
- Om achtergrondfluorescentie bepalen, filter-steriliseer ongeveer 500 pl van het geladen en geactiveerd bacteriesuspensie (uit stap 4.2.7) om de bacteriën te verwijderen en voeg 200 ul van filtraat naar de put van de 96-well plaat.
- Plaats plaat in de fluorescentie detectie plaat-lezer om de fluorescentie te meten (490 nm excitatie / 530 nm emissie voor"Waarde 1" en 440 nm excitatie / 530 nm emissie voor "Waarde 2") gedurende 1 minuut. Deze achtergrond fluorescentie moet worden afgetrokken voordat de berekening van de ratio's voor zowel de ijklijn, en de experimentele monsters.
- Om een in-vivo ijkcurve te bepalen, wassen 500 pi fracties van de geladen en energiek cellen uit stap 4.2.7 eens en resuspendeer in hoog kaliumgehalte buffers bij verschillende pH-waarden (variërend 6,5-8,0).
- Voeg 20 uM nigericine de monsters aan de intracellulaire pH van de cellen equilibreren om de pH van de omringende buffer en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Voeg 200 ul van bacteriën / pH buffercombinaties op de putjes van een 96-wells plaat.
- Plaats plaat in de fluorescentie detectie plaat-lezer om de fluorescentie voor een paar minuten te meten aan een gestage leesvoer voor iedere goed vast te stellen. De lezingen exporteren naar een data-analyse programma zoals Microsoft Excel.
- Na aftrek van de background fluorescentie waarden, het berekenen van de verhouding van de fluorescentie waarden door te delen Waarde 1 bij Waarde 2. Teken de verhouding waarden voor elke pH-buffer om de kalibratiecurve samen te creëren. (Een ijkcurve worden gegenereerd voor elke nieuwe partij geladen cellen, de hoeveelheid fluorescerende kleurstof die in de bacteriën wordt geladen elke keer kan variëren).
- Meten van veranderingen in intracellulaire pH
- Voor elk gewenst monster, voeg 200 ul van de geladen en geactiveerde cellen (uit stap 4.2.7) aan de putjes van een 96-wells plaat.
- Plaats de plaat in fluorescentiedetectie plaat lezer en meet de fluorescentie van de monsters iedere 5 seconden gedurende 5 minuten.
- Verwijder de plaat en voeg 10 uM CCCP om een putje (dient als positieve controle voor het verminderen van intracellulaire pH) en de experimentele agent (s) van belang de andere putjes. Hun effecten nauwkeurig te vergelijken in de tijd, voeg de CCCP en agenten van de keuze op hetzelfde moment met behulp amultichannel pipet.
- Onmiddellijk terug de plaat aan de plaat-lezer en blijven meten fluorescentie elke 5 sec gedurende 10 minuten. Als extra controle uitwerpen de plaat en voeg 20 uM nigericine alle monsters de pH i van de bacteriën evenwicht om de pH van de omringende buffer en lees gedurende 5 minuten.
- Na aftrekken van de achtergrond fluorescentie waarden berekent de verhouding van fluorescentie van elk monster. Interpoleren de pH i voor elke lezing van de ijkcurve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor alle experimenten, er is een monster en stel aanwezig in elk putje omstandigheden. Dus elke tracing vertegenwoordigt de fluorescentie intensiteit van een volledige populatie van bacteriën in de tijd. De resultaten moeten gemakkelijk interpreteerbaar zijn, met een duidelijk onderscheid tussen de fluorescentie van de behandelde monsters en de onbehandelde controles. De kinetiek en intensiteit van een waargenomen verandering in fluorescentie kan informaties mogelijk mechanisme en omvang van de gebeurtenis wordt gecontroleerd verschaffen.
Bij het verkennen membraan polariteit, moeten de bacteriën worden geïncubeerd met DiBAC gedurende ongeveer 40 minuten om voor evenwichtsinstelling van de kleurstof over het membraan, zoals aangegeven door de gestage afname en daaropvolgende nivellering van fluorescentie in figuur 1A voor de behandeling. Zoals aangetoond in Figuur 1B, is PI niet equilibratie nodig, als fluorescentiesignaal is stabiel gedurende de eerste 40 min incubatie, BUt zijn aanwezigheid, samen met DiBAC is nuttig om te controleren membraan breuk gelijktijdig met polariteit. Depolarisatie en breuk van de bacteriën wordt aangegeven door een toename in fluorescentie-intensiteit van beide kleurstoffen. Andere middelen die in staat depolarisatie en scheuren, zoals detergenten (natriumdeoxycholaat 18), ontkoppelaars of ionoforen (CCCP), worden ook toegevoegd aan deze gebeurtenissen aangetoond met behulp van deze methode.
Voor Fura-2/AM, PBFI / AM en BCECF / AM, is de verhouding tussen twee fluorescente signalen berekend en een verhoging of verlaging van deze verhouding komt overeen met de intracellulaire Ca 2 + (figuur 2), K + (Figuur 3 ) en H + (figuur 4) concentraties, respectievelijk. Na toevoeging van calcium ionofoor ionomycine, Ca 2 + stroomt in de cel veroorzaakt een toename van de fluorescentie verhouding (Figuur 2). Toevoeging van valinomycine heeft het tegenovergestelde effect, waardoor K+ Stromen uit de cel en de intracellulaire concentratie die wordt aangegeven door een afname in de fluorescentie verhouding (Figuur 3) verminderen. BCECF maakt de meting van intracellulaire pH door eerst een kalibratiecurve (Fig. 4A) in aanwezigheid van verschillende buffers bekende pH. Een afname in de fluorescentie verhouding van de kleurstof overeenkomt met een afname van de pH, zoals waargenomen na toevoeging van het protonophores CCCP of nigericine, waarvan de proton gradiënt (figuur 4B) instort.
Figuur 1. Monitoring membraan verstoringen. S. pneumoniae werd geïncubeerd met (A) DiBAC en (B) PI gelijktijdig 40 minuten om voor equilibratie van DiBAC via membrane. Aan het einde van deze incubatie (pijl), PBS (onbehandeld) of Hamlet (behandelde) werd toegevoegd en de monsters werden gelezen voor een extra uur. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Het detecteren van veranderingen in intracellulaire calciumconcentraties. Pneumokokken geladen met Fura-2/AM en behandeld (pijl) met PBS (onbehandeld) of de calciumionofoor ionomycine (positieve controle). De verhouding van fluorescentie waarden wordt gepresenteerd. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Detecteren van veranderingen in intracellulaire kaliumgehalte. Pneumokokken werden geladen met PBFI / AM en behandeld (pijl) met PBS (onbehandeld) of het kalium ionofoor valinomycine (positieve controle). De verhouding van fluorescentie waarden wordt gepresenteerd. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 4. Het detecteren van veranderingen in intracellulaire proton niveaus. (A) standaard curve voor intracellulaire pH-kalibratie. (B) Pneumokokken werden geladen met de pH-gevoelige kleurstof BCECF-AM, en warengewassen en geresuspendeerd in PBS + glucose. Na het opnemen basislijn metingen, bij de eerste pijl PBS (zwart), de protonophore CCCP (100 uM) of GEHUCHT (100 ug / ml of 6 uM) werd toegevoegd aan de bacteriën en fluorescentie werd gemeten in de tijd. Bij de tweede pijl nigericine (20 uM) werd toegevoegd aan volledig wegnemen van de transmembraan proton gradiënt van alle monsters. Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks de beperking dat formaat weer voor elektrofysiologie behulp van klassieke methoden om veranderingen in de polariteit en integriteit van het membraan en veranderingen in ion concentraties in bacteriën te detecteren, hebben we een manier om deze gebeurtenissen S. meten beschreven pneumoniae met fluorescerende kleurstoffen. De protocollen zijn de eerste in hun soort beschreven voor de pneumococcus en een van de weinige beschreven bacteriële soorten in het algemeen. Met behulp van een fluorescentie-detectie plaat lezer, kunnen deze gebeurtenissen worden gemeten in kleine, 200 ul volume monsters van bacteriën, met fluorescentie gedetecteerd van de afzonderlijke populatie van bacteriën in de tijd. De kinetiek en veranderingen in fluorescentie-intensiteit kan worden gebruikt om kwalitatief bepalen wat er met polariteit of membraan integriteit, of niveaus van Ca2 +, K + of H + binnen de bacteriën. Kwantitatief gesproken kan de fluorescentie-intensiteit waarden worden gebruikt om de mate van dep berekenenolarization, breuk, calciumopname, kalium efflux, of pH-verandering waargenomen in een monster vergeleken met een ander, het verstrekken van essentiële informatie over een mechanisme van belang. Bovendien moeten ons protocol bruikbaar als uitgangspunt voor het laden van andere AM fluorescente kleurstoffen zijn, waardoor de studie van een verscheidenheid van andere cellulaire gebeurtenissen in verschillende bacteriesoorten. We hebben reeds succesvol toepassing sommige protocollen Staphylococcus aureus 21.
Wanneer de AM kleurstoffen, voldoende incubatietijd is belangrijk voor pigment laden en bereiken de daaropvolgende hydrolyse voor de kleurstof reageert op doelionen in de bacteriën geven de overeenkomstige fluorescentieveranderingen. Het laden kinetiek kan variëren bacteriestammen door verschillende factoren, waaronder verschillen in bacteriële oppervlak architectuur (aanwezigheid capsule, membraan vloeibaarheid aanwezigheid van efflux pompen, enz..) En de chemische structuur of de kleurstof. Om maximale lading van de bacteriestam en kleurstof plaats bereiken, zijn er verschillende parameters van onze protocol modulatie inclusief vereisen: incubatieduur, incubatietemperatuur, nutriëntenbeschikbaarheid, PowerLoad concentratie en probenecide concentratie. Om succesvol te laden verkrijgen fluorescentiesignaal intensiteit minder belangrijk dan blijkt dat positieve controles, zoals toevoeging van ionoforen, geven een signaal in de juiste richting en / of het tonen lineariteit in de kalibratiecurve. Om optimaal laden van een toename PowerLoad en Probenicide concentratie gevolgd door een verlaging van de temperatuur extrusie van de kleurstof te voorkomen voorkeur toenemende kleurstof concentratie die kan leiden extracellulaire kleuring die het signaal verwarren. Tijdens de ontwikkeling van onze protocollen, waren we in staat om onze kleurstoffen van belang in zowel het wild type ingekapselde pneumokokken stam D39 en de ingekapselde stam R36A 25 succesvol te laden.Echter, we vonden dat we optimale belading kunnen bereiken zoals aangegeven door fluorescentie metingen leiden tot verhoogde verhoudingen gebruikt R36A voor Fura-2 en PBFI experimenten met 37 ° C incubatietemperatuur, terwijl een lagere incubatietemperatuur combinatie met hogere PowerLoad en probenecide concentraties werkten beter laden van BCECF in D39. Hoewel er geen specifieke intensiteit van het signaal kan variëren tussen de experimenten, de ratiometric aard van de verstrekte metingen resultaten met een hoge reproduceerbaarheid en weinig spreiding.
Voor fluorescentiemetingen monsters, gebruik van de software die bij geavanceerde plaatlezers maakt aanpassing van verschillende detectie parameters, waaronder detectie snelheid, detectiegevoeligheid en lees duur te noemen. Hierdoor kan de onderzoeker de optimale gevoeligheid voor de detectie van de specifieke gebeurtenis die wordt bewaakt voorbeeld. Voor een optimale interpretatie van de resultaten, is het essentieel dat stabiele basislijnen van fluorEscence en lineaire standaard curves worden vastgesteld, aangezien inter-assay variaties in de hoeveelheid kleurstof die aanwezig is, in evenwicht gebracht via membraan of geladen in de bacteriën en gehydrolyseerd. Het toestaan van tijd voor kleurstof verevening over de bacteriële membraan voorafgaand aan de behandeling van welke aard is vooral van cruciaal belang bij het gebruik van DiBAC 4 (3) te zorgen voor een gestabiliseerde fluorescentie niveau van voor de behandeling. Bovendien, inclusief alle van de echte controle aan elke individuele onderzoek is essentieel voor nauwkeurige analyse, de experimentele additieven die worden ingevoerd in de bacteriële suspensie te testen kunnen zelf autofluoresce op specifieke golflengten van detectie en kan de fluorescentie van de aspecifiek wijzigen indicatorkleurstof door directe interacties.
We herkennen een paar mogelijke gebieden van zorg in verband met de methoden die we hier hebben beschreven. In tegenstelling tot de carbocyanine kleurstof DIOC 2 (3), DiBAC 4 (3) is een bisoxonol kleurstof die is niet ratiometrisch, dus terwijl de carbocyanine kleurstof kan goed zijn voor veranderingen in cel volume, DiBAC 4 (3) kan niet. Aldus kunnen er veranderingen in het niveau van fluorescentie die overeenkomen met veranderingen in celvolume. Wij echter niet opmerken dat dit een belangrijk probleem zijn, aangezien de pneumococcus een stijve celwand die significante veranderingen in volume niet toelaat zonder scheuren van bacteriën. Voor de behandeling van bacteriële ionfluxen, kan de gevoeligheid van de ion-gevoelige kleurstoffen afhankelijk van de ionen van belang en de mate van verandering in de concentratie. Bovendien kan het gebruik van fluorescerende kleurstoffen is experimenteel geen directe methode het gebruik van radio-isotopen. Afhankelijk van het ion van belang, behandeling fluorescentie is een veel praktische optie bij het overwegen financiële en veiligheidsgerelateerde beperkingen betrokken bij het gebruik van radioactieve isotopen. Zo is de in dit manuscript beschreven methoden bieden nieuwe en consistente aanpakes beter onderzoek membraan polariteit, integriteit en transport evenementen en bacteriële systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Bill en Melinda Gates Foundation (Grant 53.085), de JR Oishei Foundation en de American Lung Association (Grant RG-123721-N) te APH en NIH (NIDCD) fellowship F31DC011218 naar EAC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Bacto, BD Diagnostics | 249240 | |
| Yeast Extract | Bacto, BD Diagnostics | 212750 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2) | Invitrogen (GIBCO) | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | DMSO |
| DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) | Molecular Probes | B-438 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Make up in deionized water |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| PowerLoad | Molecular Probes | P10020 | 100x concentrate |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | Make 100x stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial |
| Fura-2/AM | Molecular Probes | F1221 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| PBFI/AM | Molecular Probes | P1267 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | |
| KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | monobasic |
| NaOH | JT Baker | 5565-01 | |
| K2HPO4 | JT Baker | 4012-01 | dibasic |
| BCECF/AM | Molecular Probes | B1170 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| CCCP | Sigma-Aldrich | Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, dissipating the electrical potential and the H+ gradient. | |
| Culture tube | VWR | 53283-802 | Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | Spectronic 20D+ | |
| 15 ml Plastic conical tube | Corning | 430790 | |
| Clear 96-well polystyrene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Plate reader | BioTek | Synergy 2 Multi-Mode | |
| Gen5 software | BioTek | Gen5™ Software |
References
- Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).
- Hakansson, A., et al. A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).
- Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex. PLoS One. 6 (3), (2011).
- Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria. Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (Δψ m) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).
- Dominguez, D. C. Calcium signalling in bacteria. Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).
- Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family. Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).
- Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. A patch-clamp study of Bacillus subtilis. Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).
- Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).
- Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique. Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).
- Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).
- Shapiro, H. M. Membrane potential estimation by flow cytometry. Methods. 21 (3), 271-279 (2000).
- Shapiro, H. M. Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques. J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).
- Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions. Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).
- Suzuki, H., Wang, Z. -Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes. Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).
- Breeuwer, P., Abee, T. Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques. Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).
- Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).
- Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death. J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).
- Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential. J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).
- Trombe, M. C. Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence. J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).
- Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
- Futsaether, C. M., Johnsson, A. Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes. Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).
- Tisa, L. S., Adler, J. Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content. J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).
- Werthen, M., Lundgren, T. Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens. J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).
- Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).
- Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against. PLoS One. . 8, (2013).
